劉洪霞，劉穎穎，陳紅平，柴云峰

草甘膦脅迫對茶樹葉片中莽草酸含量的影響

劉洪霞1,2，劉穎穎1,2，陳紅平1,3*，柴云峰1,3*

1. 中國農業(yè)科學院茶葉研究所，浙江 杭州 310008； 2. 中國農業(yè)科學院研究生院，北京 100081；3. 農業(yè)農村部茶葉產品質量安全風險評估實驗室（杭州），浙江 杭州 310008

為探明草甘膦脅迫對茶樹生長及莽草酸代謝的影響，通過水培試驗考察草甘膦對茶苗的表觀藥害，采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜對葉片中的非揮發(fā)性代謝物進行非靶向分析，并對葉片中的莽草酸和草甘膦進行定量測定。結果表明，高劑量草甘膦（200?mg·L-1）處理組茶苗出現藥害特征，而低劑量草甘膦（50?mg·L-1）處理組和對照組茶苗未出現表觀藥害。質譜檢測和統(tǒng)計學分析表明，發(fā)生藥害的茶樹葉片中莽草酸途徑代謝物的含量發(fā)生顯著變化，其中莽草酸是主要的差異代謝物之一。在試驗期內（0～21?d），茶樹葉片中莽草酸的積累量與草甘膦的吸收量和作用時間高度正相關，當草甘膦吸收量達到28?mg·kg-1以上時，茶樹的莽草酸代謝受到明顯抑制，導致葉片中莽草酸大量積累，與對照組相比，發(fā)生藥害的茶樹葉片中莽草酸的含量約高16倍。本研究表明莽草酸是茶樹響應草甘膦脅迫的主要代謝物之一。

茶樹；草甘膦；莽草酸；藥害；液質聯(lián)用

我國茶園面積和茶葉產量均居世界首位，許多優(yōu)質茶園處于山地或丘陵，不利于機械化作業(yè)，人工除草雖然綠色環(huán)保，但成本高且效率低，化學除草劑成為高山茶園除草的重要手段。草甘膦（Glyphosate）是目前世界上使用最廣泛的除草劑[1]，因其價格低廉、殺草譜廣、除草效果好等特點，也常被用于茶園除草。研究表明，草甘膦急性毒性較低，但是經過植物富集再經食物鏈被人類長期食用會對人體健康造成潛在威脅[2]。農業(yè)生產中長期使用草甘膦會破壞土壤微生態(tài)[3]，而且土壤中殘留的草甘膦會隨地表徑流進入地表水，對水生態(tài)環(huán)境造成影響[4]。此外，在殺滅雜草的同時，土壤中的草甘膦可以被作物根系吸收富集于葉片[5]。研究表明，草甘膦會影響植物碳循環(huán)及光合作用[6-7]，對植物生長造成影響，導致玉米[8]、燕麥、蠶豆[9]等作物減產，小麥[10-11]在施用草甘膦后體內莽草酸水平出現明顯上升，芳香族氨基酸含量出現明顯波動。

茶樹是草甘膦的非靶標植物，茶園正常使用草甘膦不易使茶樹產生藥害[5,12]。但是，Tong等[13]通過水培試驗發(fā)現，高濃度的草甘膦會造成茶樹死亡。草甘膦對茶樹代謝影響的研究較少，郭永春等[14]發(fā)現草甘膦可顯著改變茶樹葉片中游離氨基酸、兒茶素和生物堿類化合物的含量，近期他們又利用加權基因共表達網絡（WGCNA）方法鑒定得到2個與草甘膦響應高度相關的關鍵基因模塊以及茶樹抵御草甘膦逆境過程中6個關鍵調控基因，發(fā)現草甘膦能夠干擾茶樹葉片中的莽草酸代謝[15]。

草甘膦是一種內吸傳導型廣譜滅生除草劑，其作用機制是通過競爭性抑制植物莽草酸代謝途徑中的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPs）的活性，使植物無法正常合成生長所必需的芳香族氨基酸，從而導致植物死亡。莽草酸作為草甘膦抑制莽草酸代謝途徑的積累產物，其含量能夠很好地反映植物對草甘膦的敏感性或草甘膦對植物的毒性[16-17]。不同濃度草甘膦脅迫下茶葉中莽草酸的變化規(guī)律未見報道。本研究通過觀測施用不同濃度草甘膦后水培茶苗的表觀藥害，并對茶樹葉片中的非揮發(fā)性代謝物進行分析和差異比較，探討莽草酸是否是茶樹葉片中受草甘膦影響的主要代謝物，研究莽草酸含量變化對不同濃度草甘膦脅迫的敏感性。

