宋光玉 鐘云青 吳思沁 宋坤珊 黃沛鑫 滕松杏

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西南寧 530201）

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一種常見(jiàn)的氣道炎癥性疾?。?］。在炎癥因子激活下，巨噬細(xì)胞極化參與了COPD 炎癥的全過(guò)程。通過(guò)靶向干預(yù)巨噬細(xì)胞極化，使其從促炎的M1 型轉(zhuǎn)化為抗炎的M2 型，可能成為COPD 治療的新策略［2］。本實(shí)驗(yàn)建立COPD（痰熱壅肺證）大鼠模型，以款冬花散進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)對(duì)肺泡灌洗液（BALF）炎癥指標(biāo)的檢測(cè)及肺組織HE 病理改變，研究款冬花散對(duì)NLRP3 下游因子白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素-18（IL-18）水平的影響，并對(duì)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、CD10 水平進(jìn)行定量檢測(cè)，研究款冬花散對(duì)肺巨噬細(xì)胞極化的影響。此外，探討TLR4/NF-κB/NLRP3 通路在COPD 大鼠肺巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中的作用，以闡明款冬花散的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)SD 大鼠48 只，雄性，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)買于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

款冬花散：款冬花15 g，紫菀10 g，白術(shù)10 g，浙貝母10 g，蜜麻黃10 g，生石膏30 g（先煎代水），前胡12 g，桑白皮10 g，旋覆花10 g（包煎），甘草6 g。購(gòu)自北京同仁堂醫(yī)藥藥材有限公司，由中藥房煎煮，在-70 ℃下制成凍干粉，使用前生藥與0.9%氯化鈉注射液按1 g∶1 mL 配制。羅紅霉素膠囊，江蘇揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H10970291。

1.3 試劑與儀器

大鼠IL-1β ELISA 試劑盒、大鼠IL-18 ELISA 試劑盒、大鼠iNOS ELISA 試劑盒、大鼠CD10 ELISA 試劑盒均購(gòu)自江蘇酶免。TLR4 小鼠單克隆抗體（Santa Cruz公司），NF-κB 小鼠單克隆抗體（Santa Cruz 公司），NLRP3 兔單克隆抗體（Abcam 公司）。5515R 冷凍離心機(jī)（德國(guó)OHAUS 公司），NANo DROP 8000 紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo公司），DYY-6C凝膠電泳儀（北京六一生物科技公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-RAD公司），GeneAmp 9700PCR 擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI 公司），StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）。

1.4 模型制備

大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、羅紅霉素組和款冬花散低、中、高劑量組，每組8 只，共6 組。運(yùn)用LPS 加煙熏聯(lián)合制備建立痰熱壅肺證大鼠模型［3］，大鼠造模第1 天、第14 天配制LPS 2 g/mL，無(wú)菌操作下將200 μg LPS（055：B5，Sigma 公司）注射進(jìn)大鼠氣管，搖晃大鼠使LPS 均勻進(jìn)入肺部。造模第2 天至造模第30 天（第14 天除外）將大鼠置于煙熏染毒環(huán)境中（硫黃10 g，煙葉50 g，鋸末適量點(diǎn)燃），每天上、下午各1 h，每周休息1 d。痰熱壅肺證模型：第26天氣管滴LPS 1次［4］。

1.5 給藥方法

建模成功后按照人與動(dòng)物等效劑量換算灌胃［5］。羅紅霉素組給予羅紅霉素5 mg/（kg·d），款冬花散低、中、高劑量組分別予款冬花散5.57、11.14、22.28 mL/（kg·d），模型組、空白組予等量0.9%氯化鈉注射液，持續(xù)14 d。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.6.1 肺組織病理形態(tài)改變 4%多聚甲醛緩沖液固定肺組織24 h 后，進(jìn)行脫蠟、染色、脫水、透明和封固，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6.2 BALF中IL-1β、IL-18含量 ELISA法檢測(cè)大鼠BALF中IL-1β、IL-18含量，按說(shuō)明書(shū)操作。

1.6.3 肺組織iNOS、CD10 含量 稱取右肺中葉組織200 mg，加4 ℃0.9%氯化鈉注射液1 mL，勻漿后冰上靜置15 min，轉(zhuǎn)入離心管中4 ℃下4 000 r/min離心15 min，采用ELISA按說(shuō)明書(shū)對(duì)上清液作iNOS、CD10測(cè)定。

