史 薇，銀雪梅，王智超，吳也可，吳克明*

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610000； 2.山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030000）

卵巢儲(chǔ)備功能減退 （diminished ovarian reserve，DOR） 是指育齡期女性卵母細(xì)胞質(zhì)量和（或） 數(shù)量過早減退的病理狀態(tài)［1-2］。臨床根據(jù)生育力減退、抗苗勒管激素（anti-mullerian hormone，AMH） 下降、基礎(chǔ)血清促卵泡生成素 （follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH） 升高等臨床癥狀和指標(biāo)異常予經(jīng)驗(yàn)性診斷和治療［3］。輔助生殖技術(shù)等療法在提高臨床妊娠率和降低流產(chǎn)率方面仍存在難點(diǎn)及不良反應(yīng)諸多等問題，DOR 對(duì)生殖健康的不良影響已成為亟待解決的醫(yī)學(xué)和社會(huì)問題。

腎精是生殖的基礎(chǔ)，精血同源。吳克明教授認(rèn)為DOR 根本病機(jī)是腎中精血虧虛，因虛致瘀，以補(bǔ)腎養(yǎng)血活血為治法創(chuàng)制的新加蓯蓉菟絲子湯可有效提高生育能力，延緩卵巢功能減退進(jìn)程［4-5］。課題組前期研究證實(shí)，新加蓯蓉菟絲子湯及其藥物單體可抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡和自噬，對(duì)抗氧化應(yīng)激，促進(jìn)卵泡發(fā)育［6-8］。Kasapo ?ɡlu 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，卵泡儲(chǔ)備和卵子質(zhì)量與線粒體功能障礙相關(guān)； 能量穩(wěn)態(tài)靶點(diǎn)腺苷活化蛋白激酶 （adenosine-activated protein kinase，AMPK） 和線粒體損傷應(yīng)答關(guān)鍵沉默信息調(diào)節(jié)因子1 （silent mating type information regulator 1，SIRT1） 介導(dǎo)的信號(hào)通路可增加卵泡儲(chǔ)備和卵巢壽命［10-11］。因此，本研究建立雷公藤甲素誘導(dǎo)的DOR 大鼠模型，給予新加蓯蓉菟絲子湯和調(diào)經(jīng)促孕丸進(jìn)行干預(yù)，探究其對(duì)DOR 大鼠線粒體功能和AMPK/SIRT1 通路的影響，以期為中醫(yī)藥研究和臨床治療提供新的靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 動(dòng)情周期正常的3 月齡健康成年雌性SD 大鼠24 只，體質(zhì)量200 ～250 g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供 ［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （川） 2020-030］，分籠飼養(yǎng)于四川生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，溫度24～26 ℃，相對(duì)濕度50% ～70%，晝夜光照，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，測(cè)試大鼠反應(yīng)靈敏后用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批通過。

1.2 藥物 新加蓯蓉菟絲子湯由菟絲子15 g、肉蓯蓉15 g、黃精10 g、淫羊藿15 g、覆盆子10 g、山茱萸10 g、熟地黃10 g、當(dāng)歸10 g、澤蘭10 g、烏藥10 g、山藥10 g、枸杞子10 g 組成，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院華潤(rùn)三九藥房以單味中藥顆?；旌现瞥扇矫饧孱w粒（每135 g 生藥加工成24.35 g免煎顆粒），根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》 等效劑量系數(shù)折算結(jié)合課題組前期實(shí)驗(yàn)，選擇最佳劑量為5.11 g/kg［12］。調(diào)經(jīng)促孕丸（水蜜丸5 g/袋，國(guó)藥準(zhǔn)字Z11020027） 購自北京同仁堂國(guó)藥有限公司，研磨后用雙蒸水配制成混懸液，成人臨床用量為每天10 g，根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》 等效劑量系數(shù)折算成大鼠給藥劑量為1.05 g/kg。雷公藤甲素（粉劑1 000 mg/支，批號(hào)DST210929-034） 購自成都德思特生物技術(shù)有限公司。

