鄒 宏,夏應(yīng)菊,李 玲,徐 璐,趙俊杰,王團(tuán)結(jié),張乾義*,宋振輝

(1.西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,重慶 402460;2.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 國(guó)家/WOAH豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室,北京 100081)

當(dāng)前,隨著豬瘟兔化弱毒疫苗(C株)的使用,CSF得到有效控制[1],但近年來(lái)多地報(bào)道的慢性豬瘟和非典型瘟病毒流行,使防控形勢(shì)變得嚴(yán)峻復(fù)雜[2]。BVDV與CSFV同屬于黃病毒科瘟病毒屬[3],兩者核苷酸序列同源性約60%,彼此存在血清學(xué)交叉反應(yīng)[4]。1973年[5]首次證實(shí)BVDV可自然感染豬[5],且實(shí)驗(yàn)室診斷中常能檢測(cè)到BVDV抗體。此外,商品化胎牛血清及用于疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞系中也有BVDV污染的報(bào)道[6]。豬瘟疫苗在生產(chǎn)過(guò)程中利用牛源血清增殖病毒,一旦血清中含有BVDV,就容易造成豬瘟疫苗中BVDV污染,進(jìn)而感染豬群,導(dǎo)致豬瘟疫苗免疫失敗,容易存在生物安全風(fēng)險(xiǎn)和疫病傳播隱患。

為加強(qiáng)CSFV和BVDV臨床病例的混合感染診斷、生物制品及相應(yīng)原料BVDV的篩查,本研究基于快速、準(zhǔn)確、敏感的RT-qPCR檢測(cè)方法,針對(duì)CSFVE2片段及BVDV 5′UTR片段設(shè)計(jì)引物和探針,建立了一種更加敏感的雙重RT-qPCR方法,旨在能更特異地的區(qū)分CSFV和BVDV,為這兩種病毒的分子生物學(xué)檢測(cè)、流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 毒株及臨床樣本

CSFV、BVDV、口蹄疫病毒(FMDV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬圓環(huán)病毒2型病毒(PCV 2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬流感病毒(SIV)、日本乙型腦炎病毒(JEV)、豬非典型瘟病毒(APPV)、非洲豬瘟病毒(ASFV)的毒株及116份臨床病料均由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存 。

1.2 引物和探針的設(shè)計(jì)及合成

利用MEGA軟件對(duì)NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的BVDV 5′UTR、CSFVE2 基因序列進(jìn)行比對(duì),通過(guò)Primer 5軟件對(duì)每個(gè)病原分別設(shè)計(jì)引物和探針。引物和探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 重組陽(yáng)性質(zhì)粒模板的制備

根據(jù)核酸提取試劑盒以CSFV-C株、BVDV-NADL標(biāo)準(zhǔn)毒株為模板提取病毒RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),回收純化。將產(chǎn)物與pGEM-TEasy載體連接,轉(zhuǎn)化、菌液PCR鑒定為陽(yáng)性后,進(jìn)一步測(cè)序鑒定。通過(guò)核酸測(cè)定儀檢測(cè)質(zhì)粒濃度,使用道爾頓計(jì)算法計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù),ddH2O將質(zhì)粒稀釋成1.0×100～1.0×109copies·μL-1后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RT-qPCR反應(yīng)條件優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

使用濃度為1×104copies·μL-1的兩種重組質(zhì)?；旌虾笞鳛槟０?對(duì)退火溫度、引物及探針濃度進(jìn)行優(yōu)化。以質(zhì)粒濃度為1.0×107～1.0×102copies·μL-16個(gè)稀釋度的兩種重組質(zhì)?；旌虾笞鳛槟０?按優(yōu)化好的反應(yīng)條件進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 靈敏度試驗(yàn)

取濃度為1.0×103～1.0×100copies·μL-1的兩種重組質(zhì)?；旌虾笞鳛槟０暹M(jìn)行雙重RT-qPCR擴(kuò)增;用1.0×107～1.0×100copies·μL-1的兩種重組質(zhì)粒各自作為模板,進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增,比較兩種擴(kuò)增方法的靈敏度。

1.6 特異性試驗(yàn)

