謝青云,易瑋婕,李嘉豪,白 昀,謝 星,袁 廳,張 越,馮余凡,趙東明,步志高,劉 斐*,馮志新*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用生物制品工程重點實驗室,南京 210014;2.南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院單分子納米生物學實驗室,南京 210095;3.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室,哈爾濱 150069;4.獸用生物制品(泰州)國泰技術(shù)創(chuàng)新中心,泰州 225300)

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起豬的一種急性、熱性和高度致死性傳染病[1],急性病死率高達100%[2],為世界動物衛(wèi)生組織 (OIE) 規(guī)定必須通報的動物傳染病,也是我國的一類動物傳染病和優(yōu)先防范的重要外來疫病[3]。ASF進入亞洲給全球養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失[4]。ASFV感染包括急性、亞急性、慢性和無癥狀的病毒攜帶這四種類型,臨床特征多表現(xiàn)為高熱、出血和皮膚紫紺等,剖檢可見以脾為主的、累及多器官的充血、腫大和出血等。但這些癥狀與豬瘟(classical swine fever,CSF)、豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)極為相似,所以需要借助靈敏有效的檢測手段加以確診[5]。此外,目前尚無安全有效的疫苗來預防ASF。因此,借助快速敏感的早期檢測技術(shù),在感染現(xiàn)場第一時間作出準確診斷是ASF防控的關(guān)鍵。

近幾年,一些適合現(xiàn)場快速檢測的高新技術(shù),如等溫擴增、免疫層析技術(shù)和微流控芯片等已用于ASFV 的檢測研究[6-7]。哈登楚日亞等[8]利用重組酶聚合酶擴增技術(shù), 針對ASFVB646 L/P72基因建立了實時熒光重組酶聚合擴增方法。吳海濤等[9]基于膠體金免疫層析技術(shù)制備了ASFV抗原蛋白檢測膠體金試紙條。上海速芯生物科技有限公司研發(fā)出一款可準確、快速檢測ASFV的微流控芯片快速檢測試劑盒[10]。本研究團隊利用重組酶聚合酶擴增技術(shù)結(jié)合側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)開發(fā)了ASFV核酸檢測量子點試紙條[11]。此外,由中國動物衛(wèi)生與流行病學中心等單位研制的ASFV熒光微球檢測試紙條(二類)和北京森康生物技術(shù)開發(fā)有限公司等單位研制的ASFV熒光等溫擴增檢測試劑盒(三類)已獲批新獸藥。上述方法很好地實現(xiàn)了ASFV分子或抗原的敏感檢測,但由于目前臨床上常需要對ASFV進行抗原和抗體同步檢測來確認感染。因此,建立新型血清學診斷方法用以滿足ASF現(xiàn)場早期、靈敏、快速診斷的要求成為急需。

豬感染ASFV后血清抗體最早在8～12 d才開始轉(zhuǎn)陽[12],無法完全滿足ASFV感染的早期診斷。由口鼻上皮和相關(guān)固有層組成的保護性黏膜被認為是宿主對抗ASFV的第一道防線,可引起黏膜免疫反應[13-14]。與普通抗體相比,分泌型免疫球蛋白A(sIgA)作為參與黏膜免疫最主要的效應因子,具有親和力更高、穩(wěn)定性更好、在機體外分泌道中分泌時間更早等特點,因此具備成為ASFV早期診斷靶標的潛力。量子點免疫試紙條技術(shù)基于抗原抗體的特異性反應,結(jié)合量子點熒光強度強、生物相容性好、熒光壽命長等優(yōu)良特性,在病原菌現(xiàn)場診斷中顯示出了廣闊的應用前景。本研究篩選ASF早期抗原p30蛋白作為檢測工具,以口腔液中的ASFV sIgA抗體作為檢測靶標,開發(fā)ASFV sIgA抗體量子點免疫熒光檢測試紙條。該檢測方法靈敏度高、穩(wěn)定性好、反應時間短、檢出時間早、操作簡單,可以為ASF的防控提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 生物樣本來源 100份ASFV陰性口腔液臨床樣本為江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所2018年以前采集保存的豬口腔液樣本。16份采自4頭ASFV人工感染豬(肌注105HAD50HLJ/18)接種后第20、22、24和26天的滅活陽性口腔液樣本和滅活的血清樣本。經(jīng)商品化血清抗體ELISA檢測試劑盒(金諾百泰生物技術(shù)有限公司,批號:20210646)檢測為陽性(見OSID補充材料)。12份采自ASFV人工感染豬(口鼻接種104HAD50HLJ/18)的不同時間點的滅活口腔液樣本和滅活的血清樣本。2份采自2頭ASFV同居感染豬感染后第22天的滅活陽性口腔液樣本,同居感染通過與4頭肌注106TCID50SD/DY-I/21或HLJ/HRB1/20于接種第1天共飼養(yǎng)實現(xiàn)。上述樣本均由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。用于特異性鑒定試驗的偽狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、CSFV和PRRSV陽性口腔液標準品由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所保藏。

