喬蓬蕾，李玉明，王 謹(jǐn)，曲偉華，于 寶

（1.萊陽市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，山東萊陽 265200；2.萊西市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，山東萊西 266600）

設(shè)施生產(chǎn)規(guī)模化發(fā)展迅速，商品化生產(chǎn)使設(shè)施內(nèi)土地復(fù)種指數(shù)高，因連作嚴(yán)重導(dǎo)致的土壤劣化明顯，嚴(yán)重影響了設(shè)施農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展［1］。黃瓜（Cucumis sativusL.）是保護(hù)地生產(chǎn)中種植面積居首位的蔬菜，因此黃瓜的連作障礙問題越來越受到人們重視［2］。

連作障礙是指同一地塊在正常栽培管理條件下連續(xù)多茬種植同一作物或近緣作物而導(dǎo)致的一系列品質(zhì)變劣、病蟲害加劇、產(chǎn)量降低等生長問題［3］。連作障礙可以通過清潔田園、合理施肥、選用抗性品種、生物防治、填閑和伴生、輪作等措施來緩解［4，5］，但導(dǎo)致連作障礙的主導(dǎo)因素或真正原因暫無定論。學(xué)者們越來越重視從土壤微生物群落及其重要的生理功能角度揭示連作障礙發(fā)生的原因，但對于連作導(dǎo)致的土壤微生物群落變化的認(rèn)識尚不統(tǒng)一。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，連作后土壤菌群結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，有害微生物菌群增加，有益微生物菌群減少［4，6-8］。也有學(xué)者認(rèn)為，微生物能夠通過調(diào)整結(jié)構(gòu)適應(yīng)外部環(huán)境的變化，如形成抑菌土，從而保持長期健康的群落結(jié)構(gòu)［9，10］。本研究利用巢式PCR 變性梯度凝膠電泳（Nested PCR-DGGE）技術(shù)分析黃瓜根際土壤芽孢桿菌、假單胞菌菌群結(jié)構(gòu)不同連作茬次的變化，以期為探討黃瓜連作障礙中發(fā)生微生物變化提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土樣

土樣45 份，取自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)施園藝與蔬菜生理生態(tài)實驗站，分為連作1、3、5、7、9 茬（連作茬次不同），每茬次黃瓜種植后30、40、50 d 的土樣各3 份（即3 次重復(fù)），于-80 ℃冰箱保存。

1.2 變性梯度凝膠電泳分析

1.2.1 土壤總DNA 的提取 用試劑盒Power Soil DNA Isolation Kit（MO BIO Laboratories，CA，USA）提取黃瓜根際土壤總DNA（方法參照說明書）。

1.2.2 PCR 反應(yīng)體系及條件 假單胞菌特異性巢式引物序列如下：PCRPs-for/Ps-rev（GGTCTGAGAGG ATGATCAGT/TTAGCTCCACCTCGCGGC）、338f-GC/518r （CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGG GGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG/ATTACCGCGGCTGCTGG）［11，12］。

第一輪反應(yīng)：4 μL 模板，25 μL PCR Mix（Tian-Gen），各20 μL 去離子水，引物各0.5 μL，反應(yīng)體系50 μL。反應(yīng)采用降落PCR，95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，66 ℃至56 ℃每個循環(huán)降0.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，20 個循 環(huán)；95 ℃變性50 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，15 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。選取3 μL 反應(yīng)產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠（1%）進(jìn)行電泳檢測（擴(kuò)增片段長度約為960 bp）。

第 二 輪 反 應(yīng)：5 μL 10×Buffer，4 μL dNTPs（2.5 mmol/L），4 μL Mg2+（25 mmol/L），引物各1 μL，1 μL Taq 酶（TianGen），1 μL 模板，33 μL 去離子水，反應(yīng)體系50 μL。條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸50 s，32 個循環(huán)；最后72 ℃延伸15 min。取3 μL 用瓊脂糖凝膠（1%）進(jìn)行電泳檢測（擴(kuò)增片段長度為240 bp 左右）。

芽孢桿菌特異性巢式引物序列如下：BacF/1378R（GGGAAACCGGGGCTAATACCGGAT/CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAAC）、968F-GC/1378R（CG CCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCA CGGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC/CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG）［13］。

