趙玲俐, 劉 健, 蔡 皓, 張 弦

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

肥胖是一個(gè)全球性的健康問(wèn)題,可導(dǎo)致慢性代謝性疾病,例如Ⅱ型糖尿病、胰島素抵抗、動(dòng)脈粥樣硬化和非酒精性脂肪肝等[1]。長(zhǎng)期的能量攝入和能量消耗的不平衡導(dǎo)致脂肪積累是肥胖發(fā)生的根本原因[2-3]。哺乳動(dòng)物的脂肪細(xì)胞主要包括白色、米色和棕色脂肪細(xì)胞[4]。米色和棕色脂肪細(xì)胞通過(guò)線粒體解偶聯(lián)蛋白1(UCP1)將化學(xué)能直接轉(zhuǎn)化成熱能維持機(jī)體的體溫。當(dāng)白色脂肪細(xì)胞受到β-腎上腺素或者寒冷環(huán)境等刺激時(shí)會(huì)分化為具有部分棕色脂肪細(xì)胞表型特征的米色脂肪細(xì)胞,例如胞內(nèi)的脂滴變小、線粒體增多和UCP1蛋白表達(dá)量增加[5-6]。目前,促進(jìn)脂肪細(xì)胞棕脂化和增強(qiáng)脂肪組織產(chǎn)熱能力被認(rèn)為是改善肥胖有效的手段[7]。

眾所周知,適度的運(yùn)動(dòng)有益于機(jī)體健康[8]。適度的運(yùn)動(dòng)可以促進(jìn)脂肪組織棕脂化,提高機(jī)體能量代謝[9];同時(shí),適度的運(yùn)動(dòng)也會(huì)造成血漿中乳酸濃度的適度升高,在正常人和小鼠體內(nèi),血漿乳酸濃度在0.5～2.0 mmol/L,而在適度有氧運(yùn)動(dòng)期間血漿中的乳酸濃度大約會(huì)增加到4 mmol/L[10-12]。這些研究表明乳酸濃度的升高可能與脂肪組織產(chǎn)熱增強(qiáng)相關(guān)。

文獻(xiàn)[13]報(bào)道了腹腔注射L-乳酸并且配合過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)激動(dòng)劑羅格列酮可以促進(jìn)小鼠白色脂肪組織產(chǎn)熱,25 mmol/L的L-乳酸通過(guò)激活PPARγ信號(hào)促進(jìn)脂肪細(xì)胞棕脂化。此外,文獻(xiàn)[14-15]報(bào)道了在飼料中添加乳酸,通過(guò)激活G蛋白偶聯(lián)受體81(GPR81),調(diào)控p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK),促進(jìn)小鼠白色脂肪組織產(chǎn)熱,25 mmol/L的乳酸處理分化后的3T3-L1脂肪細(xì)胞48 h可以明顯促進(jìn)細(xì)胞中UCP1蛋白表達(dá)。然而,25 mmol/L的乳酸水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了運(yùn)動(dòng)后機(jī)體血漿中的乳酸水平。與適度運(yùn)動(dòng)后血漿中乳酸濃度相當(dāng)濃度的乳酸對(duì)于脂肪細(xì)胞棕脂分化的影響還不清楚。AMP-活化蛋白激酶(AMPK)信號(hào)作為一種能量敏感分子,當(dāng)細(xì)胞能量狀態(tài)受到損害時(shí),AMPK通過(guò)分解代謝途徑刺激能量生成,同時(shí)減少非必需的能量消耗途徑來(lái)恢復(fù)能量穩(wěn)態(tài),它同樣可以參與調(diào)控棕色和米色脂肪細(xì)胞的分化和功能[16-17]。乳酸在促進(jìn)能量代謝過(guò)程中是否需要AMPK的參與值得進(jìn)一步的考察。

因此,本文采用與適度運(yùn)動(dòng)后血漿中乳酸濃度相當(dāng)濃度的乳酸,在皮下脂肪細(xì)胞棕脂分化過(guò)程中和分化成熟后進(jìn)行處理,探究皮下脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱基因mRNA和關(guān)鍵蛋白UCP1表達(dá)水平,并考察在此濃度下AMPK是否參與乳酸調(diào)控皮下脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱過(guò)程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,L-乳酸添加通過(guò)AMPK促進(jìn)了皮下脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

