李小青, 郭 悅, 張 潔, 周澤揚(yáng), 黨曉群

(重慶師范大學(xué), 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長江上游傳粉昆蟲資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(部省共建),重慶市媒介昆蟲重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 401331)

蜜蜂是自然界重要的授粉昆蟲之一,在維持生態(tài)系統(tǒng)平衡和作物授粉方面具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)效應(yīng)(吳杰等, 2014)。昆蟲粘蛋白不僅構(gòu)成了腸道粘液層也是圍食膜的重要組成成分。昆蟲粘蛋白按照其分泌方式及分布部位的不同,可分為與圍食膜相關(guān)的分泌型粘蛋白以及與微絨毛膜相關(guān)的膜結(jié)合粘蛋白(Diasetal., 2018)。盡管不同物種粘蛋白分子量和蛋白質(zhì)序列差異很大,但典型結(jié)構(gòu)均為包含半胱氨酸的2型幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(cysteine-containing type-2 chitin binding domain, ChtBD2)和粘蛋白結(jié)構(gòu)域(mucin domain, MD),MD中富含脯氨酸(Pro)和含有糖基化位點(diǎn)的絲氨酸(Ser)和蘇氨酸(Thr)的組成的聯(lián)重復(fù)序列,MD高度糖基化使圍食膜獲得很強(qiáng)的潤滑性以及對(duì)水解酶的穩(wěn)定性(Kramerovetal., 1996)。目前在昆蟲中發(fā)現(xiàn)了大量粘蛋白和粘蛋白樣蛋白,家蠶Bombyxmori(夏丹丹等, 2015)、黑腹果蠅Drosophilamelanogaster(Syedetal., 2008)和白紋伊蚊Aedesalbopictus(Dengetal., 2020)等昆蟲的粘蛋白主要分布在唾液腺、中腸、馬氏管和圍食膜,在參與調(diào)節(jié)宿主的生長發(fā)育和病原防控中發(fā)揮著重要的生理作用。果蠅粘蛋白基因Muc68E參與了代謝調(diào)節(jié),影響食物吸收效率以及成年果蠅的體型,并對(duì)饑餓和寒冷有一定耐受性,推測這可能是粘蛋白的一種新的功能(Reisetal., 2016)。飛蝗Locustamigratoria粘蛋白基因Lmhemomucin和Lmmucin-12被RNAi后,發(fā)現(xiàn)飛蝗在若蟲向成蟲轉(zhuǎn)變的蛻皮過程中35%～55%的若蟲不能蛻皮并在蛻皮前死亡,表明其對(duì)蝗蟲生存至關(guān)重要。干擾飛蝗粘蛋白LmIIM3后,在飛蝗胃、盲腸和中腸均表現(xiàn)出形態(tài)缺陷以及圍食膜厚度比對(duì)照組更薄,表明LmIIM3參與形成圍食膜(Zhaoetal., 2020)。

目前,有關(guān)粘蛋白在其他昆蟲的發(fā)育、結(jié)構(gòu)和功能方面的研究已有大量積累。然而,對(duì)于蜜蜂中有關(guān)于粘蛋白的研究鮮有報(bào)道。Huang等(2019)研究東方蜜蜂微孢子蟲Nosemacerance時(shí)發(fā)現(xiàn),飼喂靶向東方蜜蜂微孢子蟲基因編碼的Dicer(siRNA-Dicer組)的小干擾RNA阻斷東方蜜蜂微孢子蟲的RNA干擾機(jī)制,可使東方蜜蜂微孢子蟲的量顯著下調(diào),而東方蜜蜂粘蛋白-2(Mucin-2)與未加Dicer小干擾RNA相比呈顯著上調(diào),表明東方蜜蜂微孢子蟲量的減少可能是因?yàn)闁|方蜜蜂增強(qiáng)了自身圍食膜粘液屏障。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),中華蜜蜂囊狀幼蟲病毒(Chinese sacbrood virus, CSBV)感染中華蜜蜂Apisceranacerana后,AcMucin5AC-1被下調(diào)。因此,本研究通過免疫定位和RNAi等技術(shù)對(duì)中華蜜蜂AcMucin5AC-1的生物學(xué)功能進(jìn)行探究,為進(jìn)一步深入解析AcMucin5AC-1蛋白在蜜蜂的生長發(fā)育中的重要功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx與病毒

