何辰香,高閃電*,田占成,獨(dú)軍政,王錦明,關(guān)貴全,殷 宏,2*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 動(dòng)物疫病防控全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730046;2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,揚(yáng)州 225009)

牛流行熱病毒(bovine ephemeral fever virus,BEFV)是彈狀病毒科、暫時(shí)熱病毒屬的代表性物種,可引起牛高熱、呼吸迫促、消化機(jī)能障。BEFV目前分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)的40多個(gè)國(guó)家,導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶產(chǎn)量嚴(yán)重減少、癱瘓或死亡,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)影響[1]。病毒RNA編碼10個(gè)基因,其中N、P、M、L和G基因編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白,GNS、α1、α2、α3、β 和 γ編碼非結(jié)構(gòu)蛋白[2-3]。G 蛋白是病毒保護(hù)性抗原,α1 可以結(jié)合 importin β1 和 importin 7 來(lái)調(diào)節(jié)核內(nèi)運(yùn)輸途徑,α3可與核內(nèi)不均一性核糖核蛋白K互作引起細(xì)胞凋亡并促進(jìn)BEFV復(fù)制,但其它非結(jié)構(gòu)蛋白的功能尚未完全闡明[4-5]。

在血清學(xué)診斷方面,微量中和試驗(yàn)以及基于G蛋白ELISA檢測(cè)可用于非疫苗免疫動(dòng)物BEFV感染的診斷,但不能區(qū)分疫苗接種和自然感染動(dòng)物[6-8]。作者前期全面篩選可用于疫苗免疫和自然感染甄別的病毒抗原,發(fā)現(xiàn)BEFV GNS蛋白N端截短體、GNS蛋白C端截短體、α2等蛋白可用于BEFV感染牛和免疫牛血清抗體甄別,且GNS蛋白N端截短體與GNS蛋白C端截短體均具有較好的反應(yīng)原性[9]。在實(shí)際應(yīng)用中,作者以蛋白復(fù)合物為檢測(cè)抗原以增加檢測(cè)準(zhǔn)確度[10]。為了避免制備蛋白復(fù)合物的繁瑣流程,本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備GNS全長(zhǎng)蛋白,建立了一種與現(xiàn)有疫苗配套的鑒別診斷ELISA方法,為BEFV血清流行病學(xué)監(jiān)測(cè)和防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

BEFV HN1/2012株 cDNA、pPROEXHTb原核表達(dá)載體、BEFV臨床血清樣本、陰性血清、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、感染血清,FMDV O型、A型標(biāo)準(zhǔn)免疫血清、Trans5α、Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,均保存于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所動(dòng)物疫病防控全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。BEF滅活疫苗、BVD-IBR二聯(lián)滅活疫苗免疫牛血清,由寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所王建東老師惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑

DNA聚合酶、即用型無(wú)縫克隆試劑盒、Ni-NTA 瓊脂糖純化樹脂以及化學(xué)發(fā)光試劑盒,為工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛IgG購(gòu)自Sigma公司。

1.3 原核表達(dá)載體構(gòu)建

以HN1/2012株cDNA為模板,利用GNS(nt31-666)上游引物:5′-TTTCAGGGCGCCATGGGAT-CCGTATACTGTGTAAAAACCTC-3′、GNS(nt 673-1635)下游引物:5′-TCCATGGGATATCGGGGAT-CCTGATGATTCCTCATTCCAATA-3′PCR擴(kuò)增并進(jìn)行膠回收,之后利用快速克隆試劑盒與BamHⅠ、HindⅢ預(yù)先處理的pPROEXHTb載體進(jìn)行重組,經(jīng)轉(zhuǎn)化、菌落PCR篩選、測(cè)序驗(yàn)證獲得重組表達(dá)載體pPRO-GNS。