1.6.4 肺組織Toll 樣受體4（TLR4）、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）、NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）mRNA 表達(dá) 取50 mg 肺組織于EP 管中，加入1 mL Trizol 剪碎，震蕩混勻，4 ℃12 000 r/min 離心10 min，取上層無(wú)色水相移入另一EP管中，加入等體積異丙醇，震蕩后插入冰中20～30 min，4 ℃12 000 r/min離心10 min，棄上清，加75%乙醇1 mL 震蕩，4 ℃12 000 r/min 離心10 min，棄上清液，揮發(fā)完酒精，加入15～20 μL DEPC 水溶解RNA，震蕩混勻后測(cè)定RNA 純度和濃度，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得檢測(cè)基因表達(dá)。引物由天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成，引物信息如下。TLR4 上游：5'-TGAAACATCAGAGGAAGAACAA-3' ，下游：5'-GTCCACAGCAGAAACCCAG-3'，產(chǎn)物大小124 bp。NF-κB 上游：5'-GCTATAACTCGCCTGGTGACA-3'，下游：5'-CCGCAATGGAGGAGAAGT CTT-3'，產(chǎn)物大小118 bp。NLRP3 上游：5'-GACCTCCAAGACCACGACTG-3'，下游：5'-ATCCGCAGCCAA TGAACAGA-3'，產(chǎn)物大小124 bp。GAPDH 上游：5'-GCAAGTTCA ACGGCACAG-3'，下游：5'-CGCCAGTA GACTCCACGAC-3'，產(chǎn)物大小141 bp。提取循環(huán)結(jié)束后的ΔCt值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.6.5 肺組織TLR4、NF-κB、NLRP3 蛋白表達(dá) 肺組織石蠟切片置于烤箱烘片，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，用3%H2O2去除滅活內(nèi)源性過(guò)氧化酶的活性，微波抗原修復(fù)，羊血清工作液封閉，一抗4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，PBS 沖洗，二抗37 ℃孵育1 h，PBS 沖洗，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，PBS 沖洗，切片DAB 顯色，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、中性樹(shù)膠封片、鏡檢。采圖后使用Image-Pro Plus 5.0 軟件進(jìn)行半定量分析，計(jì)算陽(yáng)染的積分光密度值（IOD）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，多重組間比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況及生物學(xué)特征

空白組大鼠一般情況良好，活動(dòng)反應(yīng)可，呼吸順暢，攝入正常，毛發(fā)柔順有光澤。模型組大鼠活動(dòng)減少，急躁易激惹，毛發(fā)枯槁，進(jìn)食減少，呼吸喘促，聞及間歇性咳喘或氣道痰鳴音，氣道中見(jiàn)黃色分泌物；經(jīng)羅紅霉素和款冬花散干預(yù)后，大鼠一般情況及生物學(xué)特征均有所好轉(zhuǎn)。

2.2 各組大鼠肺組織病理形態(tài)改變

空白組大鼠支氣管壁結(jié)構(gòu)完整，肺組織少許炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)明顯肺泡破壞及黏膜水腫。相對(duì)空白組，模型組大鼠支氣管壁明顯增厚，肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)加重，黏膜充血水腫，肺泡壁變薄，部分肺大泡形成。羅紅霉素組與款冬花散組大鼠肺組織病理形態(tài)均較模型組改善。見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠肺組織病理形態(tài)改變（HE染色，100倍）

2.3 各組大鼠BALF中IL-1β、IL-18含量比較

見(jiàn)表1。與空白組比較，模型組大鼠BALF 中IL-1β 和IL-18 的含量升高（P＜0.01）；與模型組比較，各治療組BALF 中IL-1β 和IL-18 的含量均下降（P＜0.01）。

表1 各組大鼠BALF中IL-1β、IL-18含量比較（ng/L，±s）

表1 各組大鼠BALF中IL-1β、IL-18含量比較（ng/L，±s）

注：與空白組比較，*P ＜0.05，* *P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01；與羅紅霉素組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與款冬花散低劑量組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；與款冬花散中劑量組比較，◆P ＜0.05，◆◆P ＜0.01。下同。

IL-18 156.38±7.15 195.93±6.52**163.40±5.31*##180.93±5.67**##△△176.36±5.86**##△△171.61±5.79**##△△▲▲組 別空白組模型組羅紅霉素組款冬花散低劑量組款冬花散中劑量組款冬花散高劑量組n8 8 8 8 8 8 IL-1β 42.85±1.50 52.98±1.96**46.82±16.1**##49.92±2.85**##△△49.57±1.73**##△△48.27±1.04**##

2.4 各組大鼠肺組織iNOS、CD10含量比較

見(jiàn)表2。與空白組比較，模型組大鼠肺組織iNOS含量升高（P＜0.01）；與模型組比較，羅紅霉素組及款冬花散中、高劑量組大鼠肺組織iNOS 含量下降（P＜0.05 或P＜0.01）。與空白組比較，模型組大鼠肺組織CD10 含量下降（P＜0.01）；與模型組比較，羅紅霉素組及款冬花散低、中、高劑量組大鼠肺組織CD10 含量升高（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各組大鼠肺組織iNOS、CD10含量比較（±s）