1 材料與方法

1.1 茶苗水培試驗

將一年生龍井43茶苗分為3組，洗凈根部泥土后置于盛有去離子水的培養(yǎng)箱中，氣泵增氧，培養(yǎng)一周，隨后將純水更換為營養(yǎng)液，營養(yǎng)液由1/8濃度開始，由低到高逐步更換至全營養(yǎng)液，并在兩組全營養(yǎng)液中添加不同濃度草甘膦銨鹽，按有效成分計算使營養(yǎng)液中的草甘膦質量濃度分別達到50?mg·L-1和200?mg·L-1。于0?d（添加草甘膦前）及添加后1、2、3、7、14、21?d采集整株茶苗為樣本，拍照記錄其葉片表觀形態(tài)。包括空白對照組（CK）在內，每次每組取3株茶苗進行重復試驗。將樣本茶苗的全部葉片剝離并置于研缽中加入液氮研磨成粉狀，用于草甘膦及茶葉代謝物測定。

1.2 儀器與試劑

試驗儀器：四極桿靜電場軌道阱高分辨質譜儀（Q-Exactive-Orbitrap HRMS，美國Thermo Fisher公司），超高效液相色譜儀（UltiMate 3000 UHPLC，美國Thermo Fisher公司），多管渦旋混合儀（杭州米歐儀器有限公司），高速冷凍離心機（德國Sigma公司），Milli-Q去離子水發(fā)生器（美國Millipore公司）。

試劑：草甘膦銨鹽（有效成分68%）購自浙江金帆達生物有限公司，同位素內標[1,2-13C2,15N]-草甘膦（質量濃度100?mg·L-1）和草甘膦標準品（純度98%）購自上海安譜科學儀器有限公司，莽草酸標準品（純度98%）和甲酸（色譜純）購自上海麥克林公司，氫氧化鉀（分析純）購自杭州蕭山化學試劑廠，鹽酸（優(yōu)級純）購自江蘇永華精細化學廠，四硼酸鈉（99.5%）購自太倉美達試劑有限公司，氯甲酸-9-芴基甲酯（FMOC-Cl）購自美國APExBIO公司，甲醇和乙腈（色譜純）購自美國Thermo Fisher公司。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 茶鮮葉中代謝物測定

茶鮮葉經液氮研磨成粉后，稱取0.50?g置于15?mL離心管中，加入10?mL 70%甲醇溶液，超聲、渦旋后于冰箱冷藏靜置過夜。提取液經10?000?r·min-1離心后取1?mL上清液過0.22?μm有機系濾膜，待測。

色譜條件：安捷倫Eclipse Plus C18色譜柱（100?mm×2.1?mm，1.8?μm），柱溫為35?℃。流動相為含0.1%甲酸的水溶液（A相）及甲醇（D相），流動相洗脫程序為0?min，10% D相；10?min，95% D相；11?min，5% D相；15?min，5% D相。流速為0.3?mL·min-1，進樣量為3?μL。

質譜條件：采用加熱電噴霧離子源（HESI）正負離子同時掃描模式，噴霧電壓3.5?kV（ESI+）和3.2?kV（ESI-），毛細管溫度320?℃，輔助氣溫度300?℃，鞘氣（N2）35?arb，輔助氣（N2）12?arb，質譜掃描范圍為/100～1?200。

1.3.2 茶鮮葉中草甘膦的測定

茶鮮葉中草甘膦的檢測參照本實驗室及其他實驗室開發(fā)的方法[13,18]，并進行適當修改。

提?。悍Q取0.50?g液氮磨碎后的茶葉置于15?mL離心管并加入60?μL草甘膦同位素內標溶液（10?mg·L-1），然后加入3.75?mL KOH溶液（50?mmol·L-1），搖勻后，超聲20?min。經離心（4?700?r·min-1）后取2?mL上清液至5?mL離心管內，加入5?mol·L-1HCl溶液調節(jié)pH至中性，振蕩搖勻后經離心（5?000?r·min-1）得到上清液。