1.3 試劑 FSH、AMH、抑制素B （inhibin B，INHB） 酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 試劑盒、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP） 試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號(hào)E-EL-R0391c、E-EL-R3022、E-EL-R1027c、E-BC-K157-M）； 電鏡固定液 （武漢谷歌生物科技有限公司，貨號(hào)G1102）； 活性氧（reactive oxygen，ROS）、線粒體膜電位 （mitochondrial membrane potential，MMP）檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)S0033S、C2006）； BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（合肥白鯊生物科技有限公司，貨號(hào)BL521A）； 兔β-actin 抗體、兔AMPK 抗體、兔SIRT1 抗體、兔過氧化物酶體增殖物激活受體γ 輔助活化因子1（peroxlsomeproliferator-activated receptor-γ coactlvator-1α，PGC-1α） 抗體 （美國(guó)Affinity 公司，貨號(hào)AF7018、AF6423、DF6033、DF7081）。

1.4 儀器 正置白光拍照顯微鏡（日本尼康公司）； 光譜儀（美國(guó)伯騰公司）； 透射電子顯微鏡（日本日立公司）； 流式細(xì)胞儀（德國(guó)貝克曼庫爾特公司）； 電泳儀、垂直電泳槽及組件（美國(guó)伯樂公司）； 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）； 臺(tái)式高速冷凍型微型離心機(jī)（美國(guó)賽洛捷克公司）。

2 方法

2.1 模型建立 篩選動(dòng)情周期正常的24 只大鼠，隨機(jī)分為空白組、模型組、調(diào)經(jīng)促孕丸組、新加蓯蓉菟絲子湯組，每組6 只。除空白組外其余各組大鼠灌胃給予500 μg/kg 雷公藤甲素，連續(xù)30 d［12］。從造模第26 天起，每天上午9 點(diǎn)進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片，連續(xù)5 d，觀察動(dòng)情周期變化，當(dāng)大鼠均出現(xiàn)動(dòng)情周期紊亂時(shí)可認(rèn)為造模成功。

2.2 分組及給藥 空白組、模型組大鼠灌胃給予生理鹽水（1 mL/100 g），調(diào)經(jīng)促孕丸組大鼠灌胃給予1.05 g/kg 調(diào)經(jīng)促孕丸懸濁液，新加蓯蓉菟絲子湯組大鼠灌胃給予新加蓯蓉菟絲子湯5.11 g/kg每天1 次，連續(xù)2 周。

2.3 取材 各組大鼠末次給藥1 h 后麻醉，腹主動(dòng)脈采血，分離得到血清，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。無菌分離雙側(cè)卵巢，并分別用電鏡固定液、4%多聚甲醛固定卵巢組織。

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 一般情況、動(dòng)情周期 每天定時(shí)觀察大鼠飲水?dāng)z食、精神狀態(tài)、皮毛光澤、行為反應(yīng)。在造模第26～30 天、給藥后第10 ～14 天進(jìn)行陰道脫落上皮涂片，觀察動(dòng)情周期。

2.4.2 蘇木素-伊紅（HE） 染色觀察卵泡發(fā)育情況 4%多聚甲醛固定的大鼠卵巢組織經(jīng)脫水、包埋、切片、染色、封片，于顯微鏡下放大100 倍觀察卵泡發(fā)育情況，規(guī)范各級(jí)卵泡、黃體判定圖例；放大20 倍拍攝并計(jì)算初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、成熟卵泡、閉鎖卵泡、黃體數(shù)量。

2.4.3 ELISA 法檢測(cè)血清FSH、AMH、INHB水平 大鼠全血2 000 r/min 離心10 min，取上清，按照ELISA 檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)FSH、AMH、INHB 水平。