第一輪反應(yīng)：4 μL 模板，25 μL PCR Mix（Tian-Gen），引物各1 μL，19 μL去離子水，反應(yīng)體系50 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，65 ℃退火1.5 min，72 ℃延伸1.5 min，26 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取3 μL 用瓊脂糖凝膠（1%）進(jìn)行電泳檢測（擴(kuò)增片段長度約1 300 bp）。

第二輪反應(yīng)：4 μL 模板，25 μL PCR Mix（Tian-Gen），引物各0.5 μL，20 μL 去離子水，反應(yīng)體系50 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，69 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，2 個循環(huán)；94 ℃變性1 min，67 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，2 個循環(huán)；94 ℃變性1 min，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，2 個循環(huán)；94 ℃變性1 min，63 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，22 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取3 μL 用瓊脂糖凝膠（1%）進(jìn)行電泳檢測（擴(kuò)增片段長度約為445 bp）。

1.2.3 變性膠的制備 制備8%的聚丙烯酰胺凝膠，從膠上方向下方變性劑濃度依次遞增，100%變性劑為40%去離子甲酰胺和7 mol/L 尿素混合物，芽孢桿菌及假單胞菌的變性劑濃度分別為45%～65%和40%～75%。待膠完全凝固后在每孔的上樣量為15 μL，用夾子將膠板夾好，放入裝有緩沖液的電泳槽中。利用Bio-Rad 公司的D-code System 儀器進(jìn)行電泳，時間12 h，溫度60 ℃，電壓70 V，卸下凝膠用Gelred 染色20～30 min，蒸餾水洗滌5 min，使用Canoco for Windows 5、BIO-RAD 的凝膠成像分析系統(tǒng)和Quantity One 軟件進(jìn)行分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析處理

用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理分析，用Biodap軟件進(jìn)行多樣性指數(shù)分析，用SAS 9.1.3 軟件進(jìn)行方差分析，用Canoco for Windows 4.5 軟件進(jìn)行主成分分析，用Bio-Rad Quantity one 4.5 軟件對DGGE 指紋圖譜進(jìn)行數(shù)字化、標(biāo)準(zhǔn)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜連作對根際土壤芽孢桿菌群落結(jié)構(gòu)的影響

2.1.1 芽孢桿菌菌群結(jié)構(gòu)的DGGE 圖譜及主成分分析 種植后30 d，各茬次間條帶沒有明顯差異（圖1a）；5 茬散點與其他各茬距離較遠(yuǎn)（圖1b）。

圖1 黃瓜種植后30 d 不同連作茬次芽孢桿菌菌群結(jié)構(gòu)DGGE 圖譜（a）、主成分分析（b）

種植后40 d，各茬次間條帶無明顯差異（圖2a）；5、7 茬的散點距離較近，而與其他茬次距離相對較遠(yuǎn)（圖2b）。

種植后50 d，各茬次間條帶沒有明顯差異（圖3a）；7茬散點與其他茬次距離較遠(yuǎn)（圖3b）。

圖3 黃瓜種植后50 d 不同連作茬次土壤芽孢桿菌菌群結(jié)構(gòu)DGGE 圖譜（a）、主成分分析（b）

2.1.2 芽孢桿菌DGGE 圖譜的條帶數(shù)和多樣性指數(shù)分析 條帶數(shù)1 茬在種植后30 d 顯著高于其他茬次，1 茬的均勻度指數(shù)和香農(nóng)多樣性指數(shù)顯著高于9 茬（表1）；種植后40 d，5 茬條帶數(shù)顯著高于其他茬次，而7 茬條帶數(shù)顯著高于1、3、9 茬，9 茬條帶數(shù)顯著高于1、3 茬，均勻度指數(shù)和香農(nóng)多樣性指數(shù)5、7 茬顯著高于1 茬。種植后50 d，香農(nóng)多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)、條帶數(shù)各茬次之間差異均未達(dá)到顯著水平（P＞0.05）。

2.2 黃瓜連作對根際土壤假單胞菌菌群結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 假單胞菌菌群結(jié)構(gòu)的DGGE 圖譜及主成分分析 種植后30 d，上部和下部無明顯差異，中部各茬次間可以看出差異（圖4a）。5 茬的散點離其他各茬較遠(yuǎn)（圖4b）。