凈化：取1?mL上清液過Oasis HLB小柱（美國Waters公司，小柱活化：2?mL甲醇淋洗后加2?mL水活化），流出的凈化液接入2?mL離心管。

衍生：凈化液中加入0.25?mL硼酸鈉緩沖溶液，搖勻后，再加入0.35?mL FMOC-Cl衍生試劑（10?mg·mL-1），振蕩搖勻后，靜置2?h以上，10?000?r·min-1離心10?min，取上清液過0.22?μm有機系濾膜，待測。

色譜條件：色譜柱為安捷倫Eclipse Plus C18（100?mm×2.1?mm，1.8?μm），柱溫40?℃，流速為0.3?mL·min-1，進樣量為1?μL。使用0.1%甲酸水溶液（A相）和甲醇（D相）進行二元梯度洗脫，洗脫程序為0?min，10% D相；10.0?min，100% D相；11.0?min，100% D相；11.1?min，10% D相；14.0?min，10% D相。

質譜條件同1.3.1章節(jié)。

1.3.3 茶鮮葉中莽草酸的測定

提?。翰桴r葉經液氮研磨成粉后，稱取0.50?g置于15?mL離心管中，加入10?mL 70%甲醇溶液浸泡1?h以上，超聲10?min。提取液經10?000?r·min-1離心，上清液用0.5?mmol·L-1的KOH溶液稀釋100倍，待測。

色譜條件：接色譜保護柱（SeQuant，德國默克公司），不接色譜柱，流速為0.3?mL·min-1，進樣量為2?μL。使用乙腈（B相）和純水（C相）進行等度洗脫（50∶50）。分析時間為1?min。

質譜條件同1.3.1章節(jié)。

標準曲線制作：精密稱取莽草酸標準品適量，加水溶解配制成1.0?mg·mL-1儲備液，然后稀釋成100?mg·L-1的儲備液并置于4?℃條件下備用。

溶劑標準曲線的配制：以0.5?mmol·L-1KOH水溶液為溶劑，分別配制質量濃度為0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0?mg·L-1和2.5?mg·L-1的莽草酸標準工作溶液。

基質標準曲線的配制：稱取未用草甘膦處理的茶鮮葉粉末0.50?g，按照樣品提取方法進行提取和稀釋，以此溶液為溶劑分別配制質量濃度為0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0?mg·L-1和2.5?mg·L-1的莽草酸基質標準工作溶液。

基質效應（Matrix effect，ME）計算公式：=(－1)×100%，公式中的和分別代表基質標準曲線和溶劑標準曲線的斜率。

1.4 數據統(tǒng)計與分析

使用TraceFinder 3.0、Excel 2019和Compound Discoverer 2.0（CD）軟件對數據進行統(tǒng)計分析，采用Origin 8.0繪制草甘膦和莽草酸的檢測結果圖。

2 結果與分析

2.1 草甘膦對茶樹生長及代謝的影響

2.1.1 茶樹葉片表觀藥害觀察

文獻報道水培營養(yǎng)液中草甘膦質量濃度達到200?mg·L-1以上時，茶樹表現出明顯的藥害特征[13]。本研究設置50?mg·L-1草甘膦處理、200?mg·L-1草甘膦處理和空白對照3個水培茶苗試驗組。在施藥后的21?d內對茶苗生長狀況進行觀察。茶苗中間部位成熟葉片的照片如圖1所示，50?mg·L-1草甘膦處理組茶苗葉片在整個觀測期間均未發(fā)生藥害；200?mg·L-1草甘膦處理組茶苗葉片在前14?d觀測期未出現表觀異?，F象，直到21?d茶苗部分葉片開始向后卷曲，葉脈兩側出現不規(guī)則褐斑且葉片易脫落（輕微觸碰或者搖晃枝條即造成葉片脫落）。本研究觀測試驗證實了水培營養(yǎng)液中添加較高質量濃度的草甘膦（200?mg·L-1）后，茶苗表現出明顯的藥害癥狀。

