胡 青，程益清，曹 帥，孫 健，季 申*

（1.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院，上海 201203； 2.上海市食品藥品檢驗(yàn)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203）

復(fù)方板藍(lán)根顆粒收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》 中藥成方制劑第十二冊(cè) （編號(hào)WS3-B-2377-97），由板藍(lán)根、大青葉經(jīng)水提醇沉工藝制得，用于治療風(fēng)熱感冒、咽喉腫痛，可能通過(guò)多途徑、多靶點(diǎn)干預(yù)來(lái)COVID-19［1］。查詢(xún)國(guó)家藥監(jiān)局網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有復(fù)方板藍(lán)根顆粒生產(chǎn)企業(yè)147家，批準(zhǔn)文號(hào)151 個(gè)，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)17 個(gè)，其中1 個(gè)部頒標(biāo)準(zhǔn)僅收載了2 項(xiàng)理化鑒別項(xiàng)，無(wú)薄層鑒別、含量測(cè)定項(xiàng)目，而其余16 個(gè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)增加了靛玉紅等成分的TLC 鑒別或含量測(cè)定項(xiàng)目，故存在較嚴(yán)重的“不同標(biāo)準(zhǔn)” 情況，導(dǎo)致質(zhì)量控制水平落后，市售產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊。

目前，關(guān)于復(fù)方板藍(lán)根顆粒物質(zhì)基礎(chǔ)的文獻(xiàn)較少［2-3］，而涉及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的也集中于中靛玉紅、尿苷等1～4 種成分的控制［4-6］，無(wú)法全面反映該制劑整體質(zhì)量。因此，本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-Q-TOF-MS 法對(duì)復(fù)方板藍(lán)根顆粒進(jìn)行物質(zhì)基礎(chǔ)研究、整體質(zhì)量評(píng)價(jià)，以期為進(jìn)一步提高其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供方向。

1 材料

Waters VION IMS Q-TOF 型液相質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Waters 公司）； Milli-Q Gradient A10 型純水儀（美國(guó)Millipore 公司）； 電子分析天平（德國(guó)Sartorius 公司）； 超聲儀； 離心機(jī)。板藍(lán)根（批號(hào)121177-201608）、大青葉 （批號(hào)121367-200401）對(duì)照藥材及靛玉紅（批號(hào)110717-201805）、（R，S） -告依春（批號(hào)111753-202007）、鳥(niǎo)苷（批號(hào)111977-201501）、腺苷（批號(hào)110879-201703）、尿苷（批號(hào)110887-201803）、酪氨酸（批號(hào)140624-201506）、苯丙氨酸（批號(hào)140624-201506）、牡荊苷（批號(hào)111687-200501）、檸檬酸（批號(hào)111679-200401）、紫丁香苷（批號(hào)111574-200201） 對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院； 靛苷（批號(hào)M06A11K120647 ）、3-吲哚甲醛（批號(hào)H24A9Z59589）、落葉松樹(shù)脂醇 B （ 批號(hào)T06A11Z120554 ）、異金雀花素（批號(hào)P07A11S120560）、異落葉松樹(shù)脂醇 （ 批號(hào)Y28J11H116890） 對(duì)照品均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司； 2，4-喹唑啉二酮對(duì)照品 （批號(hào)20191130） 購(gòu)自上海沃凱生物技術(shù)有限公司。復(fù)方板藍(lán)根顆粒共112 批，來(lái)自50 家企業(yè)（Q1 ～Q50）。乙腈、甲酸為色譜純（德國(guó)Merck 公司）；水為超純水。

