武周慧,王 瑜,杜 衡,王之文,肖 爽,武金亮,王 真

(北京農(nóng)學院動物科學技術學院,獸醫(yī)學(中獸醫(yī))北京市重點實驗室,北京 102206)

沙門菌(Salmonella)作為食源性腹瀉中腸桿菌科重要的病原菌之一,主要通過食品和水引起人和動物的沙門菌病[1],引起人畜共患沙門菌病的兩大血清型是腸道沙門菌亞種的鼠傷寒沙門菌(SalmonellaTyphimurium)和腸炎沙門菌(SalmonellaEnteritidis)[2-3]。沙門菌廣泛存在于自然環(huán)境中,因其極強的致病性,可在宿主內(nèi)定殖,導致人類宿主持續(xù)性感染[4],引發(fā)食物中毒類突發(fā)公共衛(wèi)生事件[5]。在全球范圍內(nèi),每年約有1億人患腹瀉,9 715人死亡,死亡人數(shù)中有41%因感染沙門菌腹瀉病而死亡[6-7]。沙門菌攜帶的耐藥基因種類越來越多,多重耐藥性不斷增高,耐藥基因的轉(zhuǎn)移和傳播對公共衛(wèi)生和食品安全產(chǎn)生了嚴重危害[8]。

大多數(shù)抗生素是從天然產(chǎn)物和合成物的庫中發(fā)現(xiàn)的具有抑制細菌生長的化合物[9],隨著抗生素的濫用,迫切需要尋求新的抗菌劑來解決抗生素的耐藥問題。小分子抑制劑是一類能夠靶向作用于蛋白,降低蛋白活性或者阻礙生化反應、分子量小于1 000 u的有機化合物分子[10]。小分子抑制劑在精細調(diào)控細胞生命和功能方面具有顯著優(yōu)勢,被廣泛應用,使其成為近年來生命科學研究中重要的工具藥。

替拉扎明(tirapazamine, TPZ)是一種缺氧細胞毒素和缺氧選擇性生物還原劑[11],也是一種小分子抑制劑,在缺氧條件下導致DNA雙鏈斷裂和染色體斷裂[12]。2013年,Shah等[13]報道在厭氧條件下,替拉扎明對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和艱難梭菌具有不同程度的殺菌活性。近期研究表明,負載替拉扎明的微球有協(xié)同抗腫瘤作用[14]。金納米顆粒與替拉扎明結(jié)合增強了腫瘤靶向性[15]。本實驗室前期以腸桿菌RNA聚合酶結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子DksA為靶標,通過計算機虛擬篩選技術基于DksA蛋白進行靶向藥物小分子抑制劑的篩選,結(jié)果顯示,替拉扎明是具有顯著活性,與靶標蛋白DksA具有高親和力的小分子化合物之一。

為了探明替拉扎明對沙門菌的殺菌機制,本研究通過替拉扎明對多重耐藥沙門菌的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)和最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration, MBC)試驗、抗菌活性研究、時間殺菌曲線及生物被膜形成能力測定,研究了替拉扎明對多重耐藥沙門菌的抗菌活性,為耐藥性沙門菌病的防治提供新的治療方案和潛在候選藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

鼠傷寒沙門菌S.Typhimurium(ATCC 14028)和沙門菌臨床分離株(ST-1、ST-3、ST-6、ST-7、ST-71和ST-477)均由本實驗室保存。

LB培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基和藥敏紙片購自北京索萊寶有限公司,10 g·L-1結(jié)晶紫和二甲基亞砜(DMSO)購自國藥化學試劑有限公司,替拉扎明和諾氟沙星購自上海陶術生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養(yǎng) 取-80 ℃保存的沙門菌進行復蘇,在生物安全柜中無菌劃線接種于LB(luria-bertani)固體培養(yǎng)基,倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～16 h,挑取單菌落接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃ 180 r·min-1搖床培養(yǎng)12～16 h,菌液在LB液體培養(yǎng)基1∶100擴大培養(yǎng)至OD630 nm為0.4～0.5,稀釋計數(shù)后調(diào)整菌液濃度為作用濃度。