表2 各組大鼠肺組織iNOS、CD10含量比較（±s）

組 別空白組模型組羅紅霉素組款冬花散低劑量組款冬花散中劑量組款冬花散高劑量組n8 8 8 8 8 8 iNOS（μmol/L）11.53±0.40 13.94±0.65**11.88±0.36##13.65±0.58**△△13.40±0.46**#△△12.73±0.49**##△△▲▲◆CD10（ng/L）1 527.81±49.20 1 308.03±56.09**1 527.48±60.88##1 365.27±59.48**#△△1 441.08±48.44**##△△▲▲1 499.14±51.06##▲▲◆

2.5 各組大鼠肺組織TLR4、NF-κB、NLRP3 mRNA 表達(dá)比較

見(jiàn)表3。與空白組比較，模型組TLR4 mRNA 表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，羅紅霉素組及款冬花散中、高劑量組TLR4 mRNA 表達(dá)下降（P＜0.05 或P＜0.01）。與空白組比較，模型組NF-κB mRNA 表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，羅紅霉素組及款冬花散各劑量組NF-κB mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01）。與空白組比較，模型組NLRP3 mRNA 表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，羅紅霉素組及款冬花散中、高劑量組NLRP3 mRNA表達(dá)降低（P＜0.01）。

表3 各組大鼠肺組織TLR4、NF-κB、NLRP3 mRNA表達(dá)比較（±s）

表3 各組大鼠肺組織TLR4、NF-κB、NLRP3 mRNA表達(dá)比較（±s）

組 別空白組模型組羅紅霉素組款冬花散低劑量組款冬花散中劑量組款冬花散高劑量組n8 8 8 8 8 8 TLR4 1.00±0.07 2.85±0.33**1.47±0.35##2.63±0.22**△△2.36±0.10**#△△2.07±0.34**##△▲NF-κB 1.03±0.37 8.52±0.94**4.10±0.87**##6.63±0.73**##△△6.41±0.65**##△△5.24±0.18**##NLRP3 1.03±0.32 1.86±0.11**1.14±0.20##1.65±0.28*△△1.25±0.26##1.22±0.27##

2.6 各組大鼠肺組織TLR4、NF-κB、NLRP3 蛋白表達(dá)比較

見(jiàn)表4，圖2～圖4。與空白組比較，模型組TLR4蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，羅紅霉素組和款冬花散中、高劑量組TLR4 蛋白表達(dá)下降（P＜0.05，P＜0.01）。與空白組比較，模型組NF-κB 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，羅紅霉素組和款冬花散中、高劑量組NF-κB蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）。與空白組比較，模型組NLRP3 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，羅紅霉素組和款冬花散高劑量組NLRP3 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）。

表4 各組大鼠肺組織TLR4、NF-κB、NLRP3蛋白表達(dá)的比較（±s）

表4 各組大鼠肺組織TLR4、NF-κB、NLRP3蛋白表達(dá)的比較（±s）

組 別空白組模型組羅紅霉素組款冬花散低劑量組款冬花散中劑量組款冬花散高劑量組n8 8 8 8 8 8 TLR4 12.25±3.50 26.75±2.68**12.77±5.67##21.57±5.01**△19.04±4.23##14.16±2.75#▲NF-κB 10.23±1.16 29.22±5.49**11.60±5.40##22.04±3.51**△18.49±5.57*##16.46±1.70##NLRP3 17.20±4.21 31.91±3.02**18.24±4.04##29.97±2.24*△△24.39±6.00 22.49±5.49##

圖2 各組大鼠肺組織TLR4蛋白表達(dá)（免疫組化，400倍）

圖3 各組大鼠肺組織NF-κB蛋白表達(dá)（免疫組化，400倍）

圖4 各組大鼠肺組織NLRP3蛋白表達(dá)（免疫組化，400倍）

3 討 論

有研究表明，我國(guó)COPD 患病率高達(dá)13.7%（40 歲及以上），至2060年預(yù)估將導(dǎo)致540萬(wàn)人死亡［6］。中醫(yī)學(xué)將COPD 歸入“肺脹”范疇，其最常見(jiàn)中醫(yī)證型為痰熱壅肺證，治療應(yīng)清熱化痰［7］。本研究所用款冬花散源于《婦人大全良方》，具有清熱化痰、平喘止咳之功效［8］。在實(shí)驗(yàn)前期通過(guò)臨床研究和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，均驗(yàn)證了款冬花散對(duì)支氣管擴(kuò)張癥等氣道炎癥性疾病有一定的干預(yù)作用［9-11］。