2 方法

2.1 UPLC-Q-TOF-MS 分析條件

2.1.1 色譜 Waters HSS T3 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）； 流動(dòng)相乙腈（A） -0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0 ～1 min，100% B； 1 ～6 min，100% ～80%B； 6～18 min，80% ～35%B； 18 ～18.5 min，35% B ～0； 18.5 ～19.5 min，0； 19.5 ～23 min，0 ～100% B）； 體積流量0.5 mL/min； 柱溫40 ℃； 進(jìn)樣量2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜 電噴霧離子源（ESI）； 負(fù)離子掃描； 毛細(xì)管電壓2.5 kV； 錐孔電壓40 V； 除溶劑氣氮?dú)猓w積流量800 L/h； 除溶劑溫度550 ℃；離子源溫度120 ℃； 掃描范圍m/z50 ～1 000； 掃描時(shí)間0.2 s； 碰撞氣氮?dú)猓湍芰繏呙钑r(shí)碰撞能量4 eV，高能量掃描時(shí)碰撞能量25 ～60 eV。以50 pg/μL 亮氨酸-腦啡肽溶液為校正標(biāo)準(zhǔn)液。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取各對(duì)照品適量，甲醇制成質(zhì)量濃度均為20 μg/mL 的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取112 批樣品，每批各約2 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加入10 mL甲醇，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲 （功率250 W，頻率40 kHz，40 ℃以下） 處理1 h，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，4 000 r/min 離心5 min，取上清液，即得。

2.3 數(shù)據(jù)處理與分析 采用UNIFI 軟件采集數(shù)據(jù)，對(duì)于有對(duì)照品的成分，通過(guò)比對(duì)兩者保留時(shí)間、質(zhì)譜碎片特征進(jìn)行鑒定； 對(duì)于沒(méi)有對(duì)照品的成分，查閱中英文相關(guān)文獻(xiàn)，收集已報(bào)道組方藥材中的成分信息，包括名稱(chēng)、分子式、CAS 號(hào)、化學(xué)結(jié)構(gòu)等，建立初步化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)，將UNIFI 軟件與其進(jìn)行自動(dòng)匹配，質(zhì)量數(shù)偏差設(shè)置為±5×10-6，并根據(jù)化合物二級(jí)質(zhì)譜信息進(jìn)行人工確認(rèn)。

3 結(jié)果

3.1 成分鑒定 基峰離子流色譜圖見(jiàn)圖1，共檢測(cè)到37 種主要成分［7-15］，包括8 種生物堿、7 種苯丙素、3 種核苷、2 種氨基酸、6 種有機(jī)酸、4 種黃酮、1 種含硫成分、6 種其他成分，具體見(jiàn)表1。以峰5、7、15、19、20、24 為例，對(duì)其鑒定過(guò)程進(jìn)行分析。

表1 復(fù)方板藍(lán)根顆?；瘜W(xué)成分鑒定結(jié)果Tab.1 Results of chemical constituent identification in Compound Banlangen Granules

圖1 復(fù)方板藍(lán)根顆?；咫x子流色譜圖Fig.1 Base peak ion current chromatogram of Compound Banlangen Granules

峰5 準(zhǔn)分子離子峰m/z282.084 0 ［M-H］-，保留時(shí)間3.66 min，分子式C10H13N5O5； 二級(jí)質(zhì)譜圖中碎片離子為脫去一分子核糖后生成的m/z150.042 4 ［M-H-rib］-，通過(guò)比對(duì)對(duì)照品、查閱文獻(xiàn)［7］、匹配數(shù)據(jù)庫(kù)，推測(cè)該化合物為鳥(niǎo)苷，屬于核苷類(lèi)成分。

峰7 準(zhǔn)分子離子峰m/z164.071 7 ［M-H］-，保留時(shí)間4.27 min，分子式C9H11NO2； 二級(jí)質(zhì)譜圖中碎片離子主要有m/z147.044 4 ［M-H-NH3］-、103.054 1 ［M-H-CO2-NH3］-，通過(guò)比對(duì)對(duì)照品、查閱文獻(xiàn)［7］、匹配數(shù)據(jù)庫(kù)，推測(cè)該化合物為苯丙氨酸，屬于氨基酸類(lèi)成分。

峰15 準(zhǔn)分子離子峰m/z294.098 1 ［M-H］-，保留時(shí)間6.09 min，分子式C14H17NO6； 二級(jí)質(zhì)譜圖中碎片離子為脫去一分子葡萄糖后生成的m/z131.037 2 ［M-H-Glc-H］-，通過(guò)比對(duì)對(duì)照品、查閱文獻(xiàn)［7］、匹配數(shù)據(jù)庫(kù)，推測(cè)該化合物為靛苷，屬于生物堿類(lèi)成分。