2.4.4 透射電鏡觀察卵巢組織線粒體結(jié)構(gòu) 電鏡液固定的大鼠卵巢組織經(jīng)脫水、滲透、包埋、切片、染色，在透射電子顯微鏡下放大7 000 倍觀察并采集圖像。

2.4.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)卵巢組織ROS、MMP水平 取適量大鼠卵巢組織，加入含酶緩沖液，過濾后獲取細(xì)胞懸液，離心棄上清，PBS 洗滌細(xì)胞，加入流式上樣緩沖液重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度，一部分細(xì)胞加入DCFH-DA 探針，于流式細(xì)胞儀上分析，以DCF 相對(duì)熒光量表示ROS 水平； 另一部分細(xì)胞加入JC-1 染色緩沖液，于流式細(xì)胞儀上分析檢測(cè)，以JC-1 形成聚合物和單體的比值表示MMP水平。

2.4.6 分光光度法檢測(cè)卵巢組織ATP 水平 使用裂解液充分勻漿裂解大鼠卵巢組織，按照ATP 試劑盒說明書加入工作液，采用分光光度法檢測(cè)ATP 水平。

2.4.7 Western blot 法檢測(cè)卵巢組織AMPK、SIRT1、PGC-1α 蛋白表達(dá) 采用RIPA 裂解提取大鼠卵巢組織總蛋白，蛋白定量試劑盒測(cè)定濃度，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、孵育二抗、顯影，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下采集圖像，以β-actin 為內(nèi)參，通過Image J 軟件測(cè)定灰度值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析，事后多重比較采用Tukey 檢驗(yàn)； 若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，采用非參數(shù)Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)，事后兩兩比較采用Mann-Whitney 法。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 新加蓯蓉菟絲子湯對(duì)大鼠一般情況的影響 造模前大鼠反應(yīng)靈敏，造模后大鼠逐漸出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、少量體毛脫落、喜蜷縮扎堆等表現(xiàn)，飲食和攝水量無明顯變化，體質(zhì)量降低（P＜0.01）； 新加蓯蓉菟絲子湯干預(yù)后，大鼠脫毛現(xiàn)象好轉(zhuǎn)，反應(yīng)、活動(dòng)敏捷度提升，體質(zhì)量增加，見圖1。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量Fig.1 Rat body weight of each group

3.2 新加蓯蓉菟絲子湯對(duì)大鼠動(dòng)情周期的影響 大鼠動(dòng)情周期約4～5 d，分為動(dòng)情前期（有核上皮細(xì)胞為主）、動(dòng)情期（角化上皮細(xì)胞為主）、動(dòng)情后期（有核、角化上皮細(xì)胞和白細(xì)胞均可見）、動(dòng)情間期（白細(xì)胞為主），若周期延長(zhǎng)（≥6 d）、停滯（≥3 d） 或無周期（無序） 則判定為動(dòng)情周期紊亂。造模的18 只大鼠均出現(xiàn)動(dòng)情周期紊亂（延長(zhǎng)44.44%，停滯16.67%，無周期38.89%），說明大鼠卵巢功能抑制，動(dòng)情周期紊亂。調(diào)經(jīng)促孕丸、新加蓯蓉菟絲子湯干預(yù)后，部分大鼠恢復(fù)動(dòng)情周期（周期正常50%，延長(zhǎng)25%，停滯8.33%，無周期16.67%），其中新加蓯蓉菟絲子湯干預(yù)后有4 只大鼠恢復(fù)動(dòng)情周期，有效率為66.67%。動(dòng)情周期判定標(biāo)準(zhǔn)見圖2。

