陳 俠，賴滿香，劉筱藹，來慧麗

廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，廣東 廣州 510520

膠質(zhì)瘤來源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，也是最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤類型，約占全部惡性腫瘤的75%。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤具有浸潤性生長、惡性程度高、復(fù)發(fā)率高、難治愈等特點(diǎn)［1］。世界衛(wèi)生組織將腦膠質(zhì)瘤可分為Ⅰ～Ⅳ期，Ⅰ～Ⅱ期為低分級，Ⅲ～Ⅳ期為高分級，其中Ⅰ期為良性，Ⅳ期侵襲性以及惡性程度最高，嚴(yán)重威脅患者的生命安全［2-3］。因此臨床對于腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生機(jī)制、病情發(fā)生以及發(fā)展進(jìn)行不斷研究，以期尋找新的腦膠質(zhì)瘤的基因治療手段［4-5］。隨著基因技術(shù)的發(fā)展，有研究學(xué)者利用芯片技術(shù)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株檢測到5 000 多個生物基因，其中多種MicroRNA 表達(dá)異常。MicroRNA 是一種具有調(diào)控功能的非蛋白質(zhì)編碼單鏈小分子RNA，可通過轉(zhuǎn)錄抑制翻譯而發(fā)揮對基因調(diào)控作用［6-7］。近年來，有研究明確了MicroRNA-384在結(jié)腸癌、肺癌以及肝癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞的發(fā)生機(jī)制中有著至關(guān)重要的作用，但未對MicroRNA-384在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中表達(dá)變化進(jìn)行闡述［8］。為此，本研究就MicroRNA-384在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株表達(dá)變化以及臨床意義進(jìn)行深入探究，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究材料低分級腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株（3 例）、高分級腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株（5例）、正常腦組織細(xì)胞株（7例）均購買于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物所，RPMI1640 培養(yǎng)基、高糖DMEM、胎牛血清（FBS）均購買于杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；總RNA 提取試劑盒購買于上海信裕生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)率試劑盒、PCR購買于美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞株培養(yǎng) 細(xì)胞株采用在含有高糖DMEM 與10%的胎牛血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并放置在37 ℃且含有5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天更換液體1次，3～4 d傳代1次［9］。

1.2.2 RNA 的提取 根據(jù)總RNA 提取試劑盒說明書進(jìn)行提取，將細(xì)胞株放置在微量離心機(jī)中以800 r/min 的低速離心處理3 min，應(yīng)用巴斯德吸管吹打15～30 次，取單細(xì)胞懸液，放置在有RNA 酶的離心管中，加入三氯甲烷250 μL，充分搖勻后，靜止5 min［13］。繼續(xù)放置在離心機(jī)中分離。完成后，將液體吸干，放置在50 ℃環(huán)境中，促進(jìn)RNA 進(jìn)一步的降解。并應(yīng)用分光光度儀測量所得RNA 的濃度，并將樣本放置在-75 ℃環(huán)境冷凍處理［10］。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄 將無RAN 酶的PCR 管加入2 μg 的RNA 溶液，依次加入清洗緩沖液（5 μL）、反轉(zhuǎn)錄試劑（2 μL）、抑制劑（0.330 μL）以及逆轉(zhuǎn)錄酶（200 u/μL）后，得到cDNA［11-12］。

1.2.4 定量PCR 取0.2 μL cDNA 加入0.2 mL PCR 試劑管中，與2 μL 的5.5 μM 基因產(chǎn)物、2.5 μL 的cDNA、7.0 μL的去RNA 酶水進(jìn)行PCR 反應(yīng)，并應(yīng)用U6 作為內(nèi)參。95 ℃預(yù)變性5 min，40個循環(huán)，95 ℃15 s，60 ℃退火30 s［13］。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251 購買于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物所，用10%的胎牛學(xué)清、150 μg/mmL鏈霉素以及150 μg/mmL 青霉素高糖DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，參照轉(zhuǎn)染試劑盒對膠質(zhì)瘤細(xì)胞系轉(zhuǎn)染MicroRNA-384。

