鄭奔容 江博雄 王一娜 楊茂生 梁亞樂 王玉娥
皮脂腺癌(SC)是一種罕見的、具有侵襲性的皮膚惡性腫瘤,好發(fā)于老年人,常表現(xiàn)為紅色結(jié)節(jié)或者斑塊,有時可出現(xiàn)潰瘍,偶爾呈淡黃色。據(jù)報道,SC 的常見部位為眼瞼、面部、頭皮等處。按生長部位,SC 可分為眼周的SC 和眼外的SC,其中眼外SC 有不足2%發(fā)生于腮腺[1]。1953 年,F(xiàn)oote和Frazell 在一篇唾液腺腫瘤綜述中首次報道了一例皮脂腺腺瘤(SA)。6 年后,Rauch 和Masshoff報道了腮腺中的SC。截至2022 年12 月,外文文獻共報道了35 例腮腺SC 和10 例腮腺SA[2-3]。由于其罕見性,腮腺SC 的臨床病理特征和組織發(fā)生尚未完全闡明,而對于相關(guān)基因突變目前國內(nèi)外報道較少。本文對一例腮腺SC 進行了腫瘤的全外顯子組測序,由于腮腺SA 更加罕見,本研究選擇了同為眼外皮脂腺良性腫瘤的頭皮SA 樣本作為對照,檢測全外顯子組基因突變在兩者中的差異變化,從而初步探討腮腺SC 發(fā)生的可能機制及治療的靶點。
病例1 患者女,89 歲。因發(fā)現(xiàn)耳后腫物2 年于2022 年9 月至中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院門診就診。彩色多普勒超聲(彩超)檢查提示右側(cè)腮腺內(nèi)實性腫物,腫物大小約4.0 cm×4.0 cm×3.5 cm,考慮惡性腫瘤性病變。手術(shù)切除腫物后行病理學(xué)活組織檢查(活檢),診斷為腮腺SC。
病例2 患者女,51 歲。因發(fā)現(xiàn)頭皮腫物5 年于2020 年6 月至中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院門診就診。通過詳細有全身檢查,排除頭皮外其他部位的腫瘤。體格檢查可見頭皮隆起型腫物,腫物大小約2.5 cm×2.0 cm×1.5 cm,邊界欠清,質(zhì)硬。手術(shù)切除腫物后行活檢,診斷為SA。
本研究方案經(jīng)中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會批準(批件號:中大附三醫(yī)倫RG2023-117-01),患者均已簽署知情同意書。
1.取 樣
切取石蠟標本中的腫瘤及瘤旁組織或瘤旁組織,體積約0.3 cm×0.3 cm×0.3 cm。
2.DNA 的提取及建庫
提取石蠟包埋組織的DNA,用Qubit 對DNA濃度進行定量,以O(shè)D 值在1.8~2.0,DNA 含量>1.0 μg 為建庫的標準。將符合標準的DNA 進行建庫,具體操作同文獻[4] 。
3.數(shù)據(jù)處理及分析
篩選用于后續(xù)信息分析的高質(zhì)量讀序(clean reads),使用BWA 軟件將clean reads 比對至人的參考基因組上,并通過Samtools 軟件處理,得到bam 文件,再用picard 軟件去除PCR 導(dǎo)致的重復(fù)reads,然后使用GATK 進行矯正;之后基于比對結(jié)果,使用基因組分析工具箱(GATK)軟件檢測單核苷酸位點變異(SNV)及長度小于50 bp 的插入和缺失(InDel),最后使用ANNOVAR 軟件對突變結(jié)果進行詳細注釋。
4.篩選高頻基因和驅(qū)動基因
去除位于Intron、UTR、IGR、RNA、Flank 的SNP 位點以及位于目標區(qū)域(突變function 為“.”或“unkown”)的InDel,利用MutSigCV 軟件篩選出高頻基因,同時參考文獻[4]比較體細胞變異與已知驅(qū)動基因,篩選出該腫瘤樣本中的已知驅(qū)動基因,具體操作同文獻[5] 。
5.腫瘤異質(zhì)性及亞克隆分析
利用SciClone 軟件將2 例腫瘤標本的變異等位基因頻率(VAF)及拷貝數(shù)變異(CNV)的拷貝數(shù)作為輸入文件,通過識別體細胞突變的數(shù)量及分析亞克隆的組成,追蹤亞克隆進化,得到每例腫瘤樣本的克隆性圖譜信息。
病例1 腫瘤呈浸潤性生長,腫瘤細胞排列成大的巢團狀,部分巢團中央可見壞死,巢團周邊腫瘤細胞多呈基底細胞樣,核質(zhì)比高,細胞異型性明顯,中央見散在體積較大、胞質(zhì)呈多空泡狀的皮脂腺分化細胞,符合SC。見圖1。
病例2 腫瘤邊界清楚,由基底樣細胞和成熟的皮脂腺細胞構(gòu)成,基底樣細胞大小形態(tài)較一致,細胞核呈卵圓形,可見小核仁,成熟皮脂腺細胞胞質(zhì)豐富、呈多空泡狀,細胞異型性不明顯,未見確切核分裂及壞死,符合SA。見圖2。
圖1 一例腮腺SC 組織的HE 染色結(jié)果
圖2 一例頭皮SA 組織的HE 染色結(jié)果
腮腺SC 及其癌旁組織、頭皮SA 及其瘤旁組織的測序數(shù)據(jù)與參考基因組比對的結(jié)果均達到要求,與參考基因組比對能達到 94%以上的比對率;平均100 倍測序深度時10 倍以上覆蓋度達到95%以上,見表1。腮腺SC 組織的SNV 數(shù)目為2012,頭皮SA 組織的SNV 數(shù)目為205,腮腺SC 組織的SNV 數(shù)目約為頭皮SA 組織的10 倍。腮腺SC 組織中的SNV 僅新發(fā)突變(未注釋上千人基因組或dbSNP 數(shù)據(jù)庫)數(shù)目為1 495(占75%),頭皮SA新發(fā)突變數(shù)目僅178(占86%),見表2。腮腺SC組織的SNV 類型(圖3)多于頭皮SA 組織(檢測結(jié)果見文獻[5] )。腮腺SC 組織、頭皮SA 的InDel數(shù)目分別為2017、50,新發(fā)突變數(shù)目為1 070、50。而CNV 的結(jié)果則分別為92 和90。