1.4 重組蛋白His-GNS的表達(dá)純化及鑒定

將pPRO-GNS轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,在100 mL LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng),在OD值達(dá)到0.6～0.8時(shí)加入IPTG(終濃度為1.0 mmol·L-1)繼續(xù)培養(yǎng),6 h后收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE確定目的蛋白His-GNS的表達(dá)。離心收集菌體重懸于10 mL PBS中,超聲波處理20 min (功率40 W,每破碎5 s后間隔2 s),然后10 000g4 ℃離心10 min,進(jìn)行可溶性分析確定目的蛋白的可溶性。參照Ni-NTA瓊脂糖純化樹脂操作說(shuō)明,對(duì)沉淀中的目的蛋白進(jìn)行純化,利用透析液(10 mmol·L-1Tris, pH 8.0, 0.1% TritonX-100)透析過(guò)夜,保存?zhèn)溆?。分別利用1∶200倍稀釋的BEFV感染牛血清、BEF疫苗免疫牛血清為一抗,HRP標(biāo)記兔抗牛IgG(1∶8 000)為二抗,進(jìn)行Western blot鑒定。經(jīng)一抗、二抗分別孵育1 h,用TBST洗膜3次,利用超敏化學(xué)發(fā)光底物室溫避光作用5 min并拍照保存。

1.5 間接ELISA方法的建立

1.5.1 抗原最佳包被濃度和血清稀釋度的確定 用碳酸鹽包被液將不同濃度的His-GNS蛋白(4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 μg·mL-1)包被酶標(biāo)板,4 ℃ 放置12 h;經(jīng)5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h,依次加入1∶10或1∶20 稀釋的BEFV陽(yáng)性血清和陰性血清、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛IgG(1∶4 000)、TMB底物、終止液,之后測(cè)定OD450 nm值。所用稀釋抗原、待檢血清以及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛IgG的體積為100 μL,在加入前均利用PBST洗滌酶標(biāo)板3次。待檢血清和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛IgG的孵育時(shí)間均為30 min,TMB作用時(shí)間為10 min。最終根據(jù)陽(yáng)性血清OD450 nm與陰性血清OD450 nm比值(P/N值)判定最佳反應(yīng)條件。

1.5.2 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛IgG最佳稀釋倍數(shù)確定 按照上述最佳抗原包被濃度和血清稀釋度,利用1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛IgG,進(jìn)行ELISA,根據(jù)最大P/N值確定辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛IgG的最佳稀釋度。

1.5.3 臨界值確定 選取前期利用標(biāo)準(zhǔn)G蛋白抗體ELISA確定的28份陰性牛血清和32份自然感染BEFV的陽(yáng)性牛血清進(jìn)行檢測(cè),利用公式S/P=(樣品OD450 nm-平均陰性對(duì)照OD450 nm)/(平均陽(yáng)性對(duì)照OD450 nm-平均陰性對(duì)照OD450 nm)計(jì)算S/P值,應(yīng)用MedCalc v20.0.10進(jìn)行交互式點(diǎn)圖分析,確定cut-off值。

1.5.4 敏感性試驗(yàn) 利用建立的間接ELISA,將陽(yáng)性血清按照1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320稀釋,測(cè)定其OD450 nm,同時(shí)設(shè)定陰性對(duì)照,計(jì)算不同稀釋度血清的S/P值。

1.5.5 特異性試驗(yàn) 利用建立的ELISA方法,分別對(duì)BVD-IBR雙價(jià)疫苗免疫牛血清、FMDV O型、A型、BEFV感染牛血清進(jìn)行檢測(cè),重復(fù)測(cè)定3次,確定方法的特異性。

1.5.6 重復(fù)性試驗(yàn) 分別在同一批包被的酶標(biāo)板進(jìn)行5次檢測(cè)(批內(nèi))和5個(gè)不同批次制備的酶標(biāo)板對(duì)6份待檢血清進(jìn)行檢測(cè),計(jì)算變異系數(shù)評(píng)價(jià)ELISA方法的批內(nèi)、批間重復(fù)性。

1.6 臨床樣本檢測(cè)

利用建立的間接ELISA方法檢測(cè)來(lái)源于江蘇某奶牛場(chǎng)BEF滅活疫苗免疫牛血清95份、云南某奶牛場(chǎng)BEF滅活疫苗免疫牛血清146份并統(tǒng)計(jì)檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 GNS表達(dá)載體的構(gòu)建

以HN1/2012株cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得了1 605 bp的GNS目的基因片段(圖1A),與BamHⅠ、HindⅢ雙酶切處理的pPROEXHTb載體進(jìn)行重組,菌落PCR鑒定結(jié)果表明10個(gè)克隆均為陽(yáng)性(圖1B),測(cè)序表明重組質(zhì)粒pPRO-GNS具有正確的讀碼框。