本實(shí)驗(yàn)所用L-乳酸鈉、膠原酶、地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素、羅格列酮和三碘甲狀腺原氨酸(T3)均購(gòu)自Sigma公司;RNAiso Plus RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green Mixture均購(gòu)自Takara公司; UCP1、AMPK和p-AMPK抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG均購(gòu)自Cell Signaling Technology公司;DMEM粉末、胎牛血清(FBS)和青鏈霉素雙抗溶液均購(gòu)自Gibco公司;碳酸氫鈉、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀等均均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 皮下脂肪細(xì)胞的分離與分化

從6～8周齡的C57BL/6J小鼠中分離皮下脂肪組織,將組織剪碎后放入消化液(含有1 mg/mL膠原酶,1%的BSA)中,在37 ℃的條件下消化45 min。消化結(jié)束后加入2倍消化液體積的DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含血清)終止消化;然后用200目濾網(wǎng)過(guò)濾。4 ℃,400g,離心5 min,棄上清,加入含有10%FBS的DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸;接著4 ℃,400g離心5 min,重懸后接種到6孔板中。細(xì)胞100%融合后,用分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞棕脂化,分化培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加0.5 μg/mL胰島素、1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、5 nmol/L T3和1 μmol/L羅格列酮組成,培養(yǎng)2 d后,更換為維持培養(yǎng)基,維持培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加0.5 μg/mL胰島素、5 nmol/L T3和10 μmol/L羅格列酮組成,每2天更換一次培養(yǎng)基,直至第8天。在細(xì)胞分化的過(guò)程中添加5 mmol/L和10 mmol/L的L-乳酸鈉或者在細(xì)胞分化結(jié)束后,添加5 mmol/L和10 mmol/L的L-乳酸鈉處理48 h。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

根據(jù)制造商的說(shuō)明,使用RNAiso Plus試劑從棕脂細(xì)胞中提取總RNA。往細(xì)胞中加入300 μL的Trizol,再向含有細(xì)胞的Trizol中加入60 μL三氯甲烷,充分震蕩后,靜置5 min。在4 ℃的條件下,12 000g離心15 min,吸取100 μL的上層無(wú)色水相,再加入100 μL異丙醇,充分震蕩后,靜置10 min。再在4 ℃的條件下,12 000g離心10 min,棄上清。再加入1 mL的75%酒精,4 ℃,12 000g離心5 min,棄上清。加入16 μLDEPC水、4 μL Mix溶解沉淀,充分振蕩以溶解RNA,然后4 ℃,5 000g離心2 min。混勻后,在37 ℃條件下反應(yīng)50 min,再在85 ℃條件下反應(yīng)10 s得到cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)檢測(cè)系統(tǒng)采用SYBR○R Premix Ex TaqTMⅡ進(jìn)行。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)由95 °C變性3 min啟動(dòng),然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增(95 ℃、10 s, 60 ℃、20 s)。采用2-ΔΔCT方法分析β-actin mRNA表達(dá)正?；蠡虮磉_(dá)的相對(duì)變化。

1.4 蛋白提取和Western Blot檢測(cè)

細(xì)胞裂解,在4 ℃下12 000g離心30 min。收集上清液。蛋白質(zhì)在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠上分離,進(jìn)行電泳。電泳時(shí)間結(jié)束后,將聚偏二氟乙烯(PVDF)膜在甲醇中浸泡30 s,放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中,浸泡15 min。然后在三明治夾中依次放上2層濾紙、膠、PVDF膜、2層濾紙,夾緊后,按正負(fù)極規(guī)定方向放入轉(zhuǎn)膜槽中,2塊膠同時(shí)轉(zhuǎn)膜200 mA恒流轉(zhuǎn)2 h。轉(zhuǎn)膜完成后,將PVDF膜放入含有5%脫脂奶粉的TBST(洗滌緩沖液)封閉液中,室溫下封閉1 h。封閉結(jié)束后,將PVDF膜放入裝有一抗(參考抗體說(shuō)明書(shū),按照適當(dāng)比例用含有5%BSA(牛血清白蛋白)的TBST稀釋抗體)的封閉袋中,在4 ℃的條件下孵育過(guò)夜。用TBST 漂洗一抗孵育后的PVDF膜,然后將膜轉(zhuǎn)移至裝有辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶5 000 ～1∶10 000)的封閉袋中,在室溫下孵育2 h。使用ECL試劑盒和Image Quant LAS 4 000 mini(GE Healthcare, BS, UK)檢測(cè)和分析蛋白條帶,使用Image QuantTL 7.0軟件定量條帶信號(hào)強(qiáng)度。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。圖形使用Origin 8.5繪制。統(tǒng)計(jì)顯著性由t檢驗(yàn)計(jì)算。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 L-乳酸促進(jìn)細(xì)胞分化中產(chǎn)熱基因的表達(dá)

