王媛,王藝萌,張倩,李薇薇,吳雯婷,張春雷

皮膚鱗狀細(xì)胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma,cSCC)是白種人群中第二常見的惡性非黑素瘤皮膚癌[1]。據(jù)中國第6次人口普查及上海市非黑素瘤皮膚癌流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)估算,我國60歲以上人群中cSCC患者約29.7萬人。光線性角化病(actinic keratosis,AK)是皮膚科常見疾病,為表皮角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)育不良,小部分AK可以發(fā)展為cSCC,被認(rèn)為是cSCC最常見的癌前病變。瑞典一項(xiàng)隨訪10年納入了17 651例患者的對(duì)照隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn),診斷為AK的人群10年內(nèi)患有SCC、基底細(xì)胞癌、黑素瘤等皮膚癌的風(fēng)險(xiǎn)增加[2]。鮑溫病(Bowen′s disease,BD)為全層的鱗狀細(xì)胞高度不典型增生,被視為未突破基底膜的鱗狀細(xì)胞癌,即原位鱗癌。AK、BD、cSCC均是以角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖為特征的皮膚疾病,在臨床及組織病理上可能代表了cSCC在不同演進(jìn)階段的表現(xiàn)或進(jìn)展過程。

cSCC的發(fā)生、發(fā)展涉及多基因和多種分子水平共同作用,是一個(gè)極其復(fù)雜的過程。研究發(fā)現(xiàn),SLC2A3基因編碼的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3(glucose transporter 3,GLUT3)與磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-Akt、缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)、Ras、c-Myc和p53途徑等多條腫瘤的發(fā)生發(fā)展通路相關(guān)[3],參與了腫瘤細(xì)胞的糖酵解轉(zhuǎn)變[4-7]。高GLUT3表達(dá)與乳腺癌和頭頸癌轉(zhuǎn)移發(fā)生率增加呈正相關(guān),而較低水平的GLUT3與其較長的無轉(zhuǎn)移生存期相關(guān)[8]。并且在多種惡性腫瘤疾病中,GLUT3 的高表達(dá)均被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞生長的促進(jìn)因素和預(yù)后的負(fù)相關(guān)因素,盡管GLUT3在多種腫瘤中高表達(dá),但關(guān)于其在AK、BD、cSCC組織中表達(dá)的研究少有提及。本研究擬通過回顧性研究近年來在本院確診的AK、BD、cSCC患者的臨床資料,用免疫組織化學(xué)的方式檢測(cè)GLUT3 在正常皮膚(normal skin,NS)、AK、BD 和cSCC組織中的表達(dá),初步探討AK、BD、cSCC三種疾病之間的聯(lián)系和GLUT3在三種疾病中的表達(dá)差異。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 收集2016年5月—2020年12月期間于北京大學(xué)第三醫(yī)院皮膚科就診患者中,根據(jù)臨床表現(xiàn)和組織病理確診為AK(165例)、BD(84例)及cSCC(39例)患者的性別、年齡、發(fā)病時(shí)長等資料進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并查找蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining, HE)的病理片進(jìn)行重新閱片。從中按順序選取保存良好的AK組50例,BD組50例,cSCC組22例組織蠟塊樣本及20例來自于良性腫物手術(shù)切除術(shù)中多余的富裕皮膚作為正常皮膚對(duì)照組進(jìn)行免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)北京大學(xué)第三醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),批件號(hào):(2022)醫(yī)倫審第(047-01)號(hào)。

入選標(biāo)準(zhǔn)為:基本臨床資料完整,AK、BD和cSCC通過病理檢查已確診,所有納入的病例病理切片均經(jīng)過兩位資深皮膚病理醫(yī)師獨(dú)立閱片。排除標(biāo)準(zhǔn):臨床資料不完整、病理診斷不明確、經(jīng)過治療的病例予以排除。