健康中華蜜蜂幼蟲購自重慶市璧山區(qū)個(gè)體戶蜂農(nóng)養(yǎng)殖場;CSBV病毒粒子由重慶師范大學(xué)資源昆蟲及其病原微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑及儀器

實(shí)驗(yàn)所用的Premix Taq、pMD19-T Vector、Solution Ⅰ連接酶、限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和EcoRⅠ購于TaKaRa公司:EvoScript Universal cDNA Master反轉(zhuǎn)錄試劑盒、FastStart Essential DNA Green Master熒光定量PCR試劑盒購于Roche公司:擴(kuò)增目的基因的引物、大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、表達(dá)菌株Rosetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞、D-果糖、D-葡萄糖和酵母提取物(yeast extract)、瓊脂粉(agar)、氯化鈉(NaCl)、卡那抗生素(Kana)、十二烷基磺酸鈉(SDS)等購于生工生物工程股份有限公司;RIPA裂解液、抗熒光淬滅劑等購于碧云天生物技術(shù)有限公司;氯仿、冰醋酸、甲醇和二甲苯等常用試劑購于重慶化學(xué)試劑有限公司。

熒光定量 PCR 儀(美國 Bio-Rad 公司)、智能人工氣候箱(上海谷寧儀器有限公司)、高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf)、蛋白質(zhì)免疫印跡成像系統(tǒng)(上海培清科技有限公司)、體式解剖顯微鏡(萊卡顯微系統(tǒng)(上海)有限公司)等。

1.3 Mucin5AC生物信息學(xué)分析

Mucin5AC基因序列和蛋白質(zhì)序列下載于NCBI(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/),中華蜜蜂AcMucin5AC的GenBank登錄號(hào)分別為XM_028522949.1, XM_016907334.1, XM_016917484.1, XM_016908527.1, XM_016907334.1, XM_016913703.1, XM_016912343.1, XM_016911427.1和XM_016911428.1;西方蜜蜂A.melliferaMucin5AC的GenBank登錄號(hào)分別為XM_006562291.2, XM_016770836.2, XM_ 026297546.1, XM_026302220.1, XM_026296595.1, XM_006569552.2, XM_006570794.1和XM_ 026295456.1。通過NetPhos 3.1(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)和NetNGlyc 1.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)、NetOGlyc 4.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)預(yù)測磷酸化和糖基化位點(diǎn);通過TMHMM v2.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)、SignalP(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)對(duì)跨膜結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽以及結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測;通過MotifScan(https:∥www.genome.jp/tools/motif/)和WegoLoc(http:∥www.btool.org/WegoLoc)功能基序分析和亞細(xì)胞定位等在線分析軟件分別對(duì)中華蜜蜂和西方蜜蜂Mucin5AC的蛋白質(zhì)序列特征進(jìn)行比較分析。