1.2.6 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力 將稀釋好護(hù)的基質(zhì)膠均勻鋪墊在Transwell 小室，放置在室溫37 ℃環(huán)境下凝固30 min，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞根據(jù)接種密度含有預(yù)處理后的6 孔板總，細(xì)胞接種在Transwell 小室，加入200 μL無血清中的DMEM 的培養(yǎng)基中，加入含有10%胎牛血清400 μL 中，應(yīng)用無菌棉簽擦拭Transwell 小室上表面的細(xì)胞和基質(zhì)膠，并轉(zhuǎn)移至晶紫染液總，溫室反應(yīng)15 min 后，在顯微鏡下挑選7 個計數(shù)拍照，計算其平均數(shù)，重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 27.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株（8 株） MicroRNA-384 的含量為（0.25±0.08），與膠質(zhì)瘤組織旁正常組織細(xì)胞株（7 株）中MicroRNA-384 的含量（0.37±0.05）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)有意義（P＜0.05）。

不同病理分級腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中MicroRNA-384的含量比較，高分級腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株（5 株）中MicroRNA-384 的含量（0.24±0.03）低于低分級腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株（3 株）中MicroRNA-384 的含量（0.31±0.04），差異有統(tǒng)計學(xué)有意義（P＜0.05）。

不同時間MicroRNA-384 組的U251 細(xì)胞增殖抑制率高于正常細(xì)胞組，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中MicroRNA-384表達(dá)受到抑制，隨著培養(yǎng)時間延長其促進(jìn)或抑制效果更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)有意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組不同時間點(diǎn)U251細(xì)胞增殖情況（±s）

表1 兩組不同時間點(diǎn)U251細(xì)胞增殖情況（±s）

組別不轉(zhuǎn)染任何基因組（n=4）MicroRNA-384組（n=4）t值P值12 h 24 h 36 h 48 h 72 h 4.27±2.364.97±0.725.16±0.815.31±1.456.27±2.36 11.36±3.0117.36±5.2422.39±6.0129.19±6.3728.36±5.72 3.707 0.010 4.684 0.003 5.682 0.001 7.311＜0.001 7.139＜0.001

3 討論

腦膠質(zhì)瘤屬于高發(fā)性惡性腫瘤，其發(fā)病率是人類腦瘤中的第2 位，僅次于腦膜瘤，中位生存期不足9 個月，且具有較高的侵襲性，手術(shù)后易復(fù)發(fā)，5年生存率不足3%［14］。目前，許多臨床醫(yī)生對于手術(shù)治療腦膠質(zhì)瘤力求全切，但是部分患者腫瘤生長位置較為特殊，在手術(shù)治療后會存在部分殘留。而對于腦膠質(zhì)瘤的藥物治療相對單一，除低級別可全部手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤外，應(yīng)采取放化療治療。但是在化療藥物中，特異性與療效較高的藥物較少，導(dǎo)致患者的生活質(zhì)量以及預(yù)后得不到明顯的改善，為此尋找新型的標(biāo)記物對腦膠質(zhì)瘤的早期診斷以及預(yù)后具有積極的影響。