1.2主要試劑 GLUT3 抗體購自美國Abcam公司(AF5135),抗體使用濃度為 1∶200。小鼠/兔聚合物法檢測(cè)通用型試劑盒和 DAB 顯色試劑盒(AR1022)購自中山金橋公司。

1.3AK的Protruding病理分級(jí) Protruding (PRO)分級(jí)根據(jù)基底不典型角質(zhì)形成細(xì)胞向真皮突出程度分為Ⅰ～Ⅲ級(jí),PRO Ⅰ:表皮基底層可見不典型角質(zhì)形成細(xì)胞擁擠,但未形成出芽結(jié)構(gòu);PRO Ⅱ:擁擠的不典型角質(zhì)形成細(xì)胞已形成向真皮延伸的出芽結(jié)構(gòu),但長度未超過表皮厚度;PRO Ⅲ:出芽的不典型角質(zhì)形成細(xì)胞已超過表皮厚度[9]。

1.4免疫組織化學(xué) 將組織蠟塊制成4 μm厚切片,置于防脫載玻片上。經(jīng)過不同濃度乙醇脫水,放入 3%過氧化氫溶液,室溫避光孵育 15 min 后,將其放入檸檬酸鹽溶液(pH 6.0)中進(jìn)行微波抗原修復(fù),涼至室溫,加入稀釋后的 GLUT3抗體(1∶200,Abcam公司),4 ℃孵育過夜,加入二抗,室溫孵育 30 min,加入 DAB 顯色液,蘇木素復(fù)染,中性樹脂封片,應(yīng)用顯微鏡觀察。

1.5免疫組織化學(xué)結(jié)果判定 高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野,根據(jù)染色陽性細(xì)胞率和染色強(qiáng)度評(píng)分進(jìn)行半定量分析。陽性細(xì)胞率評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):陽性細(xì)胞率 10%及以下為1分,11%～50%為2分,51%～80%為3分,81%及以上為4分。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):無染色為0分,淺黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。免疫組織化學(xué)半定量評(píng)分為2項(xiàng)結(jié)果評(píng)分相乘,分為4個(gè)等級(jí):0分為陰性(-),1～4分為弱陽性(+),5～8 分為陽性(2+),9～12分為強(qiáng)陽性(3+)。陽性及強(qiáng)陽性表達(dá)為陽性評(píng)分。評(píng)分由兩位病理醫(yī)師隨機(jī)雙盲法獨(dú)立進(jìn)行,結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)通過查詢參考文獻(xiàn)[10]獲得。

2 結(jié)果

2.1一般情況 共有165例病理確診的AK納入該研究,其中男58例,女107例,平均年齡(74.5±10.9)歲,其中男性平均年齡(75.6±10.0)歲,女性平均年齡(73.9±11.3)歲。84例病理確診的BD納入該研究,其中男40例,女44例,平均年齡(64.1±19.5)歲,其中男性平均年齡(58.9±21.2)歲,女性平均年齡(68.9±16.6)歲。39例病理確診的cSCC納入該研究,其中男22例,女17例,平均年齡(72.9±15.0)歲,其中男性平均年齡(68.8±13.2)歲,女性平均年齡(78.2±15.8)歲。其中AK組女性患者明顯多于男性患者,女∶男為1.8∶1,而BD組和cSCC組的男女比例類似。三組病例的平均年齡均在64歲以上,以中老年人為主。cSCC組的女性平均年齡最高,為78.2歲。各組患者就診時(shí)的平均年齡分布情況,見表1,三種疾病的總體年齡分布有差異,AK、BD和cSCC的年齡構(gòu)成差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000 067 8)。AK、cSCC于60歲后患病人數(shù)明顯增加。BD在30歲后各年齡段發(fā)病人數(shù)相當(dāng)。

表1 165例AK、84例BD和 39 例cSCC患者的年齡分布情況 例(%)

表2 165例AK、84例BD及39例cSCC患者皮損分布情況 例

表3 GLUT3在NS、AK、BD 和cSCC組織中的表達(dá)