圖2 大鼠動(dòng)情周期（×100）Fig.2 Estrous cycle of rats （×100）

3.3 新加蓯蓉菟絲子湯對(duì)大鼠卵巢各級(jí)卵泡及黃體數(shù)量的影響 與空白組比較，模型組初級(jí)卵泡、成熟卵泡數(shù)無明顯變化（P＞0.05），次級(jí)卵泡、黃體數(shù)減少（P＜0.05，P＜0.01），閉鎖卵泡數(shù)增加（P＜0.01）； 與模型組比較，調(diào)經(jīng)促孕丸組、新加蓯蓉菟絲子湯組初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、黃體數(shù)增加（P＜0.05，P＜0.01），其中新加蓯蓉菟絲子湯組閉鎖卵泡數(shù)減少（P＜0.01）。各級(jí)卵泡、黃體典型圖見圖3，卵巢HE 染色見圖4，卵泡、黃體計(jì)數(shù)見表1。

表1 新加蓯蓉菟絲子湯對(duì)大鼠卵巢各級(jí)卵泡及黃體數(shù)的影響（±s，n＝6）Tab.1 Effects of Modified Congrong Tusizi Decoction on follicles at various levels and corpus luteum of rats （±s，n＝6）

表1 新加蓯蓉菟絲子湯對(duì)大鼠卵巢各級(jí)卵泡及黃體數(shù)的影響（±s，n＝6）Tab.1 Effects of Modified Congrong Tusizi Decoction on follicles at various levels and corpus luteum of rats （±s，n＝6）

注： 與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別初級(jí)卵泡/個(gè)次級(jí)卵泡/個(gè)成熟卵泡/個(gè)閉鎖卵泡/個(gè)黃體/個(gè)空白組1.67±1.214.17±1.721.33±1.510.17±0.415.17±2.14模型組0.67±0.520.33±0.82**0.17±0.414.00±2.00**2.83±0.98*調(diào)經(jīng)促孕丸組3.00±1.67＃5.67±4.27＃＃0.50±0.842.67±2.075.83±2.23＃＃新加蓯蓉菟絲子湯組3.33±2.16＃＃7.67±4.50＃＃1.33±1.2210.17±0.41＃＃9.00±5.06＃

圖3 各級(jí)卵泡、黃體（×100）Fig.3 Follicles and corpus luteum at all levels

圖4 各組大鼠卵巢組織HE 染色（×20）Fig.4 HE staining for rat ovarian tissue of each group

3.4 新加蓯蓉菟絲子湯對(duì)大鼠血清FSH、AMH、INHB 水平的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清FSH 水平升高（P＜0.01），AMH 水平降低（P＜0.05），INHB 水平無明顯變化（P＞0.05）； 與模型組比較，調(diào)經(jīng)促孕丸組、新加蓯蓉菟絲子湯組大鼠血清FSH 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），INHB水平無明顯變化（P＞0.05），其中新加蓯蓉菟絲子湯組大鼠血清AMH 升高（P＜0.05），見表2。

表2 新加蓯蓉菟絲子湯對(duì)大鼠血清FSH、AMH、INHB 水平的影響（±s，n＝6）Tab.2 Effects of Modified Congrong Tusizi Decoction on serum FSH，AMH and INHB levels of rats （±s，n＝6）

表2 新加蓯蓉菟絲子湯對(duì)大鼠血清FSH、AMH、INHB 水平的影響（±s，n＝6）Tab.2 Effects of Modified Congrong Tusizi Decoction on serum FSH，AMH and INHB levels of rats （±s，n＝6）

注： 與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別FSH/（ng·mg-1）AMH/（pg·mg-1）INHB/（pg·mL-1）空白組21.20±5.18743.73±123.7130.86±7.80模型組37.46±8.71**534.76±38.85*24.92±6.42調(diào)經(jīng)促孕丸組20.25±3.45＃＃815.34±277.2729.70±11.57新加蓯蓉菟絲子湯組23.70±11.22＃745.03±166.16＃29.49±11.02