炎癥機(jī)制是COPD的關(guān)鍵機(jī)制，吸煙是COPD重要的發(fā)病因素。香煙的煙霧會(huì)激活巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，使其釋放IL-1β、IL-18 等炎性介質(zhì)［12-13］。巨噬細(xì)胞在微環(huán)境刺激下會(huì)極化為M1 型和M2 型，且兩種巨噬細(xì)胞在特定條件下可以相互轉(zhuǎn)化。M1 型巨噬細(xì)胞表面有特征性標(biāo)志物iNOS，M2 型巨噬細(xì)胞有標(biāo)志性蛋白CD10［14］。研究表明，M1 型巨噬細(xì)胞可以促進(jìn)抗原呈遞和肺部炎癥反應(yīng)的強(qiáng)化，M2型巨噬細(xì)胞能參與炎癥反應(yīng)的抑制、肺組織的修復(fù)及重建，通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞極化方向，使巨噬細(xì)胞由促炎的M1型轉(zhuǎn)化為抗炎的M2 型，以改善肺部炎癥反應(yīng)［2］。因此，本研究通過(guò)測(cè)定COPD 大鼠BALF 中IL-1β、IL-18 含量和肺組織iNOS、CD10 水平來(lái)評(píng)估肺部炎癥水平及巨噬細(xì)胞極化情況。

最近研究表明，TLR4可調(diào)節(jié)M1型巨噬細(xì)胞極化、促進(jìn)炎癥反應(yīng)，NF-κB 是調(diào)控促炎反應(yīng)的關(guān)鍵信號(hào)通路，NLRP3 與巨噬細(xì)胞促炎因子的分泌有關(guān)，通過(guò)抑制TLR4/NF-κB/NLRP3通路的表達(dá)，從而抑制M1型巨噬細(xì)胞極化，可能成為調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵策略［15］。故本研究通過(guò)TLR4/NF-κB/NLRP3通路探討款冬花散對(duì)COPD（痰熱壅肺證）巨噬細(xì)胞極化的影響，以闡明款冬花散的作用靶點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，款冬花散對(duì)COPD 模型大鼠的生物學(xué)特征有一定改善作用，在一定程度上能改善肺組織的炎性改變。與空白組相比，模型組大鼠BALF中IL-1β、IL-18 含量升高，而款冬花散組其含量降低，提示款冬花散能在一定程度上抑制BALF 中炎性介質(zhì)的表達(dá)，改善肺部炎癥反應(yīng)程度；模型組大鼠肺組織iNOS 含量增加、CD10 含量降低，而款冬花散組肺組織iNOS 含量降低、CD10 含量升高，提示款冬花散抑制了肺巨噬細(xì)胞M1 型轉(zhuǎn)化，并促進(jìn)向M2 型巨噬細(xì)胞極化；模型組大鼠肺組織TLR4、NF-κB、NLRP3蛋白表達(dá)增加，而款冬花散組其表達(dá)下降，且以高劑量組更明顯，考慮肺部炎癥反應(yīng)的抑制及巨噬細(xì)胞極化過(guò)程與TLR4、NF-κB、NLRP3 蛋白表達(dá)降低有關(guān)。綜上，款冬花散能改善COPD 模型大鼠肺部炎癥反應(yīng)，考慮與款冬花散下調(diào)肺組織TLR4/NF-κB/NLRP3通路的表達(dá)有關(guān)，通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞由促炎的M1 型向抗炎的M2 型轉(zhuǎn)化，調(diào)控巨噬細(xì)胞極化方向，從而緩解炎癥反應(yīng)程度。國(guó)內(nèi)學(xué)者通過(guò)麻杏石甘湯治療肺上皮細(xì)胞損傷-巨噬細(xì)胞極化的級(jí)聯(lián)損傷效應(yīng)的機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)麻杏石甘湯能降低巨噬細(xì)胞IL-1β 的表達(dá)，通過(guò)外泌體抑制NF-κB 表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞M1 型極化，進(jìn)而緩解因炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)所致的急性肺損傷［16］。此研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，提示清熱化痰類中藥能抑制COPD模型大鼠肺巨噬細(xì)胞極化，從而減輕肺部炎癥反應(yīng)。

綜上所述，款冬花散能通過(guò)TLR4/NF-κB/NLRP3通路靶向干預(yù)巨噬細(xì)胞極化，進(jìn)而達(dá)到治療作用。本研究為款冬花散治療COPD（痰熱壅肺證）提供了客觀依據(jù)。但目前巨噬細(xì)胞向M1 型或M2 型極化的重要分子信息對(duì)話尚不明確，有待進(jìn)一步研究。