2.2發(fā)病部位 AK組均發(fā)生于面頸部。BD組和SCC組全身各處均有發(fā)生,其中BD組發(fā)生在會(huì)陰和軀干部最多見,分別占27.38%及26.19%,cSCC組發(fā)生在面頸部遠(yuǎn)高于其他部位,占66.67%。三種疾病的總體發(fā)病部位分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。各組患者發(fā)病部位分布情況,見表 2。

2.3cSCC伴發(fā)AK的病理分析 在39例cSCC病例中,發(fā)生在面頸部有26例,除外6例因取材面積較小,未見腫瘤邊緣,余20例HE病理切片可見cSCC癌旁均伴有AK病變,對(duì)這20例cSCC伴發(fā)AK的HE病理片進(jìn)行癌旁AK的PRO病理分級(jí), PROⅠ級(jí)占5.00%(1例),PROⅡ級(jí)占10.00%(2例),PRO Ⅲ級(jí)占85.00%(17例),Ⅲ 級(jí)的病例數(shù)明顯高于其他組,結(jié)果見圖1。

圖1 癌旁AK PRO分級(jí)結(jié)果

2.4GLUT3在NS、AK、BD 和cSCC組織免疫組織化學(xué)染色情況 GLUT3 主要表達(dá)于表皮細(xì)胞的細(xì)胞漿,在 NS組和 AK 組中,GLUT3 主要呈弱陽性或中度陽性表達(dá),GLUT3在正常皮膚表皮層的鱗狀細(xì)胞表達(dá)染色強(qiáng)度低,陽性細(xì)胞數(shù)少;在BD及cSCC組中,GLUT3 主要呈陽性或強(qiáng)陽性表達(dá)。見圖2。

2.5NS、AK、BD 和cSCC組織中 GLUT3 表達(dá)差異 GLUT3 在 NS、AK 、BD和cSCC組織中表達(dá)的陽性率呈遞增趨勢(shì),4 組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。GLUT3表達(dá)的強(qiáng)陽性率結(jié)果示cSCC組顯著高于NS和AK、BD組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),4組間GLUT3免疫組織化學(xué)半定量評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。陽性率=(陽性例數(shù)+強(qiáng)陽性例數(shù))/總例數(shù),強(qiáng)陽性率=強(qiáng)陽性例數(shù)/總例數(shù)。見表 3。

2.6將GLUT3的免疫組織化學(xué)和AK PRO病理分級(jí)進(jìn)行相關(guān)性分析 對(duì)這50例行GLUT3免疫組織化學(xué)染色的AK病例的HE染色片進(jìn)行PRO病理分級(jí),結(jié)果分別為Ⅰ級(jí)為14例(28.00%),Ⅱ級(jí)為21例(42.00%),Ⅲ級(jí)為15例(30.00%)。因GLUT3免疫組織化學(xué)評(píng)分值與PRO病理分級(jí)不屬于正態(tài)分布,故采用Spearman相關(guān)性分析,結(jié)果為0.467,呈正相關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。

3 討論

cSCC是一種來源于表皮或附屬器的角質(zhì)形成細(xì)胞惡性腫瘤,cSCC是除黑素瘤以外的最具侵襲性的皮膚惡性腫瘤[11]。AK 及 BD 作為cSCC重要的癌前病變及原位癌,三者之間關(guān)系密切,根據(jù)以往研究顯示AK向SCC的進(jìn)展率為每年0%～0.075%,但在既往有非黑素瘤皮膚癌病史的患者中,風(fēng)險(xiǎn)高達(dá)0.53%[12],而未經(jīng)治療的BD有3%～ 26%的病例發(fā)展為侵襲性cSCC[13],故探討AK、BD、cSCC之間的相關(guān)性有助于了解cSCC的發(fā)生發(fā)展,以減少惡變發(fā)生,并為進(jìn)一步研究cSCC的靶向治療提供依據(jù)。