1.2.2 沙門菌耐藥性分析 根據(jù)臨床和實驗室標準化委員會(CLSI)推薦的操作,采用K-B(Kirby-Bauer)藥敏紙片擴散法[16],用24種臨床常用抗菌藥物對鼠傷寒沙門菌S.Typhimurium ATCC 14028(ST)和沙門菌臨床分離株(ST-1、ST-3、ST-6、ST-7、ST-71和ST-477)使用MH培養(yǎng)基(Mueller-Hinton)進行藥物敏感試驗。依據(jù)CLSI中腸桿菌科抑菌直徑解釋標準進行敏感、中介和耐藥的判讀?？咕幬锇é?內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、喹諾酮類、林可霉素類、多肽類、酰胺醇類、磺胺類和利福霉素類。

1.2.3 替拉扎明對沙門菌最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定 根據(jù)替拉扎明和對照藥物諾氟沙星(norfloxacin)最大溶解度,使用DMSO進行溶解,儲存于4 ℃,使用前用MH培養(yǎng)基稀釋成濃度為800 μmol·L-1的母液,DMSO濃度<0.1%(已經(jīng)試驗證實該濃度不影響沙門菌的正常生長,見OSID相關材料中圖S1)。選擇臨床和實驗室標準研究所推薦的肉湯微量稀釋法測定替拉扎明的MIC[17]。在96孔培養(yǎng)板中,用MH培養(yǎng)基將初始濃度為800 μmol·L-1的替拉扎明進行2倍倍比稀釋,稀釋后濃度分別為400、200、100、50、25、12.5、6.25和3.125 μmol·L-1,再分別加入等體積100 μL 1×106CFU·mL-1沙門菌懸液,以MH培養(yǎng)基為空白對照,以沙門菌懸液為陽性對照,以諾氟沙星為對照藥物,每組重復3個復孔。將96孔板置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,使用酶標儀測定OD630 nm,記錄試驗結(jié)果,MIC為抑制細菌生長的藥物最小濃度。

選擇96孔板上比MIC值大的各孔內(nèi)培養(yǎng)物100 μL,均勻涂布到MH培養(yǎng)基上,在37 ℃溫箱中培養(yǎng)16～18 h,觀察培養(yǎng)基上菌落生長狀況,記錄菌落數(shù)量,通過殺滅99.9%初始細菌種群的最低濃度確定最小殺菌濃度,即MBC值[18]。MBC值測定獨立進行3次。

1.2.4 替拉扎明對沙門菌時間殺菌曲線的繪制 將1×106CFU·mL-1的沙門菌懸液與不同濃度的替拉扎明等體積加到EP管中,用移液槍吹打混勻,替拉扎明的終濃度為1/2 MIC、MIC、2 MIC、4 MIC和8 MIC。替拉扎明在沙門菌ST的作用終濃度分別為6.25、12.5、25、50和100 μmol·L-1,替拉扎明在沙門菌ST-6和沙門菌ST-7的作用終濃度均為12.5、25、50、100和200 μmol·L-1,置于37 ℃ 180 r·min-1恒溫搖床培養(yǎng)24 h。分別在培養(yǎng)后0、4、8、12、16、20和24 h取100 μL菌液用稀釋平板計數(shù)法進行活菌計數(shù),繪制時間殺菌曲線。以添加0.1%DMSO的沙門菌懸液為陽性對照。

1.2.5 替拉扎明對沙門菌耐藥表型的影響 選擇24種抗生素藥敏片進行藥敏試驗,將100 μL濃度為1×106CFU·mL-1的菌懸液加到96孔板中,然后加入100 μL濃度為MIC的替拉扎明,替拉扎明的作用終濃度為1/2 MIC,重復3個復孔。置于37 ℃溫箱培養(yǎng)12 h,吸取每孔共培養(yǎng)物100 μL滴在MH培養(yǎng)基上,用滅菌玻璃棒在平皿上均勻涂抹瓊脂表面,用無菌鑷子夾取藥敏紙片貼于平皿表面,置37 ℃溫箱中培養(yǎng)16～18 h,量取抑菌圈直徑。