分別以BVDV、CSFV、ASFV、APPV、FMDV、PPV、PRV、PCV2、PRRSV、PEDV、TGEV、SIV、JEV的病毒核酸作為樣本,采用上述優(yōu)化好的方法進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增,檢測(cè)該方法的特異性。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

分別取1.0×102、1.0×104、1.0×106copies·μL-1的兩種重組質(zhì)?；旌虾笞鳛槟０?按照建立的雙重RT-qPCR方法擴(kuò)增,每個(gè)陽(yáng)性質(zhì)粒做3次重復(fù),計(jì)算組內(nèi)和組間的變異系數(shù)。

1.8 臨床樣品的檢測(cè)

利用建立的雙重RT-qPCR方法及現(xiàn)行的CSFV RT-qPCR檢測(cè)方法(GB/T 27540—2011)、BVDV RT-qPCR檢測(cè)方法(GB/T 18637—2018)分別對(duì)山西省豬場(chǎng)臨床樣品、CSFV石門株感染動(dòng)物組織樣品、BVDV-NADL株共109份不同組織、全血及7份來(lái)自不同生產(chǎn)商的胎牛血清進(jìn)行檢測(cè),并比較二者之間的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 CSFV、BVDV陽(yáng)性質(zhì)粒模板的制備及RT-qPCR檢測(cè)方法的建立

分別將CSFV-E2、BVDV-5′UTR克隆至pGEM-T載體構(gòu)建重組質(zhì)粒,PCR擴(kuò)增后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證,目的條帶大小為1 100 bp(CSFV-E2)和385 bp(BVDV-5′UTR),測(cè)序結(jié)果顯示插入片段同源性均為100%。優(yōu)化后的RT-qPCR反應(yīng)體系為 25 μL,2×HyperProbe Mixture 12.5 μL,CSFV-E2-F1/CSFV-E2-R1/CSFV-E2-P1和BVDV-F1/

BVDV-R1各加1 μL,BVDV-P1 加0.5 μL,模板2 μL,ddH2O 5 μL。反應(yīng)程序 95 ℃ 30 s;95 ℃ 10 s;58 ℃ 20 s,45個(gè)循環(huán)。

將濃度為1.0×101～ 1.0×106copies·μL-1的兩種重組質(zhì)?；旌虾笞鳛槟０暹M(jìn)行雙重RT-qPCR擴(kuò)增,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,見圖1。結(jié)果顯示CSFV-E2 回歸方程式y(tǒng)=-3.636 8x+38.567,相關(guān)系數(shù)R2為0.998 6;BVDV-5′UTRy=-3.666 4x+37.476,相關(guān)系數(shù) R2為 0.998 1。表明兩種重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)均與各自的Ct值有良好的線性關(guān)系。

A. 熒光定量PCR結(jié)果:1～6.1×106 ～1×101 copies·μL-1CSFV陽(yáng)性質(zhì)粒;7～12.1×106 ～1×101 copies·μL-1BVDV陽(yáng)性質(zhì)粒;B. CSFV和BVDV標(biāo)準(zhǔn)曲線A. Results of RT-PCR:1-6. 1×106 ～1×101 copies·μL-1 CSFV positive plasmids;7-12. 1×106 ～1×101 copies·μL-1 BVDV positive plasmids;B. CSFV and BVDV standard curves圖1 CSFV、BVDV標(biāo)準(zhǔn)曲線建立結(jié)果Fig.1 Results of CSFV and BVDV standard curve creation

2.2 敏感性試驗(yàn)

將濃度為1.0×107～ 1.0×100copies·μL-1的混合質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板,進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增;將濃度為1.0×103～1.0×100copies·μL-1的混合質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行雙重RT-qPCR擴(kuò)增。結(jié)果表明,該方法檢測(cè)的最低拷貝數(shù)均為5 copies·μL-1;普通PCR擴(kuò)增最低檢測(cè)極限均為103copies·μL-1。前者比后者更敏感,表明所建方法敏感性較高(圖2)。

A. CSFV熒光定量PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果;B. CSFV普通PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果;C. BVDV熒光定量PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果;D. BVDV普通PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果。M. Marker;1～8. 1×107 ～1×100 copies·μL-1;9. 陰性對(duì)照(-)A. CSFV real-time RT-PCR sensitivity test results; B. CSFV normal PCR sensitivity test results; C. BVDV real-time RT-PCR sensitivity test results; D. BVDV normal PCR sensitivity test results. M. marker; 1-8: 1×107 ～1×100 copies·μL-1; 9. Negative control (-)圖2 熒光定量PCR和普通PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Results of real-time RT-PCR and PCR sensitivity tests