2.1.2 茶樹葉片中代表性代謝物變化分析

使用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS對水培21?d 3組茶樹葉片中的非揮發(fā)性代謝物進行分析，分析得到的原始圖譜采用CD軟件進行峰匹配與峰面積提取，得到2?480個成分。對用藥組和對照組中存在顯著差異（<0.01）的代謝物按峰面積比值（用藥組/對照組）大小進行排序，其中差異最大（比值>10）的2個成分的精確分子量為174.052?8和172.037?4，通過高分辨質譜元素組成分析得到它們可能的元素組成分別為C7H10O5（理論精確分子質量174.052?8）和C7H8O5（理論精確分子質量172.037?2），誤差均小于2.0×10-6。然后通過二級質譜裂解分析和數據庫檢索推測化合物結構，并最終用標準品進行確證，確定這2個化合物分別為莽草酸和3-脫氫莽草酸。

圖1 水培營養(yǎng)液中添加不同濃度草甘膦后茶苗葉片的觀察照片

草甘膦的作用機理是抑制植物體內的莽草酸代謝途徑。對藥害組（200?mg·L-1草甘膦處理）和對照組茶樹葉片的莽草酸途徑中的主要代謝物的質譜響應峰面積進行比較，結果如圖2B所示。在藥害茶樹中，3-脫氫莽草酸和莽草酸的含量分別上升了約20.0倍和15.6倍；3-脫氫莽草酸的上游代謝物3-脫氫奎寧酸的含量升高了31%；莽草酸的下游代謝物苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的含量分別升高了199%、141%和111%。該結果表明，茶樹響應草甘膦脅迫的重要特征是莽草酸和3-脫氫莽草酸的大量積累，并且莽草酸途徑中的其他代謝物也有一定程度積累，但受影響程度明顯偏小，其中一個異常的現象是莽草酸下游代謝物芳香氨基酸的含量也會顯著升高。圖2C顯示，在試驗期內，200?mg·L-1草甘膦處理組茶樹葉片中3種芳香氨基酸的質譜響應峰面積呈先下降后逐漸升高的趨勢。郭永春等[14]在研究草甘膦對土培茶樹葉片主要生化成分的影響時，也觀察到了茶葉中氨基酸含量的波動變化，其中施用草甘膦7?d時，茶葉中苯丙氨酸含量升高了140%。這些現象與草甘膦抑制植物芳香氨基酸的合成作用機理不一致[19]，可能是茶樹存在特殊的代謝機制來抵抗草甘膦脅迫，該現象在后續(xù)工作中值得進一步研究。類似的現象在雜草香附子中也有發(fā)現，草甘膦處理后的香附子中莽草酸大量積累，但是芳香氨基酸的含量并不減少，研究者認為可能是蛋白質水解提供芳香氨基酸[20]。此外，茶葉中典型的多酚化合物如沒食子酸、表兒茶素和蕓香苷以及茶葉主要次生代謝物咖啡堿和茶氨酸的含量在藥害茶樹中略有下降，但不顯著。茶樹葉片中代謝物的UHPLC-HRMS分析結果表明，草甘膦主要影響茶樹莽草酸代謝途徑。因此，研究莽草酸途徑的主要代謝物莽草酸含量與草甘膦吸收量的變化規(guī)律將有助于揭示茶樹對草甘膦脅迫的應答機制。為了準確測定水培茶樹葉片中莽草酸和草甘膦的含量，需進一步對它們進行靶向定量分析。

注：A為莽草酸代謝途徑，B為21?d對照組和200?mg·L-1草甘膦處理組茶樹葉片中代表性化合物的質譜峰面積，C為200 mg·L-1草甘膦處理組茶樹葉片中3種芳香氨基酸質譜峰面積的時間變化趨勢。*、**和***分別表示在P<0.05，0.01，0.001下差異顯著

2.2 草甘膦脅迫下茶樹葉片中莽草酸含量的變化分析

2.2.1 高分辨質譜法快速測定茶樹葉片中莽草酸的含量

莽草酸是一種廣泛存在于植物體內的有機酸。目前，其含量測定方法有氣相色譜法（GC）、分光光度法（SRT）、高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜質譜聯(lián)用法（HPLC-MS）等[21]。質譜儀本身是一種高效分離儀器，可按分析物的質荷比（）實現空間或時間上的區(qū)分。尤其是近年來高分辨質譜的廣泛使用，使得我們能通過精確質量數將目標分子從復雜基質的眾多質譜信號中分離提取出來，從而實現混合物中單一目標物的準確定量[22]。基于Q-Exactive Orbitrap HRMS的高靈敏度、高分辨率和高質量精度等優(yōu)點，建立了一種新穎的莽草酸快速定量方法，該方法采用流動注射分析-質譜聯(lián)用（Flow injection analysis-mass spectrometry，FIA-MS）[23]，不使用色譜分離，只使用高分辨質譜對目標離子進行提取和定量。