為了研究L-乳酸對(duì)皮下脂肪細(xì)胞棕脂分化的影響,實(shí)驗(yàn)分離了C57BL/6J小鼠白色脂肪組織中的間質(zhì)血管組分細(xì)胞(SVFs),在其棕脂分化的過(guò)程中加入5 mmol/L和10 mmol/L的L-乳酸鈉。本文檢測(cè)了一系列產(chǎn)熱基因包括線粒體解偶聯(lián)蛋白1(Ucp1)、PR結(jié)構(gòu)域蛋白16(Prdm16)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1(Pgc1α)和細(xì)胞死亡激活因子(Cidea)的表達(dá)水平。L-乳酸對(duì)棕脂分化過(guò)程中產(chǎn)熱基因表達(dá)的影響如圖1所示。

圖1 L-乳酸對(duì)棕脂分化過(guò)程中產(chǎn)熱基因表達(dá)的影響

從圖1可以看出:與未加L-乳酸鈉處理組相比,5 mmol/L的L-乳酸鈉提高了產(chǎn)熱基因Ucp1表達(dá)水平,盡管沒(méi)有顯著性差異;10 mmol/L的L-乳酸鈉明顯促進(jìn)了產(chǎn)熱基因Ucp1的表達(dá)。結(jié)果表明,L-乳酸處理促進(jìn)了皮下脂肪細(xì)胞的棕脂分化。

2.2 L-乳酸促進(jìn)細(xì)胞分化中UCP1蛋白的表達(dá)

UCP1蛋白是棕脂細(xì)胞產(chǎn)熱過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白,當(dāng)電子沿著電子傳遞鏈傳遞時(shí),質(zhì)子從線粒體內(nèi)膜基質(zhì)泵到內(nèi)膜外側(cè),內(nèi)膜外側(cè)的質(zhì)子可以通過(guò)特殊的質(zhì)子通道UCP1流回線粒體基質(zhì)中,而不通過(guò)ATP合酶,由葡萄糖和脂肪酸分解產(chǎn)生的能量不能轉(zhuǎn)化為ATP而轉(zhuǎn)化為熱能,產(chǎn)熱基因Prdm16、Pgc1α和Cidea通過(guò)Ucp1調(diào)控棕脂細(xì)胞產(chǎn)熱[18]。為了探究L-乳酸的促棕脂化效應(yīng),皮下脂肪細(xì)胞作為細(xì)胞模型,并被不同濃度(5 mmol/L和10 mmol/L)的L-乳酸鈉處理。Western Blot檢測(cè)了皮下脂肪細(xì)胞棕脂分化過(guò)程中UCP1蛋白表達(dá)水平。L-乳酸對(duì)棕脂分化過(guò)程中UCP1蛋白表達(dá)的影響如圖2所示,從圖2可以看出,5 mmol/L和10 mmol/L的L-乳酸鈉都明顯促進(jìn)了皮下脂肪細(xì)胞棕脂分化過(guò)程中UCP1蛋白表達(dá)。這些結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了L-乳酸處理促進(jìn)了皮下脂肪細(xì)胞的棕脂分化。

圖2 L-乳酸對(duì)棕脂分化過(guò)程中UCP1蛋白表達(dá)的影響

2.3 L-乳酸促進(jìn)細(xì)胞分化中p-AMPK的表達(dá)

AMPK是一種細(xì)胞能量傳感器,最近已被證明在調(diào)節(jié)棕色和米色脂肪組織的代謝活性方面具有重要意義[17]。為了探究L-乳酸促進(jìn)棕脂化的可能機(jī)制,本文確定了AMPK的表達(dá)水平,它也是一個(gè)調(diào)節(jié)脂肪酸利用的代謝主開(kāi)關(guān)。L-乳酸對(duì)棕脂分化過(guò)程中AMPK磷酸化蛋白表達(dá)的影響如圖3所示,從圖3可以看出,5 mmol/L的L-乳酸鈉提高了AMPK蛋白磷酸化水平,盡管沒(méi)有顯著性差異,L-乳酸在較低濃度條件下不能提高皮下脂肪細(xì)胞棕脂分化過(guò)程中AMPK蛋白磷酸化水平的能力,而1 mmol/L的L-乳酸鈉顯著增加了AMPK蛋白磷酸化水平。結(jié)果表明L-乳酸處理促進(jìn)皮下脂肪細(xì)胞的棕脂分化與AMPK信號(hào)通路相關(guān)。

