安義均,趙雄,張文英,范松,吳雪林,余立丹

(昭通市第一人民醫(yī)院/昆明醫(yī)科大學(xué)附屬昭通醫(yī)院血管腫瘤科,云南 昭通 657000)

肺癌是目前最常見(jiàn)的惡性腫瘤[1],肺腺癌占到了肺癌整體的40%左右[2]。近年來(lái)肺癌相關(guān)分子機(jī)制的研究取得了較大突破,肺癌患者預(yù)后得到了一定改善,但仍然有很多的基因及其功能未被完全了解,而尋找肺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能涉及的相關(guān)基因及機(jī)制對(duì)于了解肺癌發(fā)病機(jī)制、發(fā)現(xiàn)潛在的治療靶點(diǎn)及預(yù)后預(yù)測(cè)均具有重要的臨床意義。

Holliday交叉識(shí)別蛋白(Holliday Junction Recognition Protein,HJURP)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種參與著絲粒組成的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白。以往的研究結(jié)果顯示HJURP在肝癌、口腔癌、膀胱癌、乳腺癌等腫瘤中高表達(dá)[3-6],同時(shí)有研究證明HJURP高表達(dá)膽管癌、結(jié)直腸癌患者臨床預(yù)后更差[7,8],HJURP可能參與這些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。但目前HJURP在肺腺癌方面的研究較少,本研究擬通過(guò)對(duì)癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)中肺腺癌數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,以了解肺腺癌患者HJURP的表達(dá)情況與預(yù)后關(guān)系及HJURP在肺腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中潛在的涉及通路,為尋找肺腺癌潛在治療靶點(diǎn)及預(yù)后預(yù)測(cè)提供一定的理論依據(jù),現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載與處理

在TCGA官網(wǎng)(https://portal.gdc.cancer.gov/)下載肺腺癌患者腫瘤及癌旁樣本的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)文件及臨床數(shù)據(jù)文件,下載時(shí)間為2019-06-18,其中肺腺癌樣本共535例、癌旁樣本59例,利用perl語(yǔ)言(perl 5.30.0)和Excel軟件(office 2016)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及篩選,排除臨床數(shù)據(jù)不完整的病例。

1.2 KEGG富集分析與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

利用基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)軟件(GSEA 3.0)進(jìn)行京都基因和基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析,隨機(jī)組合次數(shù)設(shè)置為1000次。利用STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)對(duì)HJURP進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析,最小交互次數(shù)設(shè)為0.99。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用R軟件(R3.6.0)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,根據(jù)HJURP表達(dá)量與中位值的關(guān)系區(qū)分高表達(dá)和低表達(dá)組。采用KS(Kolmogorov-Smirnov,KS)檢驗(yàn)或Wilcox檢驗(yàn)進(jìn)行臨床病理特征與基因HJURP表達(dá)差異分析,采用Kaplan-Meier模型對(duì)患者預(yù)后進(jìn)行生存分析,單因素及多因素分析采用比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型(COX回歸模型)進(jìn)行分析。設(shè)P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HJURP在腫瘤組織和癌旁樣本中的表達(dá)和配對(duì)分析結(jié)果

HJURP在肺腺癌組織中較癌旁組織表達(dá)增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 HJURP在腫瘤和癌旁組織中的表達(dá)差異結(jié)果

圖2 HJURP在腫瘤和癌旁組織中表達(dá)的配對(duì)結(jié)果

2.2 HJURP表達(dá)與患者預(yù)后關(guān)系

HJURP高表達(dá)組患者生存預(yù)后較低表達(dá)組更差,兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)圖3。

圖3 HJURP表達(dá)與患者的生存關(guān)系圖

2.3 HJURP表達(dá)與肺腺癌患者臨床病理相關(guān)性分析結(jié)果

HJURP的表達(dá)水平與年齡(≥65歲VS.<65歲)、性別、吸煙程度(1 VS.2、3、4、5)、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N0 VS.N1、2、3)以及分期(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)等臨床病理因素具有顯著相關(guān)性,見(jiàn)圖4。

圖4 HJURP表達(dá)水平與肺腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性結(jié)果

2.4 患者預(yù)后因素的單因素及多因素分析結(jié)果

單因素及多因素分析結(jié)果均顯示HJURP可作為肺腺癌患者獨(dú)立預(yù)后因子影響患者預(yù)后(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 肺腺癌患者預(yù)后影響因素分析結(jié)果

2.5 基因富集分析結(jié)果

GSEA富集分析結(jié)果顯示與HJURP正相關(guān)的KEGG通路主要包括細(xì)胞周期、基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子、泛素化介導(dǎo)的蛋白降解、P53信號(hào)通路、錯(cuò)配修復(fù)等,見(jiàn)圖5。

圖5 HJURP的GSEA富集分析KEGG相關(guān)通路圖

2.6 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示與HJURP蛋白直接或間接相互作用的蛋白包括:著絲粒蛋白A(centromere protein A,CENPA)、MIS18結(jié)合蛋白1(Mis18-binding protein 1,MIS18BP1)、OPA結(jié)合蛋白5(Opa-interacting protein 5,OIP5)等,見(jiàn)圖6。