1.4 AcMucin5AC-1表達(dá)量分析

首先,使用無菌移蟲針從中華蜜蜂巢脾的巢穴中取2日齡幼蟲放至24孔板中,蓋好蓋子后放入人工氣候培養(yǎng)箱中(溫度為35 ℃,濕度為85%);培養(yǎng)24 h后,觀察幼蟲的存活情況;挑選出死亡及沒有活力幼蟲,其余2日齡幼蟲一部分用于收集4日齡時(shí)的中腸和表皮,每種組織來自3頭個(gè)體作為1個(gè)生物學(xué)重復(fù);另一部分用于CSBV接種,分為兩組,一組為飼喂不含CSBV食物的對(duì)照組,另一組飼喂含CSBV食物(107copies/頭),隨后兩組均添加正常食物培養(yǎng);在添食CSBV病毒后的0, 12, 24, 48和72 h時(shí)各取6頭中華蜜蜂幼蟲的中腸,經(jīng)滅菌ddH2O、75%乙醇和DEPC水清洗后,凍存于-80 ℃?zhèn)溆?。其?采用Trizol 法提取總RNA,參照EvoScript Univerrsal cDNA Master試劑盒說明合成cDNA。最后,以中華蜜蜂AcActif基因?yàn)閮?nèi)參基因,并通過qRT-PCR檢測AcMucin5AC-1在4日齡幼蟲中腸和表皮中以及2日齡幼蟲接種CSBV后中腸中的表達(dá)量,用CSBV的結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因的相對(duì)表達(dá)量檢測幼蟲體內(nèi)CSBV的情況,引物序列見表1。使用CFX96TMTouch實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR,反應(yīng)體系: ddH2O 7 μL, Green Master 2×conc. 10 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1 μL, cDNA 1 μL。反應(yīng)程序: 95 ℃預(yù)變性10 min; 95 ℃變性10 s, 56/50 ℃退火10 s, 72 ℃延伸20 s, 熔解曲線65～95 ℃, 增幅0.5 ℃ 5 s, 39個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)以及3次生物學(xué)重復(fù)。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.5 AcMucin5AC-1的原核表達(dá)和多克隆抗體制備

根據(jù)GenBank中AcMucin5AC-1(GenBank登錄號(hào): XM_028667148.1)序列設(shè)計(jì)特異性引物(表1),以1.4節(jié)合成的中華蜜蜂cDNA為模板進(jìn)行體外擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系: cDNA 1 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各0.25 μL, Ex Taq Master Mix 5 μL,ddH2O 6 μL。PCR反應(yīng)程序: 95 ℃預(yù)變性 5 min; 95 ℃變性40 s, 61.8 ℃退火40 s, 72 ℃延伸1 min, 32個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸1 min, 12 ℃保存。通過1%瓊瓊脂糖凝膠電泳分離并回收目的片段,與pMD19-T載體連接后,將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)篩選陽性克隆并提取質(zhì)粒,重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定后,送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行核苷酸測序。測序后的陽性的重組質(zhì)粒pMD19-AcMucin5AC-1亞克隆至pET-28a載體,構(gòu)建pET28a-AcMucin5AC-1轉(zhuǎn)入大腸桿菌RosettaTM(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)。挑取陽性單克隆菌進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。利用親和層析柱純化重組蛋白,操作步驟根據(jù)Ni-NAT Superflow Cartridge蛋白純化柱的說明書進(jìn)行,將純化的AcMucin5AC-1重組蛋白作為抗原免疫云南昆明雌性小鼠,制備多克隆抗體。

1.6 AcMucin5AC-1在中華蜜蜂幼蟲中的表達(dá)及定位分析

采用RIPA裂解法提取中華蜜蜂3-6日齡幼蟲中以及4日齡幼蟲中腸、表皮和圍食膜的總蛋白,利用1.5節(jié)制備的多克隆抗體anti-AcMucin5AC-1-M作為一抗,HRP標(biāo)記的羊抗鼠為二抗進(jìn)行免疫印跡檢測,分析AcMucin5AC-1在上述不同發(fā)育階段和4日齡幼蟲組織中的表達(dá)。取新鮮中華蜜蜂4日齡幼蟲, 4 ℃避光固定于Gluta固定液中,通過包埋劑OTC(optimal cutting temperature compound)包埋幼蟲后,再將包埋的樣品切成厚度5 μm的橫切片,用粘附型破片撈出切片后置于4 ℃保存?zhèn)溆?。通過間接免疫熒光技術(shù),將多克隆抗血清anti-AcMucin5AC-1-M為一抗,Alexa Fluor 488(488-N-羥基琥珀酰亞胺酯)亮綠色熒光染料標(biāo)記的羊抗鼠為二抗,DAPI(4′,6-二脒基-2苯基吲哚)藍(lán)色熒光的DNA染料,進(jìn)行觀察分析AcMucin5AC-1在4日齡幼蟲中的定位。