1.1.2 主要儀器與試劑 熒光免疫分析儀(杭州中翰盛泰生物技術(shù)股份有限公司),腸激酶(北京碧云天生物技術(shù)有限公司)親水性CdSe/ZnS QDMs(武漢珈源量子點技術(shù)開發(fā)有限公司),1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)氯化碳二酰亞胺(EDC)和蔗糖(美國Sigma-Aldrich),N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和牛血清白蛋白(BSA)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司),鼠抗豬IgA-Sc片段抗體、兔抗雞IgY和雞IgY蛋白(美國Bethyl),硝化棉(NC)膜、吸收墊和樣品墊(英國Whatman)。

1.2 試驗方法

1.2.1 p30重組蛋白制備 1)利用無縫克隆技術(shù)構(gòu)建pET32a-p30重組載體;2)利用原核表達系統(tǒng)在大腸桿菌BL21中以0.4 mmol·L-1IPTG誘導p30重組蛋白表達,16 ℃培養(yǎng)18 h;3)利用Ni親和層析柱純化帶有His標簽的p30重組蛋白;4)利用腸激酶切除經(jīng)pET32a載體重組表達自帶的Trx-tag、His-tag和S-tag標簽,并再次利用Ni親和層析柱純化酶切后p30重組蛋白;5)經(jīng)PBS透析和超濾濃縮管濃縮獲得無標簽的p30重組蛋白;6)利用Western blot驗證制備的p30重組蛋白的免疫原性。

1.2.2 QDM-p30和QDM-兔抗雞IgY探針制備 參照實驗室已建立的QDM與蛋白質(zhì)的偶聯(lián)條件制備量子點熒光探針[15]。首先,100 μL的羧基修飾的QDMs 被添加至含20 mg·mL-1EDC和20 mg·mL-1NHS的20 mmol·L-1MES緩沖液(2-[N-morpholino] ethanesulfonic acid,pH 6)中,于37 ℃孵育15 min。接著以10 000g離心活化后的羧基修飾QDMs 20 min,再以100 mL MES緩沖液(0.02 mol·L-1,pH 8.00)重懸。分別加入14 μg p30重組蛋白和10 μg兔抗雞IgY,在37 ℃下孵育2 h,加入4 mL 10% BSA溶液封閉微球表面未結(jié)合的羧基。以10 000g離心10 min后,用200 mL PB(磷酸鹽緩沖液,0.02 mol·L-1,pH 7)緩沖液重懸QDM-p30和QDM-兔抗雞IgY探針,4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 量子點免疫試紙條制備與檢測體系建立 1)制備檢測線(T線)為鼠抗豬IgA-Sc片段抗體,質(zhì)控線(C線)為雞IgY蛋白的側(cè)向流免疫試紙條,并將QDM-兔抗雞IgY質(zhì)控探針均勻的噴于NC膜上,免疫試紙條干燥后于室溫下保存?zhèn)溆?2)取7 μL待檢口腔液樣本與1 μL QDM-p30檢測探針經(jīng)62 μL樣本稀釋液(含1%脫脂乳的PBS,pH 7.4)混合后,全部加至試紙條的樣品墊上,室溫下靜置反應15 min后,待檢樣品中經(jīng)QDM-p30捕獲的ASF sIgA抗體被固定于T線上的鼠抗豬IgA-Sc片段抗體再次捕獲(圖1),通過檢測量子點熒光信號實現(xiàn)樣本中抗體水平的定性及定量檢測。檢測結(jié)果可通過微型手持紫外燈定性觀察,也可利用熒光免疫分析儀定量分析。