圖6 HJURP蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析圖

3 討論

既往的研究表明HJURP在多種腫瘤組織中明顯高表達(dá),且HJURP高表達(dá)患者預(yù)后多較差。本研究中發(fā)現(xiàn)在肺腺癌中HJURP較癌旁正常組織明顯高表達(dá),表達(dá)水平與患者年齡、性別、吸煙程度、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及分期等具有相關(guān)性,同時(shí)HJURP高表達(dá)患者的生存預(yù)后更差,HJURP可作為肺腺癌患者的預(yù)后預(yù)測(cè)因子。

HJURP基因的表達(dá)水平與預(yù)后的相關(guān)性在多種腫瘤的研究中被證實(shí),Hu等[9]人分析164例肝細(xì)胞肝癌患者HJURP基因表達(dá)情況與臨床預(yù)后關(guān)系,其單因素分析結(jié)果顯示HJURP高表達(dá)與患者總生存、腫瘤數(shù)目、分化程度、TNM分期及BCLC分期等均具有相關(guān)性,多因素分析顯示HJURP可作為肝癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素預(yù)測(cè)患者臨床預(yù)后。同樣Li等[10]人發(fā)現(xiàn)在晚期漿液性卵巢癌中HJURP高表達(dá)患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率更高、預(yù)后更差。而Hu等[11]人的研究結(jié)果則表明HJURP的表達(dá)水平不僅能預(yù)測(cè)乳腺癌患者的預(yù)后,同時(shí)還能預(yù)測(cè)患者對(duì)放療的敏感性。

本研究中HJURP在肺腺癌組織中較癌旁正常組織明顯高表達(dá),而生存分析結(jié)果顯示HJURP高表達(dá)組肺腺癌患者生存預(yù)后明顯差于低表達(dá)組,同時(shí)HJURP的表達(dá)水平與患者是否發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分期等具有相關(guān)性,發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者及分期越晚的患者HJURP表達(dá)水平越高,表明HJURP基因可能參與肺腺癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移。Wei等[12]人研究發(fā)現(xiàn),敲除非小細(xì)胞肺癌HJURP基因后能夠明顯抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路,從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移,表明HJURP可能是通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路加速肺腺癌腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移。另外Chen等[13]人在肝癌的研究中發(fā)現(xiàn)HJURP在肝癌細(xì)胞中通過(guò)上調(diào)SPHK1介導(dǎo)腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移,而在以往的研究中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是肺腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移及發(fā)生耐藥的重要因素[14],但HJURP是否通過(guò)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化參與肺腺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移目前尚不清楚。

本研究中GSEA富集分析結(jié)果顯示與HJURP表達(dá)正相關(guān)的通路包括細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子、P53信號(hào)通路等,而細(xì)胞周期調(diào)控異常是腫瘤發(fā)生、發(fā)展等重要因素。HJURP蛋白作為組蛋白伴侶結(jié)合蛋白,在G1期早期通過(guò)與組蛋白H3的異構(gòu)體cenH3(CENP-A)結(jié)合進(jìn)而募集更多的CENP-3沉積于著絲粒,完成著絲粒的組裝并保證其穩(wěn)定性,HJURP蛋白作為參與著絲粒組裝的重要組成結(jié)構(gòu),對(duì)細(xì)胞的正常有絲分裂及細(xì)胞周期的調(diào)控具有重要意義[15-17]。同樣P53信號(hào)通路異常是重要的腫瘤相關(guān)通路,Heo等[18]人發(fā)現(xiàn)在人成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中HJURP通過(guò)P53依賴途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老,當(dāng)P53敲除后,HJURP減少導(dǎo)致的衰老表型消失。而P53信號(hào)通路同樣可能是HJURP調(diào)節(jié)肺腺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的重要相關(guān)信號(hào)通路。泛素化介導(dǎo)的蛋白降解是機(jī)體為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種重要蛋白降解形式,如果泛素蛋白酶系統(tǒng)失調(diào)時(shí),內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定可能被打破,進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、發(fā)展。另外基因錯(cuò)配修復(fù)同樣對(duì)于維持基因組的穩(wěn)定性具有重要意義,當(dāng)基因錯(cuò)配修復(fù)缺陷時(shí)則無(wú)法修復(fù)錯(cuò)配基因,進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。所以HJURP的功能可能不僅僅是通過(guò)參與著絲粒組成進(jìn)而保證有絲分裂正常進(jìn)行,同時(shí)通過(guò)其他相關(guān)途徑參與體內(nèi)蛋白酶降解、基因錯(cuò)配修復(fù)等,當(dāng)HJURP表達(dá)異常時(shí)亦可能導(dǎo)致以上功能異常。

綜上所述,HJURP在肺腺癌中明顯高表達(dá)且其表達(dá)水平與患者預(yù)后具有相關(guān)性,可作為肺腺癌患者的預(yù)后預(yù)測(cè)因子及潛在的治療靶點(diǎn)。