潘蕓,楊陽,劉甜,張瑩,彭蕾蕾

增生性瘢痕(hypertrophic scar,HS)是一種燒傷或創(chuàng)傷后真皮纖維增生性疾病,通常伴有疼痛、瘙癢等不適,還會引起外觀損傷和功能障礙,嚴(yán)重影響患者工作、生活及身心健康[1-2]。研究表明,血管生成在HS形成的早期階段起著至關(guān)重要的作用,因此如何抑制血管生成,進(jìn)而抑制HS的發(fā)展已成為皮膚美容領(lǐng)域的研究熱點[3]。大黃素是一種天然蒽醌衍生物,具有抗癌、抗炎、抗纖維化、抗病毒、免疫抑制和神經(jīng)保護(hù)等多種生理活性[4]。研究發(fā)現(xiàn),大黃素可通過抑制機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的HS炎癥、巨噬細(xì)胞極化,減弱HS形成[5-6]。基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α(stromal cell-derived factor-1,SDF-1α)又稱CXC趨化因子配體12(CXC chemokine ligand 12,CXCL12),參與調(diào)節(jié)血管生成、炎癥細(xì)胞浸潤和細(xì)胞遷移等多種生物學(xué)過程[7-8]。SDF-1α/CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4,CXCR4)在燒傷患者中上調(diào)表達(dá),并促進(jìn)HS的發(fā)展[9-11]。但大黃素能否通過調(diào)節(jié)SDF-1α/CXCR4軸對HS大鼠中的血管生成產(chǎn)生影響尚不清楚。因此,本研究旨在探討大黃素對HS大鼠血管生成的影響及其可能的作用機(jī)制,以期為臨床治療HS提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級SD大鼠購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可編號:SCXK(湘)2019-0014,5～7周齡,體重范圍在180～220 g之間,雌雄各半,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,設(shè)置飼養(yǎng)溫度為22 ℃,濕度為55%～60%,12 h光暗循環(huán)。不禁水食。本研究獲得本院動物倫理管理委員會的批準(zhǔn)。

1.2主要試劑與儀器 大黃素(貨號:A1918)購自北京康瑞納生物科技有限公司;CTCE-0214(SDF-1α/CXCR4激活劑,貨號:HY-P3612)購自美國MCE公司;HE染色試劑盒(貨號:G1120-100)、Masson染色試劑盒(貨號:G1340)購自北京索萊寶科技有限公司;蛋白提取試劑盒(貨號:CK0009)購自南京萊富賽生物科技有限公司;實時熒光定量PCR試劑盒(貨號:BK2100)購自百奧邁科生物技術(shù)有限公司;RNA提取試劑盒(貨號:R30506-50T)購自上海源葉生物科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號:YT9036)購自北京伊塔生物科技有限公司;SDF-1α與CXCR4引物購自北京擎科生物科技有限公司;兔抗血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelialgrowth factor,VEGF,貨號:ab32152)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1,貨號:ab215715)、血管生成素1(angiopoietin,Ang1,貨號:ab183701)、Ⅰ型膠原蛋白(collagen type Ⅰ,COL-Ⅰ,貨號:ab270993)、COL-Ⅲ(貨號:ab184993)、SDF-1α(貨號:ab271245)、CXCR4(貨號:ab124824)、GAPDH(貨號:ab9485)一抗抗體購自美國Abcam公司;辣根酶標(biāo)記羊抗兔二抗(貨號:XY0650)購自上海信裕生物科技有限公司;多功能酶標(biāo)儀(型號:LD-96A)購自山東萊恩德智能科技有限公司;離心機(jī)(型號:5424)購自艾本德中國有限公司;實時熒光定量PCR儀(型號:CFX96 Touch)購自上海艾研生物科技有限公司;光學(xué)顯微鏡(型號:CX31)購自日本奧林巴斯公司;臺式超級控溫燙傷儀(型號:YLS-5Q)購自北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司。

1.3實驗方法

1.3.1動物建模、分組和給藥 選用SPF級SD大鼠72只,隨機(jī)分為6組(12只/組):對照組、模型組、大黃素低、中、高劑量組、激活劑組,除對照組外,其余各組利用恒溫恒壓電熱燙傷儀在75 ℃條件下在大鼠背部燒傷10 s,造成大鼠Ⅱ級燒傷來建立HS動物模型,具體步驟操作參考李松蓮等[12]使用方法。燒傷后21 d進(jìn)行病理檢查以證實HS大鼠模型構(gòu)建成功。大黃素低、中、高劑量組大鼠腹腔注射1、5、10 mg/kg的大黃素[6],激活劑組大鼠腹腔注射10 mg/kg的大黃素+10 mg/kg SDF-1α/CXCR4通路激活劑CTCE-0214[13],對照組與模型組注射等量的生理鹽水, 1次/d,連續(xù)14 d,見圖1。

