王曉燕 孟建輝

糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy, DCM)是糖尿病患者在沒有冠心病、高血壓和心臟瓣膜病等情況下,存在的心臟結(jié)構(gòu)和功能異常[1-3]。DCM主要以心肌細(xì)胞凋亡、心肌間質(zhì)纖維化、左心室舒張和收縮功能障礙等為特征[4,5]。DCM是糖尿病患者心源性猝死和死亡的主要原因[6]。因此,DCM的預(yù)防和治療是亟待解決的難題。目前DCM的發(fā)病機(jī)制仍不清楚,心肌細(xì)胞凋亡是促進(jìn)DCM進(jìn)展的主要危險(xiǎn)因素[7],抑制心肌細(xì)胞凋亡有可能成為改善心功能的有效治療方法。MicroRNAs (miRNAs)是長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA,通過抑制翻譯或裂解靶RNA來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)。以往的研究表明miRNAs參與了多種生物學(xué)過程,包括細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移、凋亡、糖代謝和脂肪代謝等。近期有研究表明miRNAs在DCM中的表達(dá)水平發(fā)生改變[8],并形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)[9,10],miRNAs通過參與轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)影響DCM的心臟功能和重構(gòu)。目前miR-29家族在糖尿病、心血管疾病中的研究日益增多,這些研究主要集中在糖尿病胰島素抵抗、糖代謝異常、脂代謝異常和全身炎性反應(yīng)等方面。筆者發(fā)現(xiàn)miR-29a是否通過心肌細(xì)胞凋亡途徑參與了糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制,尚不清楚。研究起始時(shí)間為2020年10月,本研究采用高糖高脂飲食聯(lián)合腹腔注射鏈脲霉素(streptozotocin, STZ)的方法,成功建立DCM大鼠模型,探討miR-29a在DCM大鼠心肌細(xì)胞凋亡中的作用及其對(duì)心功能的影響,從而為DCM的診治提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 miR-29引物、ReverAid First Strand cDNA Synthesis由廣州銳博公司合成。Rrizol Reagent 購于美國Invitrogen公司。RNAiso Plus、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購于TaKaRa公司。RIPA蛋白抽提試劑盒購于碧云天生物研究所。磷酸酶抑制劑混合物、蛋白酶抑制劑混合物購于凱基生物公司。FITC Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒I購于美國BD公司。羊抗鼠IgG-HRP購于北京中杉金橋生物公司。GAPDH抗體購于北京賽諾博生物技術(shù)中心。Bcl-2、Mcl-1、Bax、Caspase-3和Bak1 抗體均購于Cell signaling Technology Inc。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性、10周齡、Sprague-Dawley(SD)大鼠(體重200±15 g),由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。常規(guī)喂大鼠飼料和飲用水,室溫保持在(24±1.0)℃,濕度50%～60%。所有動(dòng)物使用符合河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物管理委員會(huì)的要求。

1.3 實(shí)驗(yàn)一

1.3.1 動(dòng)物分組及DCM模型的成功建立:20只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=10)和DCM組(n=10)。參考DCM大鼠造模方法[11],模型組大鼠給予高糖高脂飼料(20%蔗糖、10%豬油、基礎(chǔ)飼料),于第4、5周末,禁食12 h,2次腹腔注射1%鏈脲佐菌素(30 mg/kg, STZ),STZ溶液現(xiàn)用現(xiàn)配;對(duì)照組大鼠喂正常飼料,于相同時(shí)間腹腔注射等量檸檬酸緩沖液。72 h后采集尾靜脈血測(cè)定空腹血糖水平(禁食12 h),大鼠連續(xù)2次血糖>16.7 mmol/L被納入DCM組,血糖不達(dá)標(biāo)的被排除。2組大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)10周。

1.3.2 觀察指標(biāo)及方法:觀察測(cè)定2組大鼠體重、尿量、血壓、血糖和HbA1c水平。采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)法測(cè)定2組心肌組織中miR-29a的表達(dá)水平。第14周末,采用10%水合氯醛將大鼠麻醉后,開胸取心臟,取心肌組織,每100毫克心肌組織加入1 ml TRIzol試劑,逐步提取總RNAs,Nanodrop 2000鑒定RNAs的濃度和純度。取原始樣品的RNAs合成cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒檢測(cè)基因表達(dá)水平,在7500定量PCR分析儀上進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè),采用相對(duì)定量2-△△Ct法分別計(jì)算2組心肌組織中miR-29a-3p的表達(dá)水平。PCR反應(yīng)條件:95℃ 預(yù)變性10 min,95℃ 變性10 s,60℃ 退火1 min,共40循環(huán)。