1.7 AcMucin5AC-1的RNAi和效果檢測

以pMD19-T-EGFP質(zhì)粒和pMD19-T-AcMucin5AC-1質(zhì)粒分別作為EGFP和AcMucin5AC-1的dsRNA體外擴(kuò)增的模板,使用含有T7啟動(dòng)子的特異性引物(表1),利用Promega公司的T7 RiboMAXTMExpress RNAi System合成dsRNAs。參考1.4節(jié)幼蟲培養(yǎng)方法收集2日齡幼蟲設(shè)置兩個(gè)干涉組,一組添加dsEGFP作為對(duì)照組,另一組添加dsAcMucin5AC-1作為實(shí)驗(yàn)組,dsRNA用量為2.0, 1.0和0.5 μg/頭,飼喂12, 24, 48和72 h時(shí)每處理各取6頭活幼蟲,提取中腸RNA并合成cDNA,將cDNA定量到100 ng/μL進(jìn)行qRT-PCR,方法同1.4節(jié),每處理生物學(xué)重復(fù)3次。取最佳干擾條件下的整頭幼蟲制備石蠟切片,通過HE染色后觀察RNAi干擾AcMucin5AC-1后24, 48和72 h時(shí)幼蟲形態(tài)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

利用Bio-Rad CFX Manager軟件內(nèi)置程序2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算(Livak and Schmittgen, 2001) RT-qPCR檢測的基因表達(dá)量,利用GraphPad Prism進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和作圖,使用t檢驗(yàn)進(jìn)行干擾效率和差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 中華蜜蜂和西方蜜蜂的Mucin5AC基因序列

結(jié)合在其他物種中已經(jīng)報(bào)道Mucin特征,對(duì)中華蜜蜂和西方蜜蜂的基因組進(jìn)行檢索和比對(duì),發(fā)現(xiàn)中華蜜蜂基因組和西方蜜蜂基因組中都有8個(gè)Mucin5AC基因。通過生物信息學(xué)分析對(duì)中華蜜蜂和西方蜜蜂Mucin5AC粘蛋白結(jié)構(gòu)域內(nèi)的PTS/TS殘基比例和串聯(lián)重復(fù)序列百分比、O-糖基化百分比、信號(hào)肽、結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了比較分析。結(jié)果表明,中華蜜蜂Mucin5AC氨基酸序列中絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)和脯氨酸(P)占Mucin5AC全長的21%～50%,而西方蜜蜂的為27%～40%。中華蜜蜂中有6個(gè)Mucin5AC(Ac016908527.1, Ac016907334.1, Ac016913703.1, Ac016912343.1, Ac016911427.1和Ac016911428.1),氨基酸序列中S+T/P+T+S含量占整個(gè)蛋白的20%以上,為粘蛋白Mucin5AC,另外3個(gè)Mucin5AC(Ac028522949.1, Ac016907334.1和Ac016917484.1)氨基酸序列中S+T/P+T+S重復(fù)區(qū)含量低于20%,為類粘蛋白(Mucin5AC-like)。西方蜜蜂中的8個(gè)Mucin5AC蛋白,S+T含量均大于20%,即為粘蛋白。中華蜜蜂Mucin5AC的O-糖基化(O-Glyc)占13%～39%,西方蜜蜂的占14%～19%。中華蜜蜂Mucin5AC包含的半胱氨酸數(shù)目在10～51個(gè)之間,西方蜜蜂的在4～27個(gè)之間。中華蜜蜂Mucin5AC特有的重復(fù)序列中T含量較多,西方蜜蜂中S含量較多,暗示中華蜜蜂Mucin5AC的糖基化(O-Glyc)位點(diǎn)多發(fā)生在S,而西方蜜蜂的多發(fā)生在T。