圖4 黃瓜種植后30 d 不同連作茬次假單胞菌菌群結(jié)構(gòu)的DGGE 圖譜（a）、主成分分析（b）

種植后40 d，7 茬條帶與其他各茬次有明顯差異（圖5a）。3、7茬的散點距離其他各茬較遠(yuǎn)（圖5b）。

圖5 黃瓜種植后40 d 不同連作茬次假單胞菌菌群結(jié)構(gòu)的DGGE 圖譜（a）、主成分分析（b）

種植后50 d，各茬之間條帶差異明顯（圖6a）。主成分分析能夠區(qū)分開各茬次，1、7 茬的散點與其他各茬距離相對較遠(yuǎn)（圖6b）。

圖6 黃瓜種植后50 d 不同連作茬次假單胞菌菌群結(jié)構(gòu)的DGGE 圖譜（a）、主成分分析（b）

2.2.2 假單胞菌DGGE 圖譜的條帶數(shù)和多樣性指數(shù)分析 種植后30 d，條帶數(shù)5、7茬顯著高于3茬（表2），香農(nóng)多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)5 茬均顯著高于3 茬。種植后40 d，條帶數(shù)7 茬顯著高于1、3、9 茬，而5 茬與其他各茬之間差異均不顯著；均勻度指數(shù)、香農(nóng)多樣性指數(shù)7 茬顯著高于其他茬次。種植后50 d，5茬的條帶數(shù)顯著低于除3 茬外的其他茬次，3 茬的條帶數(shù)顯著低于7 茬，香農(nóng)多樣性指數(shù)7 茬顯著高于3茬和5 茬；7 茬均勻度指數(shù)顯著高于3 茬（P＜0.05）。

表2 黃瓜連作對土壤假單胞菌多樣性指數(shù)和DGGE 圖譜條帶數(shù)的影響

3 小結(jié)與討論

連作會導(dǎo)致土壤中根際生態(tài)環(huán)境惡化，拮抗菌的菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，有害菌株增加，而有益菌株減少［14，15］。有研究表明，連作可能沒有持續(xù)破壞微生物群落結(jié)構(gòu)，長期連作促進(jìn)了抑菌土的形成［16］。試驗選用Nested PCR-DGGE 技術(shù)研究了黃瓜連作后土壤假單胞菌菌群、芽孢桿菌結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明，在5、7 茬主成分分析顯示菌群結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出不同，多樣性較高。已有研究顯示，7 茬黃瓜出現(xiàn)明顯的生長障礙［17］，到9 茬又有所好轉(zhuǎn)。隨著連作茬次的增加，當(dāng)土壤中病原菌達(dá)到一定量后，作物會通過調(diào)整根系分泌物來增加有益微生物的數(shù)量，從而抑制病原菌［9，10］，所以當(dāng)7 茬出現(xiàn)明顯連作障礙后，黃瓜根際土壤中芽孢桿菌、假單胞菌多樣性開始升高，群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出不同。在黃瓜種植后3 個時期，芽孢桿菌的條帶數(shù)沒有明顯一致的變化規(guī)律。胡元森等［18］研究表明，黃瓜不同生長時期條帶數(shù)目穩(wěn)定，農(nóng)田微生物區(qū)系組成穩(wěn)定；但霍琳等［19］認(rèn)為，黃瓜不同生長時期土壤中微生物數(shù)量的變化趨勢不同。試驗結(jié)果與之一致，黃瓜不同生育期之間，隨著連作茬次的增加，假單胞菌多樣性的變化趨勢不同，芽孢桿菌亦是如此。受外界因素刺激，植物可以通過改變其根系分泌物的含量及組分對根際微生物產(chǎn)生不同的影響。植物可以分泌特定的根系分泌物來選擇根際周圍的微生物，黃瓜在不同生育期假單胞菌及芽孢桿菌的多樣性水平及菌群結(jié)構(gòu)變化趨勢不同，可能與黃瓜生長過程中根系活力及其根系分泌物變化有關(guān)［20，21］。

用Nested PCR-DGGE 方法探索黃瓜連作對根際土壤微生物菌群的影響，結(jié)果表明，芽孢桿菌菌群、假單胞菌菌群的結(jié)構(gòu)被改變了，但黃瓜不同生育期，菌群結(jié)構(gòu)及多樣性變化不同，主要表現(xiàn)為5、7 茬與其他茬次不同。假單胞菌和芽孢桿菌主要在5、7茬表現(xiàn)出較高的多樣性，說明黃瓜連作并沒有持續(xù)破壞微生物群落結(jié)構(gòu)。通過進(jìn)一步研究連作條件下根系分泌物變化對土壤微生物活性和功能的影響，對解決連作障礙具有重要意義。