1.2.6 替拉扎明對沙門菌生物被膜形成的影響 結(jié)晶紫(crystal violet, CV)染色是測定生物膜廣泛使用的方法[19]。使用10 g·L-1結(jié)晶紫測定替拉扎明抗生物被膜的能力,取1×106CFU·mL-1的菌液100 μL接種到96孔培養(yǎng)板上,分別加入等體積濃度為MIC的替拉扎明和對照藥物諾氟沙星,替拉扎明的作用終濃度為1/2 MIC,以LB培養(yǎng)基為空白對照,以含0.1%DMSO菌懸液為陽性對照,重復3個復孔,置37 ℃溫箱培養(yǎng)36 h。培養(yǎng)結(jié)束后,棄去培養(yǎng)基,為洗去雜質(zhì)和浮游菌,用1×磷酸鹽緩沖溶液(phosphate-buffered saline,PBS)沖洗3次,60 ℃加熱固定生物被膜1 h,加入200 μL 10 g·L-1結(jié)晶紫染色30 min,洗去多余染液,每孔加入200 μL 95%甲醇,使用酶標儀測定OD630nm。依據(jù)臨界ODc值(ODc等于空白孔的平均值加上其3倍的標準差而得到的OD值)可對生物被膜分類:OD≤ODc為不黏附(0),ODc4ODc為強黏附(+++)[20]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用MicrosoftExcel 2021進行數(shù)據(jù)整理和作圖,SPSS 28.0對數(shù)據(jù)進行方差統(tǒng)計分析,多組數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析后進行兩兩比較,試驗數(shù)據(jù)均值比較采用單因素方差分析,統(tǒng)計差異在P<0.05判定為有統(tǒng)計學意義,*.P<0.05表示差異顯著,**.P<0.01表示差異極顯著,***.P<0.001表示差異極顯著,****.P<0.001表示差異極顯著,所有試驗數(shù)據(jù)均代表3個獨立試驗。

2 結(jié) 果

2.1 沙門菌的耐藥性分析

選擇24種常用藥物對沙門菌進行藥敏試驗,沙門菌耐藥表型檢測結(jié)果見表1,7株沙門菌的耐藥譜存在差異,但均為多重耐藥菌株,其中沙門菌ST對11種抗生素耐藥,包括6類抗生素,主要有β-內(nèi)酰胺類(氨芐西林、羧芐西林、頭孢克肟和亞胺培南)、大環(huán)內(nèi)酯類(紅霉素、阿奇霉素)、氨基糖苷類(鏈霉素、新霉素)、四環(huán)素類(強力霉素)、多肽類(萬古霉素)和利福霉素類(利福平);沙門菌ST-1對10種抗生素耐藥,包括6類抗生素,與沙門菌ST的耐藥譜相比,耐藥抗生素不包括β-內(nèi)酰胺類(氨芐西林、亞胺培南)和四環(huán)素類(強力霉素),但增加了氨基糖苷類(阿米卡星)和四環(huán)素類(米諾環(huán)素);沙門菌ST-3對11種抗生素耐藥,包括6類抗生素,耐藥抗生素和沙門菌ST-1基本相同,但增加了亞胺培南;沙門菌ST-6對13種抗生素耐藥,包括7類抗生素,與沙門菌ST相比,耐藥譜不包括氨基糖苷類(鏈霉素),但增加了氨基糖苷類(卡那霉素)、四環(huán)素類(米諾環(huán)素)和喹諾酮類(諾氟沙星);沙門菌ST-7對12種抗生素耐藥,包括6類抗生素,和沙門菌ST-6的耐藥譜基本相同(不包括諾氟沙星);沙門菌ST-71對11種抗生素耐藥,包括6類抗生素,與沙門菌ST相比,耐藥譜不包括氨基糖苷類(鏈霉素)和四環(huán)素類(強力霉素),但增加了氨基糖苷類(卡那霉素)和四環(huán)素類(米諾環(huán)素);沙門菌ST-477對10種抗生素耐藥,包括6類抗生素,和沙門菌ST耐藥譜基本相同(不包括鏈霉素和強力霉素),但增加了四環(huán)素類(米諾環(huán)素)。根據(jù)各沙門菌耐藥譜,選擇耐藥抗生素數(shù)目多和抗生素種類多的沙門菌ST、ST-6和ST-7進行體外抑菌試驗。