M1. DL5000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);M2. DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. GNS擴(kuò)增產(chǎn)物;2～11.菌落PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物M1. DL5000 DNA marker; M2. DL2000 DNA marker; 1.Amplification product of GNS; 2-11. PCR product of individual colony圖1 GNS擴(kuò)增(A)及重組原核表達(dá)質(zhì)粒鑒定(B)Fig.1 The amplification of GNS(A) and identification of recombinant prokaryotic expression plasmids(B)

2.2 重組蛋白的表達(dá)純化與Western blot鑒定

將重組質(zhì)粒pPRO-GNS轉(zhuǎn)化至Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,利用終濃度1.0 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo),SDS-PAGE顯示目的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為73 ku,主要存在于超聲沉淀中,純化獲得較為單一的His-GNS重組蛋白(圖2)。Western blot結(jié)果顯示,重組蛋白His-GNS可與BEFV感染血清發(fā)生特異性反應(yīng)(圖3A),而不與BEF疫苗免疫血清反應(yīng)(圖3B)。

M. 蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. 未誘導(dǎo)pPRO-GNS重組菌;2～4. 4～6 h誘導(dǎo)的pPRO-GNS重組菌;5. 誘導(dǎo)pPRO-GNS重組菌裂解上清;6.誘導(dǎo) pPRO-GNS重組菌裂解沉淀;7.純化的His-GNS蛋白M. Protein molecular weight marker; 1. Uninduced pPRO-GNS recombinant bacteria; 2-4. 4-6 h induced pPRO-GNS recombinant bacteria; 5. Supernatant fraction of induced pPRO-GNS recombinant bacteria; 6. Sediment fraction of induced pPRO-GNS recombinant bacteria; 7. Purified His-GNS protein圖2 His-GNS重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant His-GNS protein

2.3 ELISA方法的建立

2.3.1 抗原包被濃度和血清最佳稀釋度的確定 方陣滴定結(jié)果表明,在His-GNS蛋白包被濃度為0.5 μg·mL-1,血清稀釋度為1∶20條件下,P/N值最大。因此,確定 0.5 μg·mL-1的抗原包被濃度和1∶20的血清稀釋度為最佳反應(yīng)條件。

2.3.2 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛IgG最佳稀釋倍數(shù)確定 利用1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛IgG酶標(biāo)二抗進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果在稀釋度為1∶4 000時(shí),P/N值最大,因此確定辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛IgG的最佳稀釋度為1∶4 000。

2.3.3 臨界值的確定 檢測(cè)背景清晰的28份陰性牛血清和32份陽(yáng)性牛血清并根據(jù)OD450 nm值計(jì)算S/P值,結(jié)果表明,當(dāng)敏感性為97%、特異性為100%時(shí),其最優(yōu)cut-off值為0.206 9,因此確定ELISA的臨界值為S/P值0.206 9(圖4)。

圖4 臨界值判定Fig.4 Determination of cut-off value

2.3.4 敏感性試驗(yàn) 利用建立的間接ELISA對(duì)陽(yáng)性感染血清進(jìn)行1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320倍比稀釋測(cè)定,結(jié)果表明當(dāng)血清稀釋度為1∶160時(shí),仍判為陽(yáng)性(S/P>0.206 9),表明建立的ELISA具有較好的敏感性。

2.3.5 特異性試驗(yàn) 利用建立的ELISA方法,分別對(duì)BVD-IBR雙價(jià)疫苗免疫牛血清、FMDV O型、A型、BEFV感染血清進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示只有BEFV感染牛血清檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性,其余全為陰性(圖5),表明建立的ELISA方法具有較好的特異性。

圖5 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Specific experimental results

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,建立的ELISA批內(nèi)變異系數(shù)為6.59%～9.90%,批間變異系數(shù)為4.83%～9.93%,均小于10%,表明所建立的間接ELISA方法具有較好的重復(fù)性。

2.4 臨床樣本檢測(cè)

利用建立的間接ELISA方法檢測(cè)來(lái)源于江蘇某奶牛場(chǎng)BEF滅活疫苗免疫牛血清95份、云南某奶牛場(chǎng)BEF滅活疫苗免疫牛血清146份并統(tǒng)計(jì)檢測(cè)結(jié)果 (圖6),從江蘇奶牛場(chǎng)檢出3份陽(yáng)性血清,陽(yáng)性率為3.15%;從云南奶牛場(chǎng)檢出5份陽(yáng)性血清,陽(yáng)性率為3.42%。