1.4 實(shí)驗(yàn)二

1.4.1 動(dòng)物分組:將16只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=4),DCM組(n=12),DCM大鼠均按實(shí)驗(yàn)一方法造模成功(n=12)。將12只DCM大鼠再隨機(jī)分為:DCM組(n=4),DCM+NC mimics組(n=4)和DCM+miR-29a mimics組(n=4)。分別給予DCM+NC mimics組、DCM+miR-29a mimics組大鼠心肌局部注射攜帶NC mimics慢病毒(4×107個(gè))和攜帶miR-29a-3p mimics慢病毒(4×107個(gè)),并喂養(yǎng)4組大鼠至滿14周。

1.4.2 觀察指標(biāo):①觀察大鼠的心功能:于第14周末大鼠稱重后,腹腔注射1%巴比妥鈉進(jìn)行麻醉。大鼠仰臥位固定,剃胸毛。M型超聲心動(dòng)圖檢測(cè)4組大鼠的心功能。②檢測(cè)指標(biāo)包括:左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)、左心室短軸縮窄率(Left ventricular fractional shortening, LVFS)、舒張?jiān)缙谛氖页溆畲笏俣?E)、舒張晚期心室充盈最大速度(A)、E/A比值、左心室收縮末內(nèi)徑(left ventricular internal dimensions at end systole, LVIDS)、左心室舒張末內(nèi)徑(left ventricular internal dimensions at end diastole, LVIDD)、左心室收縮末期容積(left ventricular end-systolic volume, LVESV)和左心室舒張末期容積(left ventricular end-diastolic volume, LVEDV)。

1.4.3 觀察心肌組織病理學(xué)形態(tài)及心肌細(xì)胞大小:采用HE(hematoxylin and eosin, HE)染色檢測(cè)并比較心肌細(xì)胞大小。 按實(shí)驗(yàn)一中的方法給予大鼠麻醉及開胸,取出心肌組織,以多聚甲醛浸泡24 h,石蠟包埋,切片。根據(jù)HE染色試劑盒的說明書步驟要求對(duì)組織切片進(jìn)行HE染色。最后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.4.4 檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡:取心肌組織,經(jīng)PBS洗滌2次后,大鼠心肌細(xì)胞在結(jié)合緩沖液中重懸,依據(jù)Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒說明步驟,加入熒光探針FITC標(biāo)記的Annexin V 5 μl和碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)10 μl,輕輕混勻,室溫避光下孵育10～20 min,進(jìn)行染色。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。Annexin V-FITC為綠色熒光,PI為紅色熒光。

1.4.5 檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá):采用蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測(cè)凋亡蛋白的表達(dá)水平。RIPA細(xì)胞裂解液提取大鼠心肌組織細(xì)胞總蛋白。取變性的蛋白質(zhì)樣品用SDS/PAGE(12%凝膠),電泳分離蛋白質(zhì),轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,用5%脫脂奶粉封存。加入Bcl-2、Mcl-1、Bax、Caspase-3和Bak1一抗(均以1∶1 000稀釋)在4℃孵育過夜,然后與羊抗鼠二抗(以1∶10 000稀釋)在室溫孵育1 h。滴加ECL化學(xué)發(fā)光液于暗室顯影曝光,采用凝膠成像系統(tǒng)掃描和分析條帶。蛋白的相對(duì)表達(dá)量為蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值之比。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)一結(jié)果

2.1.1 DCM大鼠模型的建立及一般資料比較:7只DCM大鼠造模成功,1只死亡,2只血糖未達(dá)標(biāo)被排除實(shí)驗(yàn)。10只對(duì)照組大鼠均存活。DCM組大鼠的血糖水平、HbAlc水平、收縮壓、舒張壓和尿量均明顯高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與對(duì)照組大鼠相比,DCM大鼠早期體重增加明顯(P<0.01),而成模時(shí)體重下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1、2。

表1 2組大鼠一般資料比較

表2 2組大鼠體重情況比較 g,

2.1.2 2組大鼠心肌中miR-29a的表達(dá):qRT-PCR結(jié)果所示,與對(duì)照組心肌中miR-29a的相對(duì)表達(dá)量(1.08±0.13)相比,DCM組大鼠心肌細(xì)胞中miR-29a的相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)(0.39±0.06),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 實(shí)驗(yàn)二結(jié)果

2.2.1 miR-29a對(duì)大鼠的心功能的影響:與對(duì)照組大鼠相比,DCM大鼠LVEF、LVFS、E/A比值和心率水平降低(P<0.05),LVIDS、LVIDD、LVESV和LVEDV明顯升高(P<0.05);心肌注射miR-29a mimics的DCM大鼠,LVEF和LVFS明顯提高(P<0.01),心率水平得到提高(P<0.05),而LVIDS、LVIDD、LVESV和LVEDV明顯降低(均為P<0.01);注射NC mimics的DCM大鼠沒有這些改變。見表3。