3.5 新加蓯蓉菟絲子湯對(duì)大鼠卵巢組織線粒體結(jié)構(gòu)的影響 空白組大多為正常線粒體，大小均勻，形態(tài)正常，膜結(jié)構(gòu)完整，嵴清晰可見； 模型組多為嚴(yán)重?fù)p傷線粒體，其形態(tài)崩解、明顯腫脹，部分膜結(jié)構(gòu)模糊、嵴斷裂甚至空泡化； 調(diào)經(jīng)促孕丸組、新加蓯蓉菟絲子組既有正常線粒體，也有損傷線粒體，部分形態(tài)損傷，輕度腫脹，膜結(jié)構(gòu)基本完整，內(nèi)部嵴結(jié)構(gòu)模糊，見圖5。

圖5 新加蓯蓉菟絲子湯對(duì)大鼠卵巢線粒體結(jié)構(gòu)的影響（×7 000）Fig.5 Effects of Modified Congrong Tusizi Decoction on the structure of ovary mitochondria in rats （×7 000）

3.6 新加蓯蓉菟絲子湯對(duì)大鼠卵巢線粒體功能的影響 與空白組比較，模型組大鼠卵巢組織ROS 水平升高（P＜0.01），ATP、MMP 水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，調(diào)經(jīng)促孕丸組、新加蓯蓉菟絲子湯組大鼠卵巢組織ROS 水平降低（P＜0.01），ATP、MMP 水平升高（P＜0.01），見表3。

表3 新加蓯蓉菟絲子湯對(duì)大鼠卵巢線粒體功能的影響（±s，n＝6）Tab.3 Effects of Modified Congrong Tusizi Decoction on the function of ovarian mitochondrial in rats （±s，n＝6）

表3 新加蓯蓉菟絲子湯對(duì)大鼠卵巢線粒體功能的影響（±s，n＝6）Tab.3 Effects of Modified Congrong Tusizi Decoction on the function of ovarian mitochondrial in rats （±s，n＝6）

注： 與空白組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別ROSATP/（μmol·L-1）MMP空白組26 754.45±7 434.3616.35±1.0827.24±6.32模型組155 401.62±17 582.89**6.88±1.03**2.38±0.13**調(diào)經(jīng)促孕丸組45 711.55±3 116.16＃＃9.52±1.44＃＃7.15±0.40＃＃新加蓯蓉菟絲子湯組72 322.13±1 000.79＃＃11.61±0.20＃＃6.17±4.25＃＃

3.7 新加蓯蓉菟絲子湯對(duì)大鼠卵巢組織AMPK、SIRT1、PGC-1α 蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組大鼠卵巢組織AMPK、SIRT1、PGC-1α 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）； 與模型組比較，調(diào)經(jīng)促孕丸組、新加蓯蓉菟絲子湯組大鼠卵巢組織AMPK、SIRT1、PGC-1α 蛋白表達(dá)升高 （P＜0.05，P＜0.01），見圖6。

圖6 新加蓯蓉菟絲子湯對(duì)大鼠卵巢組織AMPK、SIRT1、PGC-1α 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝6）Fig.6 Effects of Modified Congrong Tusizi Decoction on the ovarian protein expressions of AMPK，SIRT1 and PGC-1α of rats （±s，n＝6）

4 討論

腎為天癸之源，腎中精氣充盛則卵子發(fā)育成熟排出以受孕。婦人以血為本，腎精所化陰血是月經(jīng)來潮和孕育胎兒的前提。調(diào)經(jīng)促孕丸中菟絲子、淫羊藿、丹參和雞血藤共用，溫腎且養(yǎng)血活血，具備臨床療效循證依據(jù)［13-16］。新加蓯菟絲子湯中菟絲子和肉蓯蓉補(bǔ)腎益精共為君藥； 黃精、山茱萸、熟地黃、枸杞子、淫羊藿和覆盆子補(bǔ)腎之陰陽，當(dāng)歸和山藥健脾養(yǎng)血，為臣藥； 澤蘭活血化瘀為佐藥；烏藥理氣行滯為使藥，諸藥合用補(bǔ)腎益精、養(yǎng)血活血，治療包括卵巢儲(chǔ)備功能下降在內(nèi)的卵巢功能減退類疾病。