圖3 L-乳酸對(duì)棕脂分化過(guò)程中AMPK磷酸化蛋白表達(dá)的影響

2.4 L-乳酸促進(jìn)棕脂細(xì)胞中產(chǎn)熱基因的表達(dá)

L-乳酸促進(jìn)了皮下脂肪細(xì)胞棕脂分化,并且這種促進(jìn)作用可能與AMPK信號(hào)通路相關(guān)。隨后本文研究了L-乳酸對(duì)成熟棕色脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱的影響,使用誘導(dǎo)劑胰島素、地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、T3和羅格列酮將SVFs誘導(dǎo)為成熟的棕色脂肪細(xì)胞后,5 mmol/L和10 mmol/L的L-乳酸鈉處理細(xì)胞48 h,一系列產(chǎn)熱基因Ucp1、Prdm16、Pgc1α和Cidea的表達(dá)水平被檢測(cè)。

L-乳酸對(duì)棕脂細(xì)胞中產(chǎn)熱基因表達(dá)的影響如圖4所示。從圖4可以看出:與未加L-乳酸鈉處理組相比,5 mmol/L的L-乳酸鈉處理僅顯著促進(jìn)了棕色脂肪細(xì)胞中產(chǎn)熱基因Ucp1的表達(dá),略微提高了Prdm16、Pgc1α的表達(dá)水平,但無(wú)顯著性差異;10 mmol/L的L-乳酸鈉處理顯著促進(jìn)了產(chǎn)熱基因Ucp1、Prdm16、Pgc1α和Cidea的表達(dá)。結(jié)果表明L-乳酸處理促進(jìn)了成熟棕色脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱。

圖4 L-乳酸對(duì)棕脂細(xì)胞中產(chǎn)熱基因表達(dá)的影響

2.5 L-乳酸促進(jìn)棕脂細(xì)胞中UCP1的表達(dá)

與研究L-乳酸對(duì)皮下脂肪細(xì)胞棕脂分化的影響一致,本文同樣檢測(cè)了L-乳酸鈉處理棕脂細(xì)胞48 h后,細(xì)胞內(nèi)UCP1蛋白表達(dá)的水平。L-乳酸對(duì)棕脂細(xì)胞中UCP1蛋白表達(dá)的影響如圖5所示。

圖5 L-乳酸對(duì)棕脂細(xì)胞中UCP1蛋白表達(dá)的影響

從圖5可以看出,與L-乳酸對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ucp1基因表達(dá)的影響一致,5 mmol/L和10 mmol/L的L-乳酸鈉都明顯促進(jìn)了棕脂細(xì)胞中UCP1蛋白表達(dá),即使在較低的濃度條件下,L-乳酸也能促進(jìn)棕脂細(xì)胞中UCP1蛋白表達(dá)。5 mmol/L的L-乳酸鈉并不能促進(jìn)皮下脂肪細(xì)胞棕脂分化過(guò)程中產(chǎn)熱蛋白UCP1的表達(dá),表明L-乳酸促進(jìn)棕脂細(xì)胞產(chǎn)熱的作用明顯優(yōu)于促進(jìn)皮下脂肪細(xì)胞棕脂分化的作用。這些結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了L-乳酸處理促進(jìn)了棕色脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱。