1.3.2測量大鼠瘢痕愈合情況 在建模及給藥后對大鼠瘢痕邊緣進(jìn)行測量并拍照,采用ImagePro Plush.6.0圖像分析系統(tǒng)對瘢痕面積進(jìn)行測定,并計算瘢痕愈合率。瘢痕愈合率(%)=(原始瘢痕面積-未愈合瘢痕面積)/原始瘢痕面積×100%。

1.3.3HE及Masson染色 藥物治療結(jié)束后,脫頸處死大鼠,取增生性瘢痕組織,部分瘢痕組織經(jīng)多聚甲醛固定、梯度脫水、石蠟包埋切片、二甲苯脫蠟和水化后進(jìn)行HE染色與Masson染色,乙醇脫水后封片,最后在顯微鏡下隨機(jī)選取6個視野觀察,采用Image-ProPlus 6.0軟件分析圖像并計算成纖維細(xì)胞密度(每視野成纖維細(xì)胞的數(shù)目)和膠原纖維密度,膠原纖維密度=膠原面積/總面積×100%。

1.3.4免疫組織化學(xué)檢測VEGF的表達(dá) 增生性瘢痕組織切片經(jīng)脫蠟和水化、過氧化氫處理后,分別加入山羊血清封閉組織切片15 min,VEGF一抗(1∶1 000)在4 ℃孵育過夜,加入二抗(1∶2 000)在37 ℃孵育60 min,經(jīng)DAB、蘇木精染色,最后在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)取6個視野觀察,采用Image J軟件分析VEGF平均光密度值,以反映VEGF蛋白表達(dá)水平。

1.3.5qRT-PCR法檢測SDF-1α、CXCR4 mRNA的表達(dá) 瘢痕組織總RNA用Trizol試劑提取。以RNA為模板合成cDNA后,再以cDNA為模板配置qRT-PCR反應(yīng)體系。SDF-1α上游引物:5′-ACTGGGTTTGTGATTGCCTCTGAAG-3′和下游引物:5′-GGAACCTGAACCCCTGCTGTG-3′;CXCR4上游引物:5′-GCCTTATCCTGCCTGGTATTGTC-3′和下游引物:5′-GCGAAGAAAGCCAGGATGAGGAT-3′;GAPDH上游引物:5′-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3′和下游引物:5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT-3′;以2-ΔΔCT法計算組織和細(xì)胞中SDF-1α、CXCR4 mRNA的相對表達(dá)量。

1.3.6Western blot檢測組織中TGF-β1、Ang1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、SDF-1α、CXCR4蛋白的表達(dá) 提取各組總蛋白,對蛋白進(jìn)行定量、電泳分離。轉(zhuǎn)PVDF膜后室溫條件下封閉2 h,最后再分別加TGF-β1(1∶1 000)、Ang1(1∶1 000)、COL-Ⅰ(1∶2 000)、COL-Ⅲ(1∶1 000)、SDF-1α(1∶2 000)、CXCR4(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)一抗在4 ℃條件下孵育過夜,加入二抗(1∶2 000)在37 ℃條件下孵育90 min。最后Image J軟件分析各個蛋白條帶的灰度值,然后計算各個蛋白的相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1大黃素對大鼠瘢痕愈合情況的影響 與模型組比較,大黃素低、中、高劑量組大鼠瘢痕愈合率明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.853、25.572、34.776,P<0.05);與大黃素高劑量組比較,激活劑組大鼠瘢痕愈合率明顯降低(t=15.450,P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠瘢痕愈合率、成纖維細(xì)胞密度、膠原纖維密度、VEGF表達(dá)的比較

2.2大黃素對大鼠瘢痕組織中成纖維細(xì)胞密度的影響 對照組大鼠皮膚結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞排列整齊,成纖維細(xì)胞的數(shù)量較少,密度較低;與對照組比較,模型組大鼠皮膚有明顯瘢痕現(xiàn)象,細(xì)胞排列紊亂,膠原含量豐富、血管分布密集、真皮組織中成纖維細(xì)胞密度明顯升高(t=27.037,P<0.05);與模型組比較,大黃素低、中、高劑量組大鼠瘢痕區(qū)減少,瘢痕厚度明顯變薄,瘢痕組織中成纖維細(xì)胞密度明顯降低(t=5.413、13.941、23.682,P<0.05);與大黃素高劑量組比較,激活劑組瘢痕組織中成纖維細(xì)胞密度明顯升高(t=8.305,P<0.05),見圖2,表1。