利用SMART預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域,發(fā)現(xiàn)中華蜜蜂中Ac028522949.1, Ac016907334.1和Ac16912343.1具有信號(hào)肽,表明這些是分泌性粘蛋白。Ac028522949.1, Ac016907334.1和Ac016907334.1具有2型的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域ChtBD2和PTS重復(fù)序列,這些ChtBD2內(nèi)均含有保守6個(gè)半胱氨酸,屬于圍食膜因子(Peritrophin-A),預(yù)示這幾個(gè)蛋白可能定位于昆蟲腸道圍食膜。Ac016913703.1, Ac016911427.1和Ac016911428.1含有類胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶(trypsin-like serine protease)活性位點(diǎn)Tryp_SPc結(jié)構(gòu)域。Ac016907334.1含有糖苷水解酶18(O-glycosyl hydrolases18)家族的Glyo18結(jié)構(gòu)域。與中華蜜蜂Mucin5AC相比,西方蜜蜂Mucin5AC氨基酸序列中均不含有ChtBD2和Glyo18結(jié)構(gòu)域; Am006562291.2和Am016770836.2中含有錨蛋白重復(fù)基序(ankyrin repeat, ANK),Am026297546.1和Am006569552.2含有“溴”蛋白結(jié)構(gòu)域(bromo domains, BROMO),可結(jié)合乙酰化賴氨酸殘基存并在相互作用; Am026302220.1具有4個(gè)CysCysHisHisCys(CCHHC)形成的環(huán)型鋅指結(jié)構(gòu)域(zinc finger domains, Znf); Am026295456.1中含有1個(gè)“螺旋-環(huán)-螺旋”結(jié)構(gòu)域(helix loop helix domain, HLH domain)(圖1)。

2.2 CSBV病毒侵染后中華蜜蜂幼蟲中AcMucin5AC-1的表達(dá)量

AcMucin5AC-1 在4日齡幼蟲的中腸和表皮均有表達(dá),但在中腸中的表達(dá)量比在表皮中的表達(dá)量顯著高72%(P<0.05),表明AcMucin5AC-1在中腸組織大量表達(dá)(圖2: A)。CSBV病毒侵染后與未感染CSBV病毒的對(duì)照組比較,VP1基因在感染CSBV病毒的幼蟲中持續(xù)上調(diào),在感染的48 h時(shí)幼蟲中達(dá)到最高相對(duì)表達(dá)量,說明CSBV病毒已侵染中華蜜蜂幼蟲,并在體內(nèi)持續(xù)增殖(圖2: B);AcMucin5AC-1在感染CSBV病毒的幼蟲中腸中表達(dá)呈現(xiàn)整體下調(diào),且在感染12和72 h時(shí)的幼蟲中表達(dá)量顯著降低(P<0.05)(圖2: C),表明CSBV病毒的侵染對(duì)AcMucin5AC-1在中腸組織的表達(dá)量產(chǎn)生了影響。

圖2 中華蜜蜂4日齡幼蟲中腸和表皮中AcMucin5AC-1的表達(dá)量(A)以及CSBV侵染2日齡幼蟲不同時(shí)間中腸中VP1(B)和AcMucin5AC-1的表達(dá)量(C)Fig. 2 Expression levels of AcMucin5AC-1 (A) in the midgut and cuticle of the 4-day-old larva of Apis cerana cerana,and of VP1 (B) and AcMucin5AC-1 (C) in the midgut of the CSBV-infected 2-day-old larva for different timeCK: 未感染CSBV的對(duì)照組 Control group without CSBV infection; CSBV: 中華蜜蜂囊狀幼蟲病毒Chinese sacbrood virus; VP1: CSBV的基因A gene of CSBV; CSBV: 感染CSBV組(107 copies/頭) CSBV-infected group (107 copies/ind.). 圖中據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤;柱上星號(hào)表示兩組間差異顯著(*P<0.05; ** P<0.01)(t檢驗(yàn))。Data in the figure are mean±SE. Asterisk above bars indicates significant difference between the two groups (*P<0.05; ** P<0.01)(t-test).