2.2.2 大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)檢測(cè):與對(duì)照組心肌細(xì)胞(14.09±0.45)μm相比,DCM組和DCM+NC組大鼠出現(xiàn)細(xì)胞肥大,分別為(21.81±1.84)μm和(23.26±1.05)μm,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01),細(xì)胞排列混亂,細(xì)胞核稀疏,細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞等。而DCM+miR-29a mimics組心肌細(xì)胞這種病理變化較輕,細(xì)胞肥大也減輕(18.33±0.53)μm,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 大鼠橫截面心臟組織切片(HE染色×200);A 對(duì)照組;B DCM組; C DCM+NC組; D DCM+miR-29amimics組

2.2.3 miR-29a對(duì)DCM大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示,DCM組心肌細(xì)胞凋亡率(19.93±2.71)%和DCM+NC組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率(19.28±1.89)%較對(duì)照組心肌細(xì)胞凋亡率(2.39±0.34)%比較均明顯增加(P<0.01)。與DCM組相比,DCM+miR-29a mimics組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率(13.02±0.58)%明顯降低(P<0.01)。

2.2.4 大鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè):Western blot檢測(cè)顯示,與對(duì)照組相比,DCM組和DCM+NC mimics組大鼠心肌細(xì)胞凋亡蛋白Bax、Caspase-3和Bak1表達(dá)水平增加,抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1表達(dá)水平降低;上調(diào)miR-29a抑制了DCM大鼠心肌細(xì)胞凋亡蛋白Bax、caspase-3和Bak1的表達(dá)水平,提高了Bcl-2和Mcl-1的表達(dá)水平。見表4。

表4 大鼠凋亡蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較 n=4,

3 討論

糖尿病是一種進(jìn)展性代謝紊亂疾病,其發(fā)病率和死亡率每年都在快速增長。DCM是糖尿病患者較嚴(yán)重的心血管并發(fā)癥,增加了DM患者的死亡率。其原因在于DCM在大多數(shù)患者中往往表現(xiàn)出較長的亞臨床期,早期不易被發(fā)現(xiàn),很容易進(jìn)展為心力衰竭,甚至死亡。目前為止,DCM的確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚,進(jìn)一步明確DCM的發(fā)病機(jī)制,早期對(duì)DCM進(jìn)行診斷和干預(yù)其發(fā)病的進(jìn)程,具有重要的臨床意義。

目前臨床上很難得到DCM患者的心肌組織和細(xì)胞,因此動(dòng)物模型被廣泛應(yīng)用于DCM機(jī)制的研究[12]。本研究采用高糖高脂飲食配合低劑量STZ腹腔注射,來成功建立DCM大鼠模型。與對(duì)照組大鼠相比,DCM大鼠逐漸出現(xiàn)萎靡不振、多飲、多食和多尿等糖尿病癥狀;體重表現(xiàn)為早期增長,實(shí)驗(yàn)后期下降的特點(diǎn);檢測(cè)血糖水平、HbA1c水平、收縮壓和舒張壓值均明顯升高。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以往研究結(jié)果[13]一致。此外,DCM組大鼠的心功能較正常大鼠明顯下降。心肌組織HE染色結(jié)果也證實(shí)了DCM模型大鼠存在嚴(yán)重的DCM相關(guān)病理特征。

DCM的發(fā)病機(jī)制尚不明確,經(jīng)典的發(fā)病機(jī)制包括了炎癥反應(yīng)、心肌纖維化、心肌細(xì)胞凋亡、代謝紊亂、線粒體功能異常[14]和氧化應(yīng)激[15,16]。研究表明心肌細(xì)胞凋亡是炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激的結(jié)果,心肌細(xì)胞凋亡所導(dǎo)致的心臟結(jié)構(gòu)和功能異常是DCM發(fā)生的重要環(huán)節(jié)[17]。在細(xì)胞凋亡調(diào)控基因中,最受關(guān)注的是參與線粒體凋亡通路的Bcl-2家族和caspase家族。Bcl-2家族由控制線粒體完整性的抗凋亡因子和促凋亡因子組成,它們?cè)谝种苹虼龠M(jìn)促凋亡蛋白的作用中發(fā)揮重要作用。促凋亡蛋白Bax和Bak1通過在線粒體外膜上形成孔介導(dǎo)細(xì)胞色素釋放,而抗凋亡蛋白Bcl-2主要抑制Bax和Bak1的激活;caspase-3是caspase家族最重要的因子。 本研究中Western blot結(jié)果顯示,STZ誘導(dǎo)上調(diào)了大鼠心肌細(xì)胞凋亡蛋白Bax、caspase3和Bak1的表達(dá)水平,下調(diào)了抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1的表達(dá)水平;同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示DCM大鼠的細(xì)胞總凋亡率明顯增加,說明DCM大鼠確實(shí)發(fā)生了心肌細(xì)胞凋亡,而這種心肌細(xì)的損傷是通過上調(diào)心肌細(xì)胞中Bax、caspase3和Bak1的表達(dá)水平及下調(diào)Bcl-2和Mcl-1的表達(dá)水平來實(shí)現(xiàn)的。