峰19 準(zhǔn)分子離子峰m/z729.261 0 ［M ＋COOH］-，保留時(shí)間6.26 min，分子式C32H44O16；二級(jí)質(zhì)譜圖中主要是糖苷鍵斷裂，先丟失一分子或兩分子葡萄糖，再丟失CH2O 形成的碎片離子m/z521.202 5 ［M-H-Glc］-、359.152 3 ［M-H-2Glc］-、329.142 4 ［M-H-2Glc-CH2O］-，通過(guò)比對(duì)對(duì)照品、查閱文獻(xiàn)［12］、匹配數(shù)據(jù)庫(kù)，推測(cè)該化合物為落葉松樹(shù)脂醇B，屬于苯丙素類(lèi)成分。

峰20 準(zhǔn)分子離子峰m/z181.014 5 ［M-H］-，保留時(shí)間6.65 min，分子式C8H6O5； 二級(jí)質(zhì)譜圖中主要是連續(xù)脫去中性分子CO2后形成的碎片離子m/z137.022 4 ［M-H-CO2］-、m/z93.034 4 ［MH-2CO2］-，通過(guò)查閱文獻(xiàn)［7］、匹配數(shù)據(jù)庫(kù)，推測(cè)該化合物為2-羥基-1，4-苯二甲酸，為有機(jī)酸成分。

峰24 準(zhǔn)分子離子峰m/z431.097 9 ［M-H］-，保留時(shí)間7.75 min，分子式C21H20O10； 二級(jí)質(zhì)譜圖碎片離子主要有m/z341.068 9 ［M-HC3H6O3］-、311.056 5 ［M-H-C4H8O4］-、283.060 0［M-H-C5H10O5］-，通過(guò)比對(duì)對(duì)照品、查閱文獻(xiàn)［13］、匹配數(shù)據(jù)庫(kù)，推測(cè)該化合物為牡荊苷，屬于黃酮類(lèi)成分。

3.2 整體質(zhì)量評(píng)價(jià) 選擇3 個(gè)主要生產(chǎn)企業(yè)Q1、Q5、Q9 （收集批次最多） 的33 批樣品（Q1 13批，Q5 11 批，Q9 9 批） 作為研究對(duì)象，采用SPSS 19.0 軟件，以平均Euclidean 距離為度量標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)組間連接法，以37 個(gè)共有峰峰面積為變量進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。由此可知，組間距為10 時(shí)各批樣品聚為3 類(lèi)，Q1 的3、19、2、43、33、1、18、30、32、5、53，Q5 的31、71、34、37、41、8、105、29 為一類(lèi)； Q1 的10、61，Q5 的17、107，Q9 的44、106、20、27、35、26、72、21、13 為一類(lèi)； Q5 的49 為一類(lèi)，表明其總體聚類(lèi)區(qū)分較明顯，同一生產(chǎn)企業(yè)樣品質(zhì)量一致性較好，而不同生產(chǎn)企業(yè)的較差。

圖2 33 批復(fù)方板藍(lán)根顆粒聚類(lèi)分析圖Fig.2 Cluster analysis plot for thirty-three batches of samples

采用SIMCA-P 13.0 軟件，以37 個(gè)共有峰峰面積為自變量，各批樣品為應(yīng)變量，采用偏最小二乘法-判別分析 （PLS-DA） 依次提取3 個(gè)主成分，模型解釋率R2X為0.653，預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q2為0.784，均高于0.5，說(shuō)明擬合程度較好。將模型建立時(shí)分類(lèi)Y矩陣變量定義為隨機(jī)排列20 次，并進(jìn)行置換檢驗(yàn)，得到R2為0.279，Q2為-0.322，表明模型未出現(xiàn)過(guò)擬合。經(jīng)PLS-DA 模型擬合分析得到散點(diǎn)圖、置換檢驗(yàn)圖、VIP 圖，分別見(jiàn)圖3 ～5，可知不同生產(chǎn)企業(yè)樣品分別聚類(lèi)，區(qū)分較明顯，與聚類(lèi)分析結(jié)果一致，表明其質(zhì)量存在一定差異，但同一生產(chǎn)企業(yè)不同批次樣品質(zhì)量差異較小。再對(duì)模型各投影VIP 參數(shù)進(jìn)行分析，其數(shù)值大于1 表明有顯著影響，可作為質(zhì)量差異標(biāo)志物，其中尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷、檸檬酸、酪氨酸是對(duì)分類(lèi)起到最重要作用的5 個(gè)變量，即為區(qū)分不同生產(chǎn)企業(yè)樣品的重要指標(biāo)，提示在生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)重點(diǎn)監(jiān)控其質(zhì)量變化以減少批次間差異，保證整體質(zhì)量穩(wěn)定。