使用ESI正負離子同時掃描模式對莽草酸標準品進行檢測，結果表明，莽草酸在ESI負模式下響應更高，這是因為其結構中的羧基基團容易失去質子形成穩(wěn)定的莽草酸負離子，因此本試驗選擇ESI負模式檢測。優(yōu)化后的莽草酸選擇離子流圖（EIC）和全掃描一級質譜圖如圖3所示。莽草酸的[M-H]-離子的EIC峰形較好，該離子理論值為173.045?5，實測值為173.045?4，誤差小于2×10-6，因此選擇該離子為定性和定量離子。

2.2.2 方法驗證

為驗證該方法的可行性，采用1.3.3章節(jié)制備的各基質標準溶液和溶劑標準溶液，按指定色譜及質譜條件進樣分析。莽草酸在0.01～2.50?mg·L-1線性良好，溶劑標準曲線和基質標準曲線的相關系數（2）都大于0.999，定量限為0.01?mg·L-1。由于茶鮮葉提取物中成分復雜，且該方法不使用色譜進行分離，因此該方法存在明顯的基質抑制效應，計算得到的基質效應為–42%。為消除基質效應，本研究采用相應基質匹配標樣進行校準。采用標準加入法計算茶葉中莽草酸本底含量（C0），C0即基質標準曲線與橫坐標交點處的絕對值。C為不同的基質加標濃度，以莽草酸進樣濃度（C+C0）為橫坐標，莽草酸的質譜響應峰面積為縱坐標建立校正標準曲線，使用校正標準曲線對茶葉中的莽草酸進行定量分析，校正標準曲線的線性方程為=3.63e8+3.94e5，2為0.999?8。

取0.50?g液氮磨碎的鮮葉樣品，分別加入當量為80、400?mg·kg-1和2?000?mg·kg-1的莽草酸標準品，按照前述方法每個添加水平重復分析6次，結果如表1所示，平均回收率為79.1%～102.1%，相對標準偏差（RSD，n=6）為3.5%～10.1%。對質量濃度為0.04?mg·L-1和1.0?mg·L-1的莽草酸基質標準溶液分別重復進樣6次，RSD分別為2.0%和4.0%，方法精密度良好。結果表明，本研究建立的莽草酸定量方法樣品前處理簡單，檢測結果準確，每個樣品的儀器分析時間只需1?min，尤其適合實驗室樣品的高通量分析。

圖3 莽草酸的選擇離子流圖和全掃描一級質譜圖

表1 茶鮮葉中莽草酸的加標回收率和相對標準偏差（n=6）

2.2.3 茶樹葉片中莽草酸含量的動態(tài)變化

運用上述方法對3組水培茶苗在施藥前（0?d）及施藥后（1、2、3、7、14、21?d）采集的63個鮮葉樣品中的莽草酸進行定量分析，結果如圖4A所示。整個試驗期間，對照組茶樹葉片中莽草酸的平均含量在93～313?mg·kg-1，14?d后有所下降。50?mg·L-1草甘膦處理組茶樹葉片中的莽草酸含量在前7?d與對照組沒有明顯差異，在14?d和21?d明顯升高，平均含量分別為469?mg·kg-1和1?015?mg·kg-1。200?mg·L-1草甘膦處理組茶樹葉片中的莽草酸含量在前2?d與對照組沒有明顯差異，從3?d開始明顯升高，后期呈加速上升趨勢，至21?d觀察到藥害癥狀時，葉片中莽草酸的平均含量為2?014?mg·kg-1。