卵巢是女性的生育調(diào)控中心，卵泡成熟與否決定女性生育力。顆粒細(xì)胞是卵泡發(fā)育的基礎(chǔ)，線粒體是細(xì)胞能量供應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞器，對(duì)維持卵泡發(fā)育和產(chǎn)生高質(zhì)量卵子具有重要作用［17］。線粒體呼吸鏈?zhǔn)羌?xì)胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生的重要位點(diǎn)，因氧化損傷造成線粒體功能障礙是DOR 的重要發(fā)病機(jī)制［18-19］。氧化應(yīng)激時(shí)，線粒體氧化磷酸化加快引起ROS 累積，造成線粒體腫脹、嵴斷裂等結(jié)構(gòu)損傷以及ATP合成障礙、線粒體膜電位失衡等功能損傷，顆粒細(xì)胞能量代謝異常而干擾卵泡發(fā)育進(jìn)程［20-21］。AMPK是線粒體因子SIRT1 和PGC-1α 的上游控制靶點(diǎn)［22］。研究發(fā)現(xiàn)AMPK 在卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞等中均有表達(dá)，參與卵泡發(fā)育的正負(fù)反饋調(diào)節(jié)，其失活會(huì)加速線粒體自噬并啟動(dòng)細(xì)胞程序性死亡［23-25］。Zhou 等［26］研究發(fā)現(xiàn)激活SIRT1 可抑制卵泡募集、發(fā)育與閉鎖，減緩始基卵泡消耗速率，保護(hù)卵巢儲(chǔ)備功能。在神經(jīng)［27-28］、骨骼［29］、腎臟細(xì)胞［30］中均證實(shí)調(diào)控AMPK/SIRT1 通路可活化AMPK，激活SIRT1 和PGC-1α，抵消過度累積的ROS，調(diào)節(jié)線粒體能量代謝，對(duì)抗氧化應(yīng)激，改善線粒體功能。

雷公藤對(duì)生殖系統(tǒng)有較強(qiáng)毒性，其提取物可抑制卵巢細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞凋亡，加速卵泡消耗趨向枯竭［31-32］，是制備卵巢功能減退的常用造模方法。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雷公藤甲素可引起大鼠動(dòng)情周期紊亂，減少生長(zhǎng)卵泡和黃體數(shù)，升高血清FSH 水平，降低AMH 和INHB 水平，與DOR 臨床表現(xiàn)及輔助檢查具有較高擬合度，提示DOR 疾病模型建立成功。而新加蓯菟絲子湯給藥后，大鼠部分恢復(fù)動(dòng)情周期，各階段卵泡數(shù)增加，血清激素水平得到改善，卵巢功能得以恢復(fù)；且給藥后大鼠卵巢線粒體結(jié)構(gòu)損傷較輕，ROS 累積減少，ATP 合成增加并恢復(fù)MMP 水平，說明其可有效糾正線粒體形態(tài)損傷和功能障礙。此外，新加蓯菟絲子可上調(diào)AMPK、SIRT1 和PGC-1α 蛋白表達(dá)，說明新加蓯蓉菟絲子湯可通過活化AMPK及其下游因子SIRT1 和PGC-1α 發(fā)揮線粒體保護(hù)作用。

綜上所述，新加蓯蓉菟絲子湯可通過激活A(yù)MPK/SIRT1 信號(hào)通路，糾正卵巢組織線粒體形態(tài)損傷和功能障礙，改善性激素紊亂，促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)發(fā)育，延緩生殖衰老。但本實(shí)驗(yàn)未探究線粒體生成等質(zhì)量控制機(jī)制，并且未提取顆粒細(xì)胞和線粒體精確研究，后續(xù)可進(jìn)一步深入探索完善相關(guān)分子生物學(xué)機(jī)制。