研究表明,miRNAs普遍存在于真核生物中,參與多種生物過程,包括細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移、凋亡、葡萄糖代謝、脂肪代謝等[18,19]。miRNAs通過與靶基因的3'-UTR區(qū)域結(jié)合來調(diào)控靶基因的表達(dá),一種miRNA可能調(diào)控多個(gè)靶基因,同時(shí)一種靶基因可能又受多個(gè)miRNAs的調(diào)控,它們形成了非常復(fù)雜而龐大的的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。miR-29家族在血管內(nèi)皮細(xì)胞、主動(dòng)脈組織、心肌組織和心肌細(xì)胞、心臟代謝等多個(gè)部位均具有調(diào)節(jié)作用[20]。MicroRNA-29a在2型糖尿病中與IGF1結(jié)合調(diào)控心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移[21];MiR-29在心肌梗死心肌重塑中發(fā)揮重要作用[22];Sun等[23]研究表明,miR-29通過外泌體以TRAF-3依賴的方式促進(jìn)循環(huán)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的招募和激活,促進(jìn)炎癥和糖尿病的發(fā)生。目前關(guān)于疾病針對(duì)RNA靶點(diǎn)的干預(yù)治療是新的熱點(diǎn)。

為了闡明miR-29a與DCM發(fā)病的可能關(guān)系,本研究實(shí)驗(yàn)一首先分析了miR-29a在大鼠心肌組織中的表達(dá)水平的變化情況。實(shí)驗(yàn)一結(jié)果顯示,DCM大鼠心肌組織中miR-29a的表達(dá)水平顯著下調(diào)。那么miR-29a表達(dá)下調(diào)提示,miR-29a過表達(dá)可能成為一種潛在的DCM治療方法。 因此,本研究實(shí)驗(yàn)二探討了miR-29a模擬劑對(duì)DCM大鼠的可能治療作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示miR-29a對(duì)大鼠心肌的保護(hù)作用可能是通過影響心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)因子來實(shí)現(xiàn)的。DCM大鼠心肌組織注射攜帶miR-29a mimics慢病毒后,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示大鼠的心肌細(xì)胞凋亡得到了緩解。進(jìn)一步Western blot結(jié)果表明,miR-29a的上調(diào)明顯抑制了凋亡相關(guān)蛋白Bax、caspase3和Bakl表達(dá)水平的增加,并上調(diào)了抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1的表達(dá)水平。miR-29a可能通過影響多個(gè)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子參與了DCM的發(fā)病機(jī)制;同時(shí),HE染色表明,miR-29a模擬劑治療可以減輕DCM大鼠的心肌細(xì)胞肥大情況,緩解心肌組織的相關(guān)病理特征。心臟超聲多普勒成像是檢測(cè)DCM的有效方法[24],LVEF、LVFS是評(píng)價(jià)心臟收縮功能的指標(biāo),E/A比值用來反映心臟舒張功能。同時(shí)本研究結(jié)果顯示,心肌注射攜帶miR-29a mimics慢病毒治療10周后,LVEF和LVFS得到了明顯提高,而LVIDS、LVIDD、LVESV和LVEDV明顯降低,說明 miR-29a模擬劑治療可以改善DCM大鼠的心功能,上調(diào)心肌細(xì)胞miR-29a的水平對(duì)DCM大鼠的心肌損傷具有保護(hù)作用。過表達(dá)miR-29a可以通過降低凋亡蛋白Bax、caspase3和Bakl的表達(dá)水平,并升高抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1的表達(dá)水平來緩解DCM大鼠的心肌細(xì)胞凋亡,從而改善其心臟功能。

綜述所述,DCM大鼠心肌細(xì)胞中miR-29a的表達(dá)水平降低,上調(diào)miR-29a可能通過調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)因子減輕DCM大鼠心肌細(xì)胞凋亡水平,從而起到改善心功能的作用。本研究可能為DCM的治療提供新的靶點(diǎn)。