2.3 特異性試驗(yàn)

分別以BVDV、CSFV、ASFV、APPV、FMDV、PPV、PRV、PCV2、PRRSV、PEDV、TGEV、SIV、JEV的核酸為模板,用建立的雙重RT-qPCR 方法檢測(cè),結(jié)果顯示僅CSFV、BVDV出現(xiàn)特異性擴(kuò)增,其他病原均為陰性,表明本方法具有很好的特異性。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

以1.0×102、1.0×104、1.0×106copies·μL-1的兩種重組質(zhì)?；旌虾笞鳛槟０?進(jìn)行組內(nèi)和組間的重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果表明變異系數(shù)均小于2%,說(shuō)明本方法具有很好的重復(fù)性。

2.5 臨床樣品檢測(cè)

本研究建立的雙重RT-qPCR方法對(duì)109份臨床樣品及7份商品化牛血清進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,CSFV 陽(yáng)性率為12.9%;BVDV 陽(yáng)性率為6.0%,與BVDV(GB/T 18637—2018)、CSFV(GB/T 16551—2020)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)診斷技術(shù)檢測(cè)結(jié)果一致,符合率為100%,表明此次建立的方法可用于CSFV和BVDV流行病學(xué)調(diào)查。

3 討 論

此前,為鑒別CSFV和BVDV,梁洪等[7]建立了BVDV與CSFV雙重RT-PCR一步檢測(cè)法,縮短了檢測(cè)時(shí)間,減少了操作污染,張宏偉等[8]、韋雪華等[9]建立了CSFV與BVDV雙重RT-qPCR檢測(cè)方法,前者僅為定性檢測(cè),后者對(duì)兩種疾病的檢測(cè)極限分別為36和100 copies·μL-1。較之相比,本研究建立的雙重RT-qPCR檢測(cè)方法最低檢測(cè)極限為5 copies·μL-1,具有很高的敏感性;對(duì)其他豬群常見病原及陰性對(duì)照均未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增,展現(xiàn)出良好的特異性,在CSFV、BVDV早期鑒別診斷中更具優(yōu)勢(shì)。

豬群BVDV的感染原因尚不明確,Tao等[10]認(rèn)為,早期豬群BVDV感染是與牛直接接觸導(dǎo)致感染。目前由于集約化、規(guī)?；B(yǎng)殖的不斷提升及養(yǎng)殖技術(shù)、生物安全管理的不斷加強(qiáng),牛群與豬群直接接觸的機(jī)會(huì)較少,BVDV病原的直接有效傳播基本被阻斷。但隨著CSF疫苗與牛源生物制品的廣泛應(yīng)用,BVDV 間接感染豬群的事件時(shí)有報(bào)道[6]。利用本研究中建立的雙重RT-qPCR檢測(cè)方法對(duì)7個(gè)不同生產(chǎn)商購(gòu)買的胎牛血清檢測(cè)出5個(gè)BVDV陽(yáng)性血清,表明商品化牛血清中存在BVDV污染。商品化牛血清的品質(zhì)與牛場(chǎng)生物安全及BVDV控制情況息息相關(guān),目前生產(chǎn)廠家普遍采用輻射滅菌殺死病原微生物,雖然其不具有傳染性,但感染BVDV的牛血清用于種毒繁殖可能會(huì)中和CSFV導(dǎo)致豬瘟抗原效價(jià)偏低,且隨著細(xì)胞苗的大規(guī)模使用,有必要保證其生產(chǎn)過(guò)程及終產(chǎn)品的有效性和安全性,因此對(duì)CSFV和BVDV進(jìn)行鑒別檢測(cè)有較大意義。

4 結(jié) 論

本研究構(gòu)建了一種CSFV和BVDV雙重鑒別診斷RT-qPCR方法,可滿足生產(chǎn)實(shí)踐和臨床檢測(cè)的需要,為CSFV和BVDV的鑒別診斷提供了更加敏感的檢測(cè)方法,也為我國(guó)豬瘟的凈化提供了新的技術(shù)支撐。