表1 沙門菌菌株的藥敏性分析結(jié)果

2.2 替拉扎明對多重耐藥沙門菌的抗菌活性

MIC和MBC測定結(jié)果如表2所示,替拉扎明對沙門菌ST、ST-6和ST-7的MIC值分別為12.5、25和25 μmol·L-1,MBC值均為50 μmol·L-1;對照藥物諾氟沙星對沙門菌ST、ST-6和ST-7的MIC分別為25、50和50 μmol·L-1,MBC值均為50 μmol·L-1。通過比較MIC值,發(fā)現(xiàn)替拉扎明對沙門菌的MIC值比諾氟沙星小。結(jié)果表明,替拉扎明對沙門菌具有較強的抗菌活性,且抗菌效果優(yōu)于諾氟沙星。

表2 替拉扎明和諾氟沙星對多重耐藥沙門菌的MIC和MBC測定結(jié)果

沙門菌和替拉扎明動態(tài)接觸的細菌活菌數(shù)隨時間的生長曲線如圖1所示,在替拉扎明濃度為12.5 μmol·L-1時,能抑制沙門菌ST、ST-6和ST-7的生長,培養(yǎng)24 h后的細菌活菌數(shù)與陽性對照組(0.1% DMSO)的活菌數(shù)基本相同。替拉扎明濃度為25 μmol·L-1時,培養(yǎng)4 h后,沙門菌ST-6和ST-7細菌活菌數(shù)有輕微浮動,但基本保持不變,表明在該濃度下,替拉扎明不能完全殺死沙門菌,但對于沙門菌的繁殖起到一定的抑制作用。替拉扎明濃度大于50 μmol·L-1,對沙門菌起到明顯殺菌效果,細菌活菌數(shù)與陽性對照組相比出現(xiàn)急劇下降趨勢直至活菌數(shù)為0。時間殺菌曲線結(jié)果表明,替拉扎明對多重耐藥沙門菌的抑制作用具有濃度和時間依賴性。

a.沙門菌ST;b.沙門菌ST-6;c.沙門菌ST-7a. Salmonella ST; b. Salmonella ST-6;c. Salmonella ST-7圖1 替拉扎明對沙門菌ST、ST-6和ST-7的時間殺菌曲線Fig.1 Time bactericidal curve of Tirapazamine against Salmonella strains (ST, ST-6 and ST-7)

2.3 替拉扎明顯著逆轉(zhuǎn)多重耐藥沙門菌的耐藥表型

替拉扎明對沙門菌的耐藥性產(chǎn)生很大影響,如表3所示。替拉扎明作用后,沙門菌ST對10種抗生素(頭孢噻肟、亞胺培南、鏈霉素、卡那霉素、新霉素、四環(huán)素、強力霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星和復方新諾明)的耐藥表型從耐藥或中介轉(zhuǎn)變?yōu)槊舾?沙門菌ST-6對11種抗生素(頭孢噻吩、頭孢噻肟、亞胺培南、新霉素、阿米卡星、四環(huán)素、強力霉素、米諾環(huán)素、卡那霉素、諾氟沙星和環(huán)丙沙星)的耐藥表型從耐藥或中介轉(zhuǎn)變?yōu)槊舾?沙門菌ST-7對11種抗生素(頭孢噻吩、頭孢噻肟、頭孢克肟、亞胺培南、鏈霉素、卡那霉素、新霉素、四環(huán)素、強力霉素、米諾環(huán)素和利福平)的耐藥表型從耐藥或中介轉(zhuǎn)變?yōu)槊舾?其中在替拉扎明的作用下,3株沙門菌對頭孢噻肟、亞胺培南、強力霉素、新霉素和四環(huán)素的敏感性均明顯增加,諾氟沙星顯示出與替拉扎明相似的效果。由此表明,替拉扎明對沙門菌的耐藥表型具有積極的逆轉(zhuǎn)作用,以期在耐藥性細菌感染的臨床治療中發(fā)揮輔助作用。

表3 替拉扎明和諾氟沙星對多重耐藥沙門菌耐藥性的影響

2.4 替拉扎明影響沙門菌生物被膜的形成能力

使用結(jié)晶紫法測定了替拉扎明對沙門菌生物被膜形成的影響。結(jié)果如圖2所示,與未處理的對照組(0.1% DMSO)相比,替拉扎明處理后沙門菌的生物被膜形成能力顯著下降,生物被膜形成率降低至<10%(P<0.000 1)。由此表明,替拉扎明對沙門菌具有強大的抗生物被膜形成能力,提示替拉扎明對沙門菌耐藥表型具有逆轉(zhuǎn)作用。

a.沙門菌生物被膜形成OD630 nm值;b.結(jié)晶紫染色結(jié)果。*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001,****.P<0.000 1a. OD630 nm value of Salmonella biofilm formation;b. Crystal violet staining results *.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001,****.P<0.000 1圖2 替拉扎明對多重耐藥菌沙門菌生物被膜染色的OD630 nm值和染色圖Fig.2 OD630 nm value and crystal violet staining diagram of Tirapazamine on multi-drug resistant Salmonella biofilm