2.3 茶樹葉片中草甘膦含量的變化分析

2.3.1 草甘膦檢測方法驗證

采用對照組的茶鮮葉作為空白樣品，按照1.3.2章節(jié)進行提取和凈化，得到空白基質溶液，精確吸取一定量的草甘膦標準溶液，逐級用空白基質溶液稀釋成8個質量濃度梯度（0.025、0.05、0.25、0.5、2.5、5、10、15?mg·L-1）的基質匹配標準工作溶液，然后按照1.3.2章節(jié)進行衍生和檢測。以草甘膦濃度（X）為橫坐標，對應的草甘膦標準品與同位素內標質譜響應峰面積的比值（Y）為縱坐標繪制標準曲線，結果顯示，草甘膦在0.025～15?mg·L-1范圍內線性良好，相關系數（2）為0.999，定量限為0.025?mg·L-1。分別稱取0.50?g對照組鮮葉于離心管中，添加當量為1.0、10.0、50.0?mg·kg-1的草甘膦標準品，每個濃度水平重復5次，按照1.3.2章節(jié)的方法進行前處理和檢測，結果顯示，草甘膦加標的平均回收率為86.0%～113.7%，RSD（n=5）為1.4%～3.7%。該方法滿足本次茶樹葉片中草甘膦含量的檢測要求。

圖4 不同質量濃度草甘膦處理茶苗葉片中的莽草酸（A）和草甘膦（B）含量變化趨勢

2.3.2 茶樹葉片中草甘膦含量的動態(tài)變化

對草甘膦處理組水培茶苗施藥后1、2、3、7、14、21?d采集的鮮葉樣品中的草甘膦進行定量分析，結果如圖4B所示。施藥后1?d，50?mg·L-1和200?mg·L-1草甘膦處理組的茶樹葉片中檢測到的草甘膦平均含量分別達到1.9?mg·kg-1和7.7?mg·kg-1，說明茶樹對草甘膦有較強的吸收轉運能力。隨著試驗進程，茶樹葉片中的草甘膦含量逐漸升高，至14?d達到最高值。結果顯示，水培營養(yǎng)液中草甘膦濃度越高，葉片吸收草甘膦的速率越大、積累量越高。21?d觀察到藥害時，50?mg·L-1和200?mg·L-1草甘膦處理組茶樹葉片中草甘膦的平均積累量有所下降，分別為27.0?mg·kg-1和94.5?mg·kg-1。

2.4 草甘膦對茶樹莽草酸代謝的影響

不同植物對草甘膦的敏感度和抗性有較大差異，其中一個主要評價指標是莽草酸含量的變化。油菜在草甘膦處理后6?h即觀察到莽草酸的大量積累（約26倍）[24]，咖啡樹在草甘膦處理后7?d才觀察到莽草酸的明顯積累（約1倍）[25]，而抗草甘膦棉花在用草甘膦處理后莽草酸沒有顯著的積累[26]。對不同濃度草甘膦處理的茶樹葉片中莽草酸和草甘膦的定量分析表明，茶樹葉片中莽草酸的積累量和草甘膦吸收量具有顯著的正相關性。整個試驗期內（0～21?d），葉片中草甘膦的吸收量前14?d持續(xù)升高，隨后呈下降趨勢。與對照組相比，低劑量草甘膦處理組（50?mg·L-1）茶樹葉片中莽草酸的含量在14?d才開始顯著升高，對應葉片中草甘膦的平均含量為28.4?mg·kg-1；而高劑量草甘膦處理組（200?mg·L-1）茶樹葉片中的莽草酸含量在3?d即明顯升高，對應葉片中草甘膦的平均含量為40.1?mg·kg-1，說明茶樹莽草酸代謝對草甘膦脅迫的敏感性與草甘膦吸收量有關，吸收量越高，草甘膦對茶樹莽草酸代謝途徑的抑制越明顯，本研究得到的草甘膦造成茶樹葉片中莽草酸顯著積累的閾值為28～40?mg·kg-1。此外茶樹葉片中莽草酸的積累量與草甘膦的作用時間有關，14?d以后，低劑量和高劑量草甘膦處理組茶樹葉片中的草甘膦含量都有所下降，但是14～21?d，它們的莽草酸含量都升高了1倍以上，說明被葉片吸收的草甘膦能夠持續(xù)抑制茶樹的莽草酸代謝途徑，導致莽草酸大量積累，發(fā)生藥害的茶樹葉片中莽草酸的含量比未用草甘膦處理的正常茶樹葉片高約16倍。