近幾年來，隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，對miRNA 的不斷深入研究，膠質(zhì)瘤的治療手段也取得較大的進(jìn)展。miRNA 在疾病的發(fā)生發(fā)展占據(jù)不可估量的作用。miRNA 是一種可以通過RNA 序列轉(zhuǎn)錄成具有功能性的RNA 小分子，雖然不能轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)，但是可對靶分子mRNA 進(jìn)行識別并與其配對，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的翻譯受到抑制，從而在多種疾病中發(fā)揮其獨(dú)特的作用。一直以來，由于miRNAs不編碼蛋白而未引起學(xué)者們的重視，但是人們發(fā)現(xiàn)30%以上的人類基因因miRNAs靶點(diǎn)而成為人類最豐富的調(diào)控基因之一。其不僅數(shù)量巨大，且在動植物細(xì)胞以及分子過程中具有關(guān)鍵的作用。另外，miRNA 可以通過mRNA 與調(diào)節(jié)基因調(diào)控蛋白，與腫瘤轉(zhuǎn)移、發(fā)展等過程存在關(guān)聯(lián)，發(fā)揮著抑制癌基因的生理作用。此外， miRNA 具有較為顯著的組織特異性，尤其是在惡性腫瘤中表達(dá)更為明顯。根據(jù)miRNA 這一特點(diǎn)，腫瘤細(xì)胞株中某種miRNA 的表達(dá)可作為腫瘤診斷標(biāo)志物，為腫瘤的靶向治療提供新思路。腫瘤細(xì)胞中存在miRNA的片段，不同miRNA 在腫瘤中所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)有所不同。miRNA 存在于腫瘤中的發(fā)生改變的染色體區(qū)域內(nèi)，而腫瘤的易感性與miRNA 的病變、缺失、擴(kuò)增相關(guān)。因而，檢測腫瘤細(xì)胞株內(nèi)的miRNA 對疾病的嚴(yán)重程度以及預(yù)后等具有積極的意義。本研究發(fā)現(xiàn)，MicroRNA-384 在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)下調(diào)，且隨著病理級別的升高，MicroRNA-384的表達(dá)水平顯著下調(diào)。

MicroRNA-384 屬于一種少有研究的保守型miRNA，隨著基因技術(shù)的進(jìn)步，越來越多的研究學(xué)者開始探索MicroRNA-384 在腫瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制。有研究［15］發(fā)現(xiàn)，MicroRNA-384 在胰腺癌細(xì)胞株中呈低表達(dá)，并通過細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MicroRNA-384 的上調(diào)可抑制腫瘤細(xì)胞的遷移以及侵襲。白曉斌等［16］研究中發(fā)現(xiàn)，在肺癌中，MicroRNA-384 的上調(diào)可抑制長鏈非編碼RNA的NEAT1（核富集轉(zhuǎn)錄體）的分裂以及增值等。由此說明，MicroRNA-384具有抑制癌細(xì)胞的作用［16］。分析MicroRNA-384 可靶向的抑制PIWIL4 基因的轉(zhuǎn)錄后的翻譯水平，繼而可調(diào)節(jié)下游的STAT3、鋅指轉(zhuǎn)錄因子、VEGF 的表達(dá)，從而促進(jìn)體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞的消退。

本研究中，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中MicroRNA-384 的含量明顯低于膠質(zhì)瘤組織旁正常組織細(xì)胞株中MicroRNA-384的含量。且MicroRNA-384 的含量隨著腦膠質(zhì)瘤病理分期的升高而降低。不同時間MicroRNA-384 組的U251 細(xì)胞增殖抑制率高于正常細(xì)胞組。不同時間MicroRNA-384 組的U251 細(xì)胞增殖抑制率高于正常細(xì)胞組，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中MicroRNA-384 表達(dá)受到抑制，隨之培養(yǎng)時間延長其促進(jìn)或抑制效果更明顯，表明MicroRNA-384 在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中有著重要的意義，且隨著腫瘤的惡性程度增加而表達(dá)降低。通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，MicroRNA-384 可表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞增殖與侵襲。

綜上所述，MicroRNA-384 在腦膠質(zhì)瘤中呈低表達(dá)，且隨著病理分級程度的升高而降低，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中MicroRNA-384 表達(dá)受到抑制，隨之培養(yǎng)時間延長其促進(jìn)或抑制效果更明顯，且不同時間MicroRNA-384 組的U251細(xì)胞增殖抑制率高于正常細(xì)胞組，其含量的測定可評估腦膠質(zhì)瘤分化程度，為臨床靶向治療提供新思路。