本研究通過分析納入病例的臨床資料發(fā)現(xiàn),AK組和cSCC組的患者以中老年為主,平均年齡均為70歲以上,發(fā)病人群在60歲以后大幅增加。發(fā)病部位示兩組均以面頸部最多見,既往研究認(rèn)為紫外線照射為AK及cSCC的重要危險(xiǎn)因素[14]。BD組的平均發(fā)病年齡略低,與其他兩組不同,20～50歲性活躍期患者較多,且BD組會(huì)陰部多見,考慮可能與人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染相關(guān),既往研究示HPV感染為BD發(fā)病的危險(xiǎn)因素[15],而HPV感染使患cSCC的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加[16],特別是HPV 16或HPV 18感染,尤其是發(fā)生于肛門生殖器和甲周的病變。但HPV增加cSCC發(fā)病率的確切機(jī)制尚不明確[17]。本研究中AK的女性患者人數(shù)是男性患者人數(shù)的近2倍,國內(nèi)外多個(gè)研究也提示在AK患者中女性人數(shù)往往高于男性,但具體原因不清[2, 18]。綜合分析,建議年齡超過60歲且曝光部位有可疑皮損,或性活躍期人群會(huì)陰部皮損,可完善皮膚鏡等無創(chuàng)性檢查以提高診斷的準(zhǔn)確性[19]。如懷疑有惡變風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)及時(shí)完善組織病理學(xué)檢查,但明確診斷前不建議給予有創(chuàng)性治療。

腫瘤細(xì)胞快速增殖是惡性腫瘤的重要特點(diǎn),為滿足其增殖的能量需求,與正常細(xì)胞相比,腫瘤細(xì)胞的葡萄糖需求量明顯增加。而葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),首先需要通過細(xì)胞膜的載體。由SLC2A基因編碼的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(glucose transporter,GLUT)即為一類介導(dǎo)不同組織中各種己糖和衍生物跨膜運(yùn)動(dòng)的主要載體。目前發(fā)現(xiàn)其家族中有14個(gè)成員,分別為GLUT 1～14。它們是一類在結(jié)構(gòu)上具有高度同源性的跨膜糖蛋白,具有共同的序列特征,均由約 500 個(gè)氨基酸組成,其一級(jí)結(jié)構(gòu)經(jīng)旋轉(zhuǎn)和折疊等過程形成 12 個(gè)跨膜螺旋環(huán),在 12 段跨膜螺旋結(jié)構(gòu)之間,存在6個(gè)胞外環(huán)和5個(gè)胞內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)。GLUT的N端和C端均位于胞內(nèi),其長度和氨基酸構(gòu)成具有特異性,其中C 端被認(rèn)為是區(qū)分亞型的特異性標(biāo)志[20]。這些蛋白以不同的親和力為細(xì)胞運(yùn)輸葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、脫氫抗壞血酸(DHA)、尿酸鹽和肌醇等[21]。其中GLUT 1～4對(duì)代謝的穩(wěn)態(tài)起到關(guān)鍵作用[20, 22],GLUTs的功能障礙與許多疾病相關(guān),如GLUT1缺乏綜合征[23],GLUT4減少與2型糖尿病胰島素信號(hào)異常的關(guān)系[22],GLUT1與GLUT3在多種惡性腫瘤中表達(dá)升高等[24-27]。由于GLUT的上調(diào)表達(dá)滿足了癌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的需求增加,因而抑制GLUT可能成為治療癌癥的潛在機(jī)會(huì)[27]。其中GLUT3對(duì)葡萄糖的親和力極高,與GLUT1相比,GLUT3對(duì)葡萄糖的親和力高出五倍[21],有報(bào)道稱GLUT3在膀胱癌、喉癌、前列腺癌、胃癌、頭頸癌、卵巢癌和口腔鱗癌中的表達(dá)升高,且可能與部分腫瘤的分期和預(yù)后存在相關(guān)性[21]。提示其可能是一種新的腫瘤標(biāo)志物。