2.6 L-乳酸促進(jìn)棕脂細(xì)胞中p-AMPK的表達(dá)

AMPK不僅在皮下脂肪細(xì)胞棕脂分化中發(fā)揮重要作用,還可以調(diào)控棕色脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱[16]。為了研究L-乳酸促進(jìn)成熟棕脂細(xì)胞產(chǎn)熱的機(jī)制,用5 mmol/L和10 mmol/L的L-乳酸鈉處理棕脂細(xì)胞48 h,Western Blot檢測(cè)棕脂細(xì)胞中AMPK和p-AMPK蛋白表達(dá)水平。L-乳酸對(duì)棕脂細(xì)胞中AMPK磷酸化蛋白表達(dá)的影響如圖6所示。從圖6可以看出,與未用L-乳酸鈉處理組相比,5 mmol/L和10 mmol/L的L-乳酸鈉都顯著增加了棕脂細(xì)胞中p-AMPK與AMPK蛋白表達(dá)比率,即AMPK蛋白的磷酸化水平。結(jié)果表明L-乳酸促進(jìn)成熟棕色脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱也與AMPK信號(hào)通路相關(guān)。

圖6 L-乳酸對(duì)棕脂細(xì)胞中AMPK磷酸化蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

乳酸廣泛存在于人體、動(dòng)物及微生物代謝之中,也存在于多種食品中。乳酸分子存在2種光學(xué)對(duì)映體(D-乳酸和L-乳酸),在哺乳動(dòng)物體內(nèi)L-乳酸是主要的同分異構(gòu)形式,相比于葡萄糖,由糖酵解產(chǎn)生的L-乳酸是主要的能量載體[19-20]。在適度運(yùn)動(dòng)的過(guò)程中,血漿中的乳酸濃度大約會(huì)增加到4 mmol/L[11-12],為了研究與適度運(yùn)動(dòng)后血漿中乳酸濃度相當(dāng)濃度的乳酸對(duì)棕脂細(xì)胞分化和產(chǎn)熱的影響,本文采用5 mmol/L和10 mmol/L的L-乳酸鈉進(jìn)行研究。

為了研究乳酸在皮下脂肪細(xì)胞分化過(guò)程和成熟后是否都發(fā)揮作用,本文在細(xì)胞分化的過(guò)程中或者細(xì)胞分化結(jié)束后加入L-乳酸鈉。在這2種情況下,10 mmol/L的L-乳酸鈉促進(jìn)了成熟棕色脂肪細(xì)胞中Ucp1、Prdm16、Pgc1α和Cidea產(chǎn)熱基因、UCP1蛋白和AMPK磷酸化蛋白的表達(dá),僅促進(jìn)了棕色脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中Ucp1mRNA、UCP1蛋白和AMPK磷酸化蛋白的表達(dá)。5 mmol/L的L-乳酸鈉促進(jìn)了成熟棕色脂肪細(xì)胞中Ucp1 mRNA、UCP1蛋白和AMPK磷酸化蛋白的表達(dá),僅促進(jìn)了棕色脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中UCP1蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明L-乳酸對(duì)成熟棕脂細(xì)胞產(chǎn)熱的促進(jìn)作用更強(qiáng)于對(duì)皮下脂肪細(xì)胞棕脂分化的作用。

文獻(xiàn)[13]報(bào)道了5～50 mmol/L的L-乳酸通過(guò)PPARγ信號(hào)促進(jìn)小鼠皮下脂肪組織分化的原代脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱。與前人的研究結(jié)果一致,本文同樣發(fā)現(xiàn)5 mmol/L和10 mmol/L的L-乳酸促進(jìn)棕脂細(xì)胞產(chǎn)熱。此外,本文還發(fā)現(xiàn)L-乳酸促進(jìn)了皮下脂肪細(xì)胞棕脂分化過(guò)程中產(chǎn)熱基因和UCP1蛋白的表達(dá)。L-乳酸通過(guò)AMPK信號(hào)在皮下脂肪細(xì)胞棕脂分化和棕脂細(xì)胞產(chǎn)熱過(guò)程中發(fā)揮作用。這說(shuō)明L-乳酸可能通過(guò)多個(gè)信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱。

本文發(fā)現(xiàn)與適度運(yùn)動(dòng)后血漿中乳酸濃度相當(dāng)濃度的L-乳酸處理,既能促進(jìn)皮下脂肪細(xì)胞棕脂分化也能促進(jìn)成熟棕脂細(xì)胞產(chǎn)熱。機(jī)制研究表明,AMPK信號(hào)參與了L-乳酸促進(jìn)皮下脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱的進(jìn)程。這些研究結(jié)果為乳酸改善機(jī)體代謝提供了新的理論依據(jù),并為肥胖及其相關(guān)的代謝性疾病提供了一種新的預(yù)防和治療手段。