QDM.量子點微球QDM. Quantum dot microsphere圖1 ASFV sIgA抗體量子點免疫試紙條檢測原理Fig.1 Schematic diagram of QDM-based immunostrip for ASFV sIgA antibody detection

1.2.4 Cutoff值確定 利用建立的方法檢測本實驗室保藏的100份ASFV陰性口腔液臨床樣本,計算所有樣本的T線熒光平均值和標準差值,再通過公式cutoff值=平均值+3×標準差確立該方法的Cutoff值。此外,使用于37 ℃加速老化1個月的試紙條檢測100份ASFV陰性口腔液臨床樣本,計算所有樣本的C線熒光平均值和標準差值,以把最小C值包含在內(nèi)的計算值作為試紙條檢測成立值。將T線位置觀測到顯著條帶且T值大于等于cutoff值,C線位置觀測到顯著條帶且值大于等于成立值作為陽性判定標準。

1.2.5 靈敏度檢測 將熱滅活ASFV陽性口腔液進行2倍梯度稀釋至1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64和1/128,利用建立的方法進行3次重復檢測,確定該方法敏感性。熱滅活ASFV陽性口腔液采自ASFV人工感染豬(口鼻接種104HAD50HLJ/18)接種后第22天(DPI22)的口腔液樣本,由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。經(jīng)OIE頒布的qPCR方法(Ct值為27.042)和商品化血清抗體ELISA檢測試劑盒(金諾百泰生物技術(shù)有限公司,批號:20210646)檢測均為陽性(見OSID補充材料)。

1.2.6 特異性驗證 利用建立的方法重復三次檢測PRV、CSFV、PRRV標準陽性口腔液,驗證該方法的檢測特異性。PBS作為空白對照,熱滅活ASFV陽性口腔液(口鼻接種104HAD50HLJ/18,DPI 22)作為陽性對照。此外,檢測熱滅活ASFV Ⅰ型天然弱毒株SD/DY-I/21感染陽性口腔液和熱滅活ASFV Ⅱ型天然弱毒株HLJ/HRB1/20感染陽性口腔液鑒定本研究方法對ASFV天然弱毒株的特異性。

1.2.7 臨床樣本檢測效能評價 利用建立的方法檢測16份人工感染ASFV HLJ/18豬的熱滅活ASFV陽性口腔液臨床樣本和20份ASFV陰性口腔液臨床樣本。另外,分別利用建立的方法和商品化血清抗體ELISA檢測試劑盒(金諾百泰生物技術(shù)有限公司,批號:20210646)檢測人工感染ASFV后不同時間點的口腔液樣本和血清樣本,比較病毒最早檢出時間。

2 結(jié) 果

2.1 ASFV p30抗原蛋白的制備

利用原核表達系統(tǒng)在大腸桿菌BL21中誘導pET32a-p30表達,再經(jīng)Ni柱親和層析純化帶有Trx、S和His標簽的p30重組蛋白,蛋白相對分子質(zhì)量約為50 ku。結(jié)果如圖2A所示,重組蛋白被含250 mmol·L-1咪唑的洗脫液(PBS,pH 7.9)集中洗脫。經(jīng)PBS透析去除咪唑后,再利用腸激酶切除經(jīng)pET32a載體重組表達自帶的標簽蛋白(Trx、S和His標簽,約14 ku)。酶切產(chǎn)物經(jīng)Ni柱純化,含有His的標簽蛋白被結(jié)合在層析柱上。結(jié)果如圖2B所示,酶切后p30重組蛋白(約36 ku)蛋白被含50 mmol·L-1咪唑的洗脫液集中洗脫。利用Western blot驗證制備的p30重組蛋白的免疫原性,結(jié)果如圖2C所示:由于切除了載體標簽,制備獲得的p30重組蛋白不能與His單抗反應;制備獲得的p30重組蛋白能夠與p30單抗和熱滅活ASFV陽性口腔液產(chǎn)生單一反應條帶,具備良好的免疫原性。