2.3大黃素對大鼠瘢痕組織中膠原纖維密度的影響 對照組大鼠膠原纖維排列較為整齊,數(shù)量較少;與對照組比較,模型組大鼠瘢痕組織中膠原纖維含量較多且排列紊亂,膠原纖維密度明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=26.689,P<0.05);與模型組比較,大黃素低、中、高劑量組大鼠瘢痕組織中膠原纖維含量減少,排列紊亂有一定程度改善,膠原纖維密度明顯降低(t=4.906、10.706、20.171,P<0.05);與大黃素高劑量組比較,激活劑組瘢痕組織中膠原纖維密度明顯升高(t=13.066,P<0.05),見圖3,表1。

Control group; Model group; Emodin low dose group; Emodin medium dose group; Emodin high dose group; Activator group

2.4大黃素對大鼠瘢痕組織中VEGF表達(dá)的影響 與對照組比較,模型組大鼠瘢痕組織中VEGF的蛋白表達(dá)水平明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=24.913,P<0.05);與模型組比較,大黃素低、中、高劑量組大鼠瘢痕組織中VEGF的蛋白表達(dá)水平明顯降低(t=6.491、15.481、23.394,P<0.05);與大黃素高劑量組比較,激活劑組瘢痕組織中VEGF的蛋白表達(dá)水平明顯升高(t=18.524,P<0.05),見圖4,表1。

2.5大黃素對大鼠瘢痕組織中SDF-1α、CXCR4

mRNA水平的影響 與對照組比較,模型組大鼠瘢痕組織中SDF-1α、CXCR4 mRNA表達(dá)水平均明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(tSDF-1α=20.893、tCXCR4=21.659,P<0.05);與模型組比較,大黃素低、中、高劑量組大鼠瘢痕組織中SDF-1α、CXCR4 mRNA表達(dá)水平均明顯降低(tSDF-1α=3.781、8.475、13.537,tCXCR4=3.555、8.406、13.500;P<0.05);與大黃素高劑量組比較,激活劑組瘢痕組織中SDF-1α、CXCR4 mRNA表達(dá)水平均明顯升高(tSDF-1α=8.961、tCXCR4=9.355,P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠瘢痕組織中SDF-1α、CXCR4 mRNA水平的比較

2.6大黃素對大鼠瘢痕組織中TGF-β1、Ang1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、SDF-1α、CXCR4蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較,模型組大鼠瘢痕組織中TGF-β1、Ang1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、SDF-1α、CXCR4蛋白表達(dá)水平均明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(tTGF-β1=25.327、tAng1=25.603、tCOL-Ⅰ=22.862、tCOL-Ⅲ=21.777、tSDF-1α=30.810、tCXCR4=29.255,P<0.05);與模型組比較,大黃素低、中、高劑量組大鼠瘢痕組織中TGF-β1、Ang1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、SDF-1α、CXCR4蛋白表達(dá)水平均明顯降低(tTGF-β1=5.732、12.196、20.170,tAng1=6.706、13.689、22.753,tCOL-Ⅰ=4.782、13.509、20.187,tCOL-Ⅲ=4.609、9.510、15.242,tSDF-1α=5.078、10.689、21.791,tCXCR4=6.466、14.583、28.098;P<0.05);與大黃素高劑量組比較,激活劑組瘢痕組織中TGF-β1、Ang1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、SDF-1α、CXCR4蛋白表達(dá)水平均明顯升高(tTGF-β1=16.147、tAng1=18.714、tCOL-Ⅰ=13.403、tCOL-Ⅲ=13.134、tSDF-1α=12.781、tCXCR4=24.595,P<0.05),見圖5,表3。

表3 各組大鼠瘢痕組織中TGF-β1、Ang1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、SDF-1α、CXCR4蛋白比較