2.3 AcMucin5AC-1的原核表達(dá)及多克隆抗體

SDS-PAGE 電泳檢測發(fā)現(xiàn),重組蛋白主要以包涵體的形式表達(dá)(圖3: A)。隨后對(duì)重組蛋白 AcMucin5AC-1進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)并純化(圖3: B)將純化后的重組蛋白作為抗原免疫昆明雌性小鼠以制備相應(yīng)的多克隆抗體。免疫印跡分析發(fā)現(xiàn),在50 kD左右處檢測到單一的雜交信號(hào)條帶(圖3: C),說明重組蛋白AcMucin5AC-1的多克隆抗體制備成功。

圖3 重組蛋白AcMucin5AC-1的表達(dá)(A)和純化(B)的SDS-PAGE及多克隆抗體的Western blot檢測(C)Fig. 3 SDS-PAGE of expression (A) and purification (B) of the recombinant AcMucin5AC-1 and Western blotting of polyclonal antibody (C)M: 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)Protein molecular weight marker; 1: 未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET28a pET28a uninduced by IPTG; 2: 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET28a pET28a induced by IPTG; 3: pET28a-AcMucin5AC-1未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)pET28a-AcMucin5AC-1 uninduced by IPTG; 4: pET28a-AcMucin5AC-1經(jīng)IPTG誘導(dǎo)pET28a-AcMucin5AC-1 induced by IPTG; 5: pET28a-AcMucin5AC-1誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物上清 Induced product supernatant of pET28a-AcMucin5AC-1; 6: pET28a-AcMucin5AC-1誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物沉淀Induced product precipitation of pET28a-AcMucin5AC-1; 7: 純化的重組蛋白AcMucin5AC-1 Purified recombinant AcMucin5AC-1; 8: 重組蛋白AcMucin5AC-1與多克隆抗體雜交Recombinant AcMucin5AC-1 hybridized with polyclonal antibody; 9: 重組蛋白 AcMucin5AC-1與陰性血清雜交 Recombinant AcMucin5AC-1 hybridized with negative serum.

2.4 AcMucin5AC-1蛋白的表達(dá)和定位

在中華蜜蜂3-6日齡幼蟲總蛋白均能在80 kD之間雜交到信號(hào)條帶(圖4: A),與實(shí)際預(yù)測分子量(252.18 kD)不一致,推測可能的原因是AcMucin5AC-1分子量較大,在抽提蛋白時(shí)可能會(huì)引起蛋白降解,所以雜交到80 kD的降解條帶。同時(shí),AcMucin5AC-1的抗體在4日齡幼蟲各組織總蛋白中也能雜交到相同大小的單一條帶(圖4: B),表明其在中華蜜蜂幼蟲的中腸、表皮和圍食膜均有表達(dá)。

利用間接免疫熒光技術(shù)通過熒光顯微鏡進(jìn)行觀察,藍(lán)色熒光表示細(xì)胞核,綠色熒光表示AcMucin5AC-1蛋白分布情況,在4日齡幼蟲中,AcMucin5AC-1分布在中腸、圍食膜、腸腔基底膜周圍(basement membrane, BM)和微絨毛(microvilli, Mi)(圖5)。因此,推測AcMucin5AC-1可能是參與圍食膜形成。

圖5 間接免疫熒光檢測AcMucin5AC-1在中華蜜蜂幼4日齡蟲中的定位Fig. 5 Indirect immunofluorescence detection of the localization of AcMucin5AC-1 in the 4-day-old larva of Apis cerana ceranaNegative: 陰性血清(對(duì)照組)Negative serum (control group); UV: 紫外線Ultraviolet ray; DAPI: DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核 DAPI-labeled nuclei; Alexa Fluor 488: Alexa Fluor 488標(biāo)記的AcMucin5AC-1 Alexa Fluor 488-labeled AcMucin5AC-1; Merge: DAPI和Alexa Fluor 488的疊加 Superposition of DAPI and Alexa Fluor 488; PM: 圍食膜Peritrophic membrane; Mi: 微絨毛Microvilli; BM: 腸腔基底膜Basement membrane of the intestinal lumen; MG: 中腸Midgut.