鑒于GLUT3在多種腫瘤中的高表達(dá)及作用,但在AK、BD、cSCC中的研究暫缺乏,本研究通過免疫組織化學(xué)方法比較cSCC與NS、AK、BD組織中GLUT3的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)GLUT3在AK、BD及cSCC組織中的陽性表達(dá)呈遞增趨勢(shì),此趨勢(shì)與疾病的惡性程度相一致,推測(cè)GLUT3可能為cSCC的潛在腫瘤標(biāo)記物。關(guān)于cSCC的進(jìn)展過程常認(rèn)為是在 AK的基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)展為原位SCC、浸潤性 SCC,最后進(jìn)展為轉(zhuǎn)移性SCC[28]。cSCC癌旁伴發(fā)的AK往往被認(rèn)為是AK基礎(chǔ)上繼發(fā)cSCC的表現(xiàn)[29],對(duì)該部位的AK進(jìn)行研究可能得到AK繼發(fā)cSCC的提示。目前對(duì)AK在組織學(xué)上的分類還缺乏共識(shí),應(yīng)用較多的兩種分類方式,分別是Rwert-Huber等[30]提出的根據(jù)表皮不典型角質(zhì)形成細(xì)胞累及范圍的分類方式及Schmitz等[9]提出的根據(jù)AK皮損向真皮方向生長的深度的基底生長模式(protruding,PRO)分類法。通過皮膚病理學(xué)家對(duì) AK 的組織學(xué)圖像進(jìn)行分類,比較兩種分級(jí)方式的信度發(fā)現(xiàn) PRO 病理分級(jí)更具有可靠性[31],因AK多發(fā)生于曝光部位,故本研究采用對(duì)曝光部位的cSCC癌旁AK進(jìn)行PRO病理分級(jí),結(jié)果示PRO Ⅲ級(jí)病例數(shù)明顯多于PROⅠ、Ⅱ級(jí),各級(jí)別間的發(fā)生數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,即cSCC癌旁AK中PRO病理分級(jí)Ⅲ級(jí)所占比例最高。根據(jù)此結(jié)果推測(cè),AK PRO病理Ⅲ級(jí)進(jìn)展為cSCC的可能性最大,故在AK病例中,對(duì)PRO Ⅲ級(jí)的病例應(yīng)警惕繼發(fā)cSCC,必要時(shí)可取多處組織行病理活檢,對(duì)治療的選擇上也可以更積極并注意隨訪[15]。而在對(duì)AK組中GLUT3免疫組織化學(xué)評(píng)分與PRO病理分級(jí)進(jìn)行相關(guān)性分析后,發(fā)現(xiàn)GLUT3的免疫評(píng)分與AK的PRO病理分級(jí)程度呈正相關(guān),說明GLUT3的表達(dá)強(qiáng)弱可能會(huì)體現(xiàn)AK向真皮進(jìn)展的程度。結(jié)合cSCC癌旁AK PRO病理分級(jí)結(jié)果,進(jìn)一步推測(cè)GLUT3的高表達(dá)可能提示AK向cSCC進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)增加。但可能因?yàn)闃颖玖可僦孪嚓P(guān)度略低,后期增加樣本量,結(jié)果可能會(huì)更明顯。

綜上所述,推斷GLUT3可能是cSCC的潛在腫瘤標(biāo)記物,并且GLUT3高表達(dá)還可能是AK向cSCC進(jìn)展的標(biāo)記物之一。隨著分子生物學(xué)及生物技術(shù)的發(fā)展,2015年顏寧團(tuán)隊(duì)破解了GLUT3的晶體結(jié)構(gòu),使人們對(duì)GLUT3 的結(jié)構(gòu)有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí),本研究對(duì)其在AK、BD及cSCC中的異常表達(dá)及意義也有了初步探索,但 GLUT3 及其異常表達(dá)在cSCC發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制尚不清楚,通過對(duì)GLUT3進(jìn)行更深入的研究可能會(huì)為cSCC的臨床診斷及治療提供新的方向。