圖3 PLS-DA 得分散點(diǎn)圖（3 家生產(chǎn)企業(yè)）Fig.3 Score scatter plot for PLS-DA （ three production enterprises）

圖4 模型置換檢驗(yàn)圖Fig.4 Permutation test plot for model

圖5 PLS-DA VIP 值Fig.5 VIP values for PLS-DA

采用SIMCA-P 13.0 軟件，以37 個(gè)共有峰峰面積為自變量，112 批樣品為應(yīng)變量進(jìn)行PLS-DA 分析，結(jié)果見(jiàn)圖6。由此可知，Q30 樣品65、66 與Q19 樣品42 明顯離群，與其他生產(chǎn)企業(yè)樣品差異較大，并且 （R，S） -告依春、腺苷、鳥(niǎo)苷、尿苷、靛玉紅色譜峰峰面積明顯小于其他樣品，提示其投料的板藍(lán)根、大青葉質(zhì)量較差。

圖6 PLS-DA 得分散點(diǎn)圖（所有生產(chǎn)企業(yè)）Fig.6 Score scatter plot for PLS-DA （ all production enterprises）

尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷為板藍(lán)根、大青葉共有核苷類(lèi)成分，是區(qū)分不同生產(chǎn)企業(yè)樣品的重要指標(biāo)，而（R，S） -告依春為2020 年版《中國(guó)藥典》 規(guī)定的板藍(lán)根指標(biāo)成分。為了更好地評(píng)價(jià)復(fù)方板藍(lán)根顆粒質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法測(cè)定上述4 種成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。由此可知，不同生產(chǎn)企業(yè)樣品中各成分含量存在顯著差異； 3 家生產(chǎn)企業(yè)樣品中其平均含量依次為Q5＞Q1＞Q9，并且Q9 樣品中各成分總含量?jī)H為Q5 的21.4%，表明其質(zhì)量不佳；Q19、Q30 的3 批樣品中各成分含量偏低，與PLSDA 分析結(jié)果一致，可能存在藥材質(zhì)量較差或不足量投料生產(chǎn)的情況。

4 討論

復(fù)方板藍(lán)根顆粒具有較強(qiáng)的抗菌、抗病毒、增強(qiáng)免疫力等功效［16］，但其現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制項(xiàng)目不足，缺乏專(zhuān)屬性，是導(dǎo)致企業(yè)間產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊的重要原因。另外，水提醇沉工藝不利于靛玉紅溶出； 部分企業(yè)所用板藍(lán)根、大青葉質(zhì)量較差，使得指標(biāo)成分［如靛玉紅、（R，S） -告依春等］ 含量較低； 可能存在不足量投料生產(chǎn)的情況。

本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-Q-TOF-MS 法對(duì)復(fù)方板藍(lán)根顆粒物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行研究，參考文獻(xiàn)、數(shù)據(jù)庫(kù)匹配、二級(jí)質(zhì)譜分析，共鑒定出37 個(gè)化合物，主要為生物堿、苯丙素、核苷、有機(jī)酸、黃酮等，其中板藍(lán)根中的生物堿類(lèi)成分具有多種藥理活性，如抗病毒、抗炎、抗菌、抗腫瘤等［17-19］，有機(jī)酸、核苷類(lèi)成分具有顯著的抗內(nèi)毒素活性［20-21］，結(jié)合氨基酸具有抗病毒、抗炎等作用［22］。再通過(guò)聚類(lèi)分析、PLS-DA 等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法評(píng)價(jià)了復(fù)方板藍(lán)根顆粒整體質(zhì)量，可為該制劑后續(xù)相關(guān)研究提供科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。