2.5 AcMucin5AC-1的RNAi

qRT-PCR檢測結(jié)果表明,2.0 μg/頭dsRNA處理中華蜜蜂2日齡幼蟲后24 h時(shí)AcMucin5AC-1在中腸中的表達(dá)量比對(duì)照組(dsEGFP)顯著下調(diào)92% (P<0.01)(圖6)。

圖6 中華蜜蜂2日齡幼蟲飼喂dsAcMucin5AC-1后AcMucin5AC-1在中腸中的表達(dá)量Fig.6 Expression levels of AcMucin5AC-1 in the midgut after feeding the 2-day-old larva of Apis cerana larvae with dsAcMucin5AC-1圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤;柱上星號(hào)表示兩組間差異顯著(*P<0.05; ** P<0.01)(t檢驗(yàn))。Data in the figure are mean±SE. The asterisk above bars indicates significant difference between the two groups (*P<0.05; ** P<0.01)(t-test).

RNAi處理24, 48和72 h時(shí)各組織結(jié)構(gòu)形態(tài)較為完整,圍食膜、柱狀細(xì)胞(columnar cell, CC)的微絨毛、柱狀細(xì)胞、脂肪體的滋養(yǎng)細(xì)胞(trophocyte, Tr)和絳色細(xì)胞(oenocyte, Oe)均清晰可見。AcMucin5AC-1被RNAi后24 h時(shí)(圖7: D)和48 h時(shí)(圖7: J)的幼蟲組織與對(duì)照組相比沒有明顯差異,均呈現(xiàn)出細(xì)胞核小而圓,細(xì)胞之間的間隙較小;但RNAi后72 h時(shí)的幼蟲 (圖7: P)細(xì)胞間隙增大,細(xì)胞和細(xì)胞核的形狀變得細(xì)胞間界限不清晰,細(xì)胞排列散亂。

3 討論與結(jié)論

昆蟲在漫長的進(jìn)化過程中,已經(jīng)形成了獨(dú)特的腸道防御機(jī)制,包括物理防御和免疫反應(yīng)(Zengetal., 2022)。圍食物膜是昆蟲腸道物理防御系統(tǒng)的重要結(jié)構(gòu),主要由幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)組成(Hegedusetal., 2009; Kuraishietal., 2011)。而糖基化蛋白組成的黏液是另一個(gè)關(guān)鍵的物理結(jié)構(gòu)(Miguel-Aliagaetal., 2018)。因此,解析昆蟲粘蛋白特征對(duì)病原入侵宿主的機(jī)制研究具有十分重要的意義。

粘蛋白是一個(gè)大型、復(fù)雜的糖基化蛋白家族,其重要的特征是“粘蛋白結(jié)構(gòu)域”。本研究中發(fā)現(xiàn),雖然中西方蜜蜂Mucin5AC蛋白均含有粘蛋白樣結(jié)構(gòu)域(MD),但中華蜜蜂Mucin5AC粘蛋白結(jié)構(gòu)域中ST/PTS串聯(lián)重復(fù)序列、O-糖基化位點(diǎn)和半胱氨酸數(shù)目都高于西方蜜蜂。其中,中華蜜蜂AcMucin5AC-1(028522949.1)含有ChtBD2和MD。根據(jù)含有CBD結(jié)構(gòu)域的典型特征,將圍食膜因子分為peritrophin-A, peritrophin-B和peritrophin-C 3類(Tellametal., 1999),中華蜜蜂AcMucin5AC-1的ChtBD2結(jié)構(gòu)域中含有6個(gè)半胱氨酸,其保守基序?yàn)閄2-5CX10-11CX5-6CX12-15CX12-13CX8-10CX8-9,推測該蛋白屬于圍食膜peritrophin-A,表明AcMucin5AC-1可能參與圍食膜形成,ChtBD2結(jié)構(gòu)域中保守的半胱氨酸殘基形成蛋白內(nèi)部的二硫鍵結(jié)構(gòu),以提高蛋白質(zhì)在富含消化水解酶的中腸環(huán)境中能夠保持穩(wěn)定性(Kuraishietal., 2011)。MD結(jié)構(gòu)域中串聯(lián)重復(fù)序列的糖基化位點(diǎn)可能充當(dāng)了病原物的吸附位點(diǎn)從而阻止病原物同上皮細(xì)胞結(jié)合(李新娜, 2012),暗示粘蛋白可能是昆蟲病原防控的潛在靶標(biāo)。同時(shí),對(duì)中華蜜蜂和西方蜜蜂Mucin5AC結(jié)構(gòu)域比較分析發(fā)現(xiàn),中華蜜蜂Mucin5AC含特異ChtBD2結(jié)構(gòu)域、Glyo18結(jié)構(gòu)域和Tryp_SPc結(jié)構(gòu)域(圖1)。西方蜜蜂Mucin5AC有特異的BROMO結(jié)構(gòu)域、ANK結(jié)構(gòu)域、HLH 結(jié)構(gòu)域、Znf-結(jié)構(gòu)域。中華蜜蜂和西方蜜蜂Mucin5AC結(jié)構(gòu)域的差異暗示該蛋白家族在中華蜜蜂和西方蜜蜂中的功能發(fā)生了分化,為今后研究Mucin5AC在中華蜜蜂和西方蜜蜂中的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