3 討 論

沙門菌是一種革蘭陰性菌,目前具有2 600多種血清型,是全世界重要的人畜共患病原體,人類食用受沙門菌污染的產(chǎn)品會導致腹瀉和腸道炎癥,甚至菌血癥[21-22]。近幾十年來,抗菌劑在畜牧業(yè)中被頻繁使用,不僅用于治療與控制沙門菌和其他病原體,還作為預防和促生長劑使用[23],造成畜禽養(yǎng)殖場中沙門菌耐藥性越來越嚴重[24]。中國是世界上最大的抗微生物藥物生產(chǎn)國和消費國之一[25],從2000—2015年,中國的抗微生物消費量從2.3億增加到4.2億限定日劑量(defined daily dose, DDD),增幅為79%,預計2015—2030年,全球抗生素總消費量將增長202%,達到1 280億DDD[26]?？股啬退幮缘脑黾恿钊藫鷳n,預計到2050年,將會出現(xiàn)1 000萬人死于耐藥性細菌感染[27]。動物源性抗生素耐藥性已經(jīng)被證明對抗微生物藥物耐藥性有重大影響,需要采取行動和尋找有效的替代藥物如小分子抑制劑來應對這個問題。

本研究表明替拉扎明是一種有效的抗沙門菌的小分子抑制劑,目前對于替拉扎明及其衍生物的研究主要集中在抗癌作用和抗結(jié)核作用。本研究通過體外抑菌試驗驗證了替拉扎明對多重耐藥沙門菌的抗菌活性。研究表明,替拉扎明在需氧和厭氧條件下具有一定的殺菌作用,可以抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和艱難梭菌的生長[13],與本研究結(jié)果一致。此外,50 μmol·L-1替拉扎明可以對沙門菌起到100% 的殺菌作用。由于沙門菌對人和動物構(gòu)成嚴重威脅,鑒于替拉扎明是一種已經(jīng)批準的臨床藥物,本研究結(jié)果有望為控制沙門菌感染提供一種新的策略。

生物被膜是由微生物細胞及胞外多聚物形成的復雜群落,可附著在生物或非生物表面上的復雜微生物群落,或在不附著表面的情況下形成聚集體[28],如沙門菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等細菌[29-30],并牢固地埋在細胞外基質(zhì)中。在極端條件下生存的每種微生物都表現(xiàn)出特定的抵抗機制,其中生物膜的作用至關重要[31]。生物被膜的形成已被證明可以降低抗生素對細菌細胞的敏感性,對抗菌藥物的耐藥性會提高10倍～1 000倍[32]。由于抗生素耐藥性的增加,越來越多的研究人員轉(zhuǎn)向天然產(chǎn)品和小分子抑制劑的研究。本研究發(fā)現(xiàn)12.5～25 μmol·L-1的替拉扎明在很大程度上消除了沙門菌的生物被膜形成能力,導致生物被膜產(chǎn)生量減少90%。這些結(jié)果表明,替拉扎明作為一種能夠有效減少和消除生物被膜相關感染的小分子具有廣闊前景。

4 結(jié) 論

在本研究中,替拉扎明增加了沙門菌對多種抗生素的敏感性,替拉扎明對沙門菌的耐藥表型具有逆轉(zhuǎn)作用,有望在耐藥細菌感染的臨床治療中發(fā)揮輔助作用。綜上所述,替拉扎明對沙門菌的抗菌活性可能是通過逆轉(zhuǎn)耐藥表型和減少生物被膜的形成而實現(xiàn),替拉扎明可以作為一種潛在的多重耐藥菌感染治療用候選藥物,但替拉扎明是否是一種安全的抗菌劑仍需證明。并需要進一步探究替拉扎明的抗菌作用機制,確認其能否對其他耐藥菌產(chǎn)生抗菌作用。