3 討論與結論

莽草酸途徑是植物最重要的次生代謝途徑之一，莽草酸是植物中芳香氨基酸、多酚、生物堿等眾多品質成分的合成前體，莽草酸途徑的代謝紊亂可能造成下游代謝物含量的變化。前人研究表明，草甘膦能夠通過茶樹根系吸收，經莖部轉運富集于葉片，高濃度草甘膦會使茶樹葉片出現褐色斑點并最終脫落，低濃度草甘膦即使不造成藥害，也會明顯改變茶樹葉片中主要生化成分的含量[5,13-14]。本研究通過觀察不同濃度草甘膦處理的水培茶苗葉片的表觀藥害，并使用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS分析茶樹葉片中的代謝物，發(fā)現高劑量的草甘膦能夠導致茶樹發(fā)生藥害，藥害組茶葉中莽草酸途徑相關代謝物含量顯著升高，其中莽草酸和脫氫莽草酸是含量上升最大的兩種代謝物，而與莽草酸代謝途徑關系較小的典型的幾種多酚類化合物沒食子酸、表兒茶素和蕓香苷以及茶葉主要的品質成分咖啡堿和茶氨酸的含量變化相對較小。本研究發(fā)現，草甘膦能夠顯著抑制茶樹的莽草酸代謝途徑，但是下游芳香氨基酸的含量在一定時期內反而明顯升高，該異?，F象在其他文獻中也有報道[14]，發(fā)生機制有待進一步研究。草甘膦對茶葉品質成分的影響較為復雜，本研究的結果可為此類研究提供一定的理論參考。

植物體中莽草酸含量變化是判斷植物是否具有草甘膦抗性的重要生理指標[25]。本研究發(fā)現，莽草酸是茶樹響應草甘膦脅迫的主要代謝物之一，草甘膦對茶樹莽草酸途徑具有明顯的抑制作用，造成葉片中莽草酸的積累，積累量與草甘膦劑量和作用時間正相關。該結果表明，草甘膦對茶樹生長和代謝的影響可能也是抑制莽草酸代謝途徑中的EPSPs酶，造成莽草酸無法向下游代謝物轉化，與草甘膦在其他植物中的致毒機制類似。因此，研究草甘膦脅迫下茶葉中莽草酸含量的變化規(guī)律有助于了解茶樹對草甘膦的抗性和研究茶樹應對草甘膦脅迫的代謝機制。

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Glyphosate-stress Effects on Shikimic Acid in Tea Leaves

LIU Hongxia1,2, LIU Yingying1,2, CHEN Hongping1,3*, CHAI Yunfeng1,3*

1. Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 3. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Tea (Hangzhou), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Hangzhou 310008, China

To investigate the effect of glyphosate stress on the growth and shikimic acid metabolism of tea (L) plants, tea seedlings were cultured in nutrient solution with different concentrations of glyphosate and the visual phytotoxicity on tea leaves was observed. The non-targeted analysis of non-volatile metabolites in the leaves and quantitative determination of shikimic acid and glyphosate in the leaves were carried out by ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole orbitrap high-resolution mass spectrometry. The results show that the tea seedlings under the high dose of glyphosate (200?mg·L-1) treatment exhibited characteristics of pesticide damage, while the tea seedlings under the low dose of glyphosate (50?mg·L-1) treatment and control did not show apparent pesticide damage. Mass spectrometric and statistical analysis indicates that there were significant changes in the contents of shikimic acid pathway metabolites in the leaves of glyphosate-treated tea seedlings, with shikimic acid being one of the main differential metabolites. Within 21?d, the accumulation of shikimic acid in leaves was highly positively correlated with the absorption amount and action time of glyphosate. When the absorption amount of glyphosate was larger than 28?mg·kg-1, the shikimic acid metabolism in tea plants was significantly inhibited, resulting in a large accumulation of shikimic acid in tea leaves. Compared with the control group, the content of shikimic acid in tea leaves affected by pesticides increased about 16-fold. This study shows that shikimic acid is one of the main metabolites of tea plants in response to glyphosate stress.

tea plant, glyphosate, shikimic acid, phytotoxicity, LC-MS

S571.1；S482

A

1000-369X(2023)05-657-10

2023-03-08

2023-07-09

國家自然科學基金（21775164）、現代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項資金（CARS-23）、三農九方項目（2022SNJF037）

劉洪霞，女，碩士研究生，主要從事茶葉質量安全研究。*通信作者：thean27@tricaas.com；chaiyunfeng@tricaas.com