3 討論

HS是燒傷或創(chuàng)傷后最常見的后遺癥之一,高達(dá)70%的燒傷患者會出現(xiàn)這種瘢痕[14]。HS的特征是膠原蛋白大量積累、真皮和表皮增厚、過度的血管生成和成纖維細(xì)胞密度增加[15]。目前的治療方法有激光、手術(shù)、激素、外用藥物等,但療效個體差異較大、易復(fù)發(fā),治療效果均不夠理想[16]。因此,深入研究其發(fā)生機(jī)制、尋求安全有效的治療方法是目前臨床工作的重點。本文中利用恒溫恒壓電熱燙傷儀燒傷大鼠建立HS動物模型并對其研究發(fā)現(xiàn),模型組大鼠皮膚有明顯瘢痕現(xiàn)象,細(xì)胞排列紊亂,膠原含量豐富、血管分布密集、真皮組織中成纖維細(xì)胞密度高、膠原纖維含量較多且排列紊亂,提示HS大鼠模型構(gòu)建成功。

研究表明,VEGF不僅誘導(dǎo)血管生成并促進(jìn)血管再生,而且在增生期瘢痕中高表達(dá),促進(jìn)HS的產(chǎn)生[17]。TGF-β1參與血管生成、成纖維細(xì)胞增殖、膠原蛋白合成和細(xì)胞外基質(zhì)重塑等多種生物學(xué)過程,此外研究發(fā)現(xiàn),TGF-β1 mRNA在HS中高表達(dá),并促進(jìn)HS的形成[18]。COL-Ⅰ與COL-Ⅲ是主要的間質(zhì)膠原蛋白,與肌成纖維細(xì)胞表型和纖維化進(jìn)展密切相關(guān),過度沉積也會促進(jìn)HS形成[19]。Ang1是一種重要的血管生成因子,在調(diào)節(jié)血管生長和保持血管穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用,有研究表明HS與Ang1的表達(dá)相關(guān)[20]。大黃素屬于多酚類化合物,存在于大黃、虎杖、何首烏等多種中草藥中,具有廣泛的藥理活性。研究表明,大黃素通過促進(jìn)抗炎巨噬細(xì)胞極化、增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)合成和肉芽組織形成加速糖尿病傷口愈合[21-22]。大黃素通過抑制VEGF表達(dá),從而抑制乳腺癌、甲狀腺癌中的血管生成[23-24]。此外研究表明,大黃素通過抑制組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2改善阻塞腎臟中的腎小管間質(zhì)纖維化[25]。Xia等[6]研究發(fā)現(xiàn),大黃素可通過抑制巨噬細(xì)胞極化及抑制巨噬細(xì)胞中的Notch和TGF-β途徑來緩解HS的形成。本研究發(fā)現(xiàn),模型組大鼠瘢痕組織中成纖維細(xì)胞密度、膠原纖維密度、VEGF、TGF-β1、Ang1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白表達(dá)水平均升高,大黃素干預(yù)后,不僅促進(jìn)瘢痕愈合,同時還降低了成纖維細(xì)胞密度、膠原纖維密度及VEGF、TGF-β1、Ang1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白表達(dá)水平。提示,大黃素通過抑制血管生成及纖維化,從而抑制瘢痕組織的增生。

趨化因子是參與各種傷口愈合過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,趨化因子途徑由SDF-1α、CXCR4組成,SDF-1α/CXCR4不僅影響細(xì)胞遷移和增殖,而且還影響血管生成。如辛伐他汀聯(lián)合骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)通過SDF-1α/CXCR4途徑改善血管生成,從而改善燒傷創(chuàng)面愈合[26]。SDF-1α/CXCR4信號通過促進(jìn)活化的CD14+CXCR4+細(xì)胞從血流遷移到傷口部位參與HS的發(fā)展[9]。本研究發(fā)現(xiàn),瘢痕組織中SDF-1α、CXCR4 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高,而大黃素可顯著降低SDF-1α、CXCR4 mRNA及蛋白表達(dá)水平,而使用SDF-1α/CXCR4激活劑后,SDF-1α、CXCR4表達(dá)升高,減弱了大黃素對血管生成相關(guān)因子的抑制作用,促進(jìn)瘢痕組織的增生。進(jìn)一步說明大黃素可能通過抑制SDF-1α/CXCR4軸,抑制血管生成,從而抑制HS的形成。

綜上所述,大黃素可能通過抑制SDF-1α/CXCR4軸,抑制血管生成,從而抑制HS的形成。此研究為HS治療提供了新思路。然而本研究尚存在不足之處,僅驗證了大黃素對SDF-1α/CXCR4軸的作用,未對其他靶點、途徑進(jìn)行驗證,后續(xù)研究將會進(jìn)一步明確大黃素在HS動物模型中血管生成的作用機(jī)理。