表1 全外顯子測序結(jié)果數(shù)據(jù)比對統(tǒng)計情況總覽
表2 驅(qū)動基因突變篩選結(jié)果
圖3 一例腮腺SC 的體細胞突變信息整合環(huán)狀圖
體細胞突變的數(shù)量及VAF 顯示腮腺SC 和頭皮SA 的亞克隆模式是有差異的,并且腫瘤倍性也不一致,腮腺SC 的多拷貝變異數(shù)量(圖4)多于頭皮SA 組織(檢測結(jié)果見文獻[5])。在腮腺SC組織中還發(fā)現(xiàn)不同于頭皮SA 的57 個驅(qū)動基因突變,包括ABL1、β-肌動蛋白(ACTB)、異常紡錘體樣小頭畸形相關(guān)蛋白(ASPM)、鋅指同源框3(ZFHX3)和細胞核受體輔激活物基因(NCOA3)等基因。
雖然SC 的病因未明,但研究表明其可能與DNA 錯配修復(fù)(MMR)異常有關(guān)[5]?;蛲蛔儗?dǎo)致癌基因激活、抑癌基因失活,部分正常細胞的生長、分化出現(xiàn)異常,出現(xiàn)惡性失控從而形成惡性腫瘤。已報道的有關(guān)SC 基因突變多集中在眼部,針對眼部SC 的全外顯子組測序分析顯示腫瘤蛋白P53(TP53)、ZNF750、視網(wǎng)膜母細胞瘤基因1(RB1)是最常見的3 個基因突變,而PCDH15 是一種與轉(zhuǎn)移相關(guān)的新突變[6-9]。
圖4 一例腮腺SC 的亞克隆組成圖
目前有關(guān)眼外SC 的基因檢測分析數(shù)據(jù)極其罕見,尤其是腮腺SC 的結(jié)果尚未見報道。本研究通過對腮腺SC 和頭皮SA 進行全外顯子測序分析,發(fā)現(xiàn)腮腺SC 的基因突變總數(shù)和各突變類型均遠遠超過頭皮SA,說明腮腺SC 的基因突變非常活躍。此外,腮腺SC 中發(fā)現(xiàn)有別于頭皮SA 的57 個驅(qū)動基因突變,其中比較明確的癌癥相關(guān)基因 有ABL1、ACTB、ASPM、ZFHX3 和NCOA3 基因等。ABL1 基因是與白血病相關(guān)的原癌基因。當其易位到 22 號染色體長臂上時,會與斷裂點叢集區(qū)(BCR)基因發(fā)生融合從而形成 BCR-ABL 融合基因,該基因編碼的BCR-ABL 融合蛋白持續(xù)性活化,導(dǎo)致了白血?。?0]。ABL1 激酶在實體瘤中的活化并不是因為發(fā)生染色體易位形成BCR-ABL 融合蛋白,而是由于 ABL1 激酶表達上調(diào)或ABL1 蛋白的上游激酶活化從而提高了 ABL1 的酪氨酸激酶活性。ACTB 被廣泛用于量化腫瘤表達水平。然而,ACTB 聚合與ACTB 細胞骨架形成的驅(qū)動細胞突起和細胞運動參與了癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移[11]。ASPM 基因位于人類1 號染色體,ASPM 在多種癌癥中異常表達,且與肝癌、卵巢癌、肺腺癌、胰腺癌和膀胱癌等多種惡性腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)[12-14]。其缺失會影響細胞有絲分裂、分裂方向和分化方式,造成DNA 損傷增加和細胞凋亡。ZFHX3 作為非小細胞肺癌免疫檢查點阻斷的生物標志物,是已知的原癌基因,也是基底細胞癌相關(guān)基因[15-16]。NCOA3基因與癌癥相關(guān),其體細胞基因拷貝數(shù)發(fā)生變化可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化,從而導(dǎo)致乳腺癌和胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展。
頭頸部腫瘤的發(fā)展是一個綜合作用的結(jié)果,多種基因的突變相互作用,相互促進,形成了惡性循環(huán)。腫瘤異質(zhì)性即腫瘤組織內(nèi)部不同的腫瘤細胞或亞群中體細胞突變不完全相同。大部分的腫瘤存在亞克隆,而亞克隆突變與耐藥性相關(guān)。分析腫瘤的克隆結(jié)構(gòu)有利于揭示腫瘤組織的異質(zhì)性。分析腫瘤異質(zhì)性和克隆結(jié)構(gòu)有助于研究腫瘤的發(fā)展、進化、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)以及藥物反應(yīng)等。本研究中,腮腺SC 的腫瘤異質(zhì)性較頭皮SA 高,亞克隆多。本研究在腮腺SC 中發(fā)現(xiàn)了ABL1 基因的突變,而針對ABL1 突變發(fā)生的腫瘤,臨床有潛在作用的治療藥物包括伊馬替尼、達沙替尼、尼洛替尼、波蘇替尼、泊那替尼等。
綜上所述,腮腺SC 具有不同于良性腫瘤的基因突變及突變的模式。但本研究樣本量有限,進一步的研究需要更多的樣本進行相關(guān)基因突變的驗證。