本研究獲得了AcMucin5AC-1的外源重組蛋白,主要以包涵體形式表達(dá)(圖3: A)。Western blot顯示該蛋白分子量的實(shí)際大小為50 kD(圖3: C),比預(yù)測的分子量(35 kD)偏大,經(jīng)過核酸測序比對(duì)沒有發(fā)現(xiàn)突變現(xiàn)象;推測可能因?yàn)锳cMucin5AC-1蛋白的ChtBD2結(jié)構(gòu)域富含半胱氨酸,導(dǎo)致重組蛋白AcMucin5AC-1形成分子間或分子內(nèi)二硫鍵,導(dǎo)致免疫印跡結(jié)果中的蛋白分子量偏大。利用獲得的多克隆抗體anti-AcMucin5AC-1對(duì)中華蜜蜂3-6日齡幼蟲(圖4: A)和4日齡不同組織AcMucin5AC-1的蛋白水平進(jìn)行檢測,在中腸、表皮和圍食膜都檢測到信號(hào)條帶(圖4: B)。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明AcMucin5AC-1蛋白主要分布在中腸和圍食膜(圖5)。Hegedus等(2009)根據(jù)昆蟲圍食膜的合成部位差異,將圍食膜分為由中腸上皮細(xì)胞分泌到腸腔形成的I型圍食膜和由前腸和中腸交界處賁門細(xì)胞分泌的II型圍食膜,推測AcMucin5AC-1可能是由中腸合成之后分泌至腸腔參與圍食膜的構(gòu)成,這與同為膜翅目的無刺蜜蜂所報(bào)道的結(jié)果(Marques-Silvaetal., 2005; das Dores Teixeiraetal., 2015)一致。

本研究確定了dsAcMucin5AC-1在幼蟲組織的干擾條件,即dsRNA的量為2.0 μg/頭,干擾時(shí)間為24 h時(shí)能最大程度沉默AcMucin5AC-1(圖6)。通過HE染色觀察干擾AcMucin5AC-1后的72 h時(shí)的中華蜜蜂幼蟲切片(圖7),發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間隙增大,細(xì)胞和細(xì)胞核的形狀變得不規(guī)則,推測沉默了AcMucin5AC-1可能會(huì)影響細(xì)胞間的松散程度。對(duì)照組dsEGFP干擾的48 h時(shí)能觀察到由微絨毛分泌蛋白以形成圍食膜,而dsAcMucin5AC-1處理48 h時(shí)則沒有觀察到,AcMucin5AC-1的沉默減少了AcMucin5AC-1的蛋白合成,由于AcMucin5AC-1蛋白的減少使得圍食膜的形成受阻。因此,后續(xù)的研究將重點(diǎn)關(guān)注AcMucin5AC-1在圍食膜形成中的作用,為解析圍食膜在CSBV病毒感染過程中的作用奠定基礎(chǔ)。