圖6 臨床樣本檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Test results of clinical samples

3 討 論

牛流行熱至今已有150余年的歷史,該病主要感染奶牛和黃牛,其特點(diǎn)是發(fā)病率高死亡率低,但近年來(lái)在我國(guó)河南省和臺(tái)灣省以及國(guó)外的土耳其等地均報(bào)道了該病在牛的較高病死率,引起較為廣泛關(guān)注[11-14]。利用滅活疫苗免疫是牛流行熱防控必不可少的重要措施,但現(xiàn)有抗體診斷方法無(wú)法區(qū)別牛自然感染BEFV或BEF疫苗免疫產(chǎn)生的抗體,因此感染與免疫鑒別診斷方法的建立成為牛流行熱防控中亟待解決的問題。

作者在前期證實(shí)GNS截短體的反應(yīng)原性的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步表達(dá)純化獲得了GNS全長(zhǎng)蛋白并建立了ELISA方法。作者發(fā)現(xiàn)GNS全長(zhǎng)蛋白只與BEFV感染牛血清反應(yīng)而不與疫苗免疫牛血清反應(yīng),表明滅活疫苗中不含GNS蛋白或含量很低不足以在免疫牛產(chǎn)生抗體,且本研究進(jìn)一步證實(shí)GNS與牛常見病毒FMDV、BVDV、IBRV抗體均不存在交叉反應(yīng),特異性良好,是一種理想的鑒別診斷靶標(biāo)。與作者前期基于GNS截短重組蛋白建立的ELISA方法[9]相比,本研究發(fā)現(xiàn)利用GNS全長(zhǎng)重組蛋白建立ELISA,其抗原最佳包被濃度(0.5 μg·mL-1)和待檢血清濃度(1∶20)低于GNSaa 11-222截短重組蛋白包被濃度(1.0 μg·mL-1)和待檢血清濃度(1∶10),可能在于全長(zhǎng)GNS重組蛋白較截短重組蛋白含有較多的抗原表位,更適用于抗體診斷試劑盒制備。通過(guò)陽(yáng)性血清系列稀釋,血清稀釋度為1∶160仍可檢出,本研究建立的ELISA 與作者前期建立的基于G蛋白的ELISA方法具有類似的敏感性[15],且批內(nèi)和批間CV均小于10%,表明該DIVA ELISA具有良好的敏感性和重復(fù)性。由于現(xiàn)有血清學(xué)診斷方法只能通過(guò)中和抗體判定牛的BEF疫苗接種史或自然感染史,但不能進(jìn)行甄別。本研究在方法建立過(guò)程中,利用前期基于G蛋白抗體ELISA方法篩選的健康牛血清和BEFV自然感染牛血清進(jìn)行標(biāo)定,確保了檢測(cè)BEFV感染的準(zhǔn)確率(結(jié)果“2.2.3”)。通過(guò)檢測(cè)源于江蘇某奶牛場(chǎng)BEF滅活疫苗免疫牛血清95份、云南某奶牛場(chǎng)BEF滅活疫苗免疫牛血清146份,結(jié)果從江蘇和云南疫苗免疫群體檢出BEFV 感染率分別為3.15%和3.42%,與前期報(bào)道江蘇省免疫牛的BEF發(fā)病率一致[16],但略低于云南省部分地區(qū)未免疫牛的BEFV感染率(4.93%～21.69%)[17],進(jìn)一步表明疫苗免疫在阻斷BEFV中起到至關(guān)重要的作用。

4 結(jié) 論

本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)純化BEFV GNS全長(zhǎng)蛋白,從包涵體中純化復(fù)性獲得只與BEFV感染牛血清具有反應(yīng)特異性的重組GNS蛋白,建立了BEFV感染與疫苗免疫鑒別診斷的間接ELISA方法,具有良好的敏感性、特異性和重復(fù)性,適用于BEFV自然感染和疫苗免疫牛的鑒別診斷,為我國(guó)牛流行熱診斷提供了新的技術(shù)儲(chǔ)備。