A. pET32a-p30重組蛋白的純化SDS-PAGE結(jié)果(M.180 ku蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準;1～3. 含250 mmol·L-1咪唑的洗脫液洗脫產(chǎn)物;4. 流穿液);B. pET32a-p30重組蛋白的標簽酶切與純化SDS-PAGE結(jié)果(M.180 ku蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準;1. pET32a-p30重組蛋白經(jīng)腸激酶酶切后產(chǎn)物;2. 腸激酶酶切產(chǎn)物流穿液;3. 含50 mmol·L-1咪唑的洗脫液洗脫產(chǎn)物);C. 腸激酶酶切純化后p30重組蛋白Western blot結(jié)果(M. 180 ku蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準;1. 兔抗鼠His單抗為一抗;2. 兔抗鼠p30單抗為一抗;3. 熱滅活ASFV陽性口腔液為一抗)A. SDS-PAGE results of purified pET32a-p30 recombinant protein (M.180 ku protein marker; 1-3. Elution products containing 250 mmol·L-1 imidazole; 4. Flow through liquid); B. SDS-PAGE results of label digested and purified pET32a p30 recombinant protein (M.180 ku protein marker; 1. The product of pET32a p30 recombinant protein after enterokinase digestion; 2. Enterokinase digestion and logistics penetration; 3. Elution products containing 50 mmol·L-1 imidazole elution solution); C. Western blot results of p30 recombinant protein purified by enterokinase digestion (M. 180 ku protein marker; 1. Rabbit anti mouse His monoclonal antibody as primary antibody; 2. Rabbit anti mouse p30 monoclonal antibody as primary antibody; 3. Heat inactivated ASFV positive oral fluid as primary antibody)圖2 ASFV p30抗原蛋白制備Fig.2 Preparation of recombinant protein ASFV p30

2.2 Cutoff值的確定

利用開發(fā)的ASFV sIgA抗體量子點免疫熒光試紙條檢測本實驗室保藏的100份ASFV陰性口腔液臨床樣本。如圖3所示,100份ASFV陰性口腔液臨床樣本的T均值為552.4,標準差為258.3,cutoff值為1 327。C均值為9 120,標準差為2 517,其中最小C值為4 598,當C均值減去2倍標準差時(4 086),最小C值包含在內(nèi),因此設(shè)定當C值大于等于4 086時試驗成立。

A. 100份臨床陰性樣本檢測T值;B. 100份臨床陰性樣本檢測C值A(chǔ). T values of 100 clinical negative samples; B. C value of 100 clinical negative samples圖3 100份ASFV臨床陰性口腔液樣本檢測結(jié)果Fig.3 Detection results of 100 clinical ASFV-negative oral fluid samples

2.3 靈敏度檢測

利用開發(fā)的ASFV sIgA抗體量子點免疫熒光試紙條檢測梯度稀釋的ASFV陽性口腔液。如圖4所示,本研究建立的檢測方法可實現(xiàn)口腔液中ASFV黏膜抗體sIgA的高靈敏性檢測,最低檢測限為1∶64。此時T線的平均值為2 037,高于cutoff值為1 327的陽性判定標準。所有樣品的C線值均位于大于4 086。

2.4 特異性驗證

利用開發(fā)的ASFV sIgA抗體量子點免疫熒光試紙條檢測PRV、CSFV、PRRSV陽性口腔液標準品,ASFV強毒株HLJ/18感染口腔液,ASFV弱毒株SD/DY-I/21感染口腔液,以及ASFV弱毒株HLJ/HRB1/20感染口腔液鑒定特異性。PBS作為空白對照。結(jié)果如圖5所示,本研究建立的檢測方法與PRV、PRRSV和CSFV不存在交叉反應,該方法能夠特異性檢測不同亞型、不同毒力的ASFV sIgA抗體。

2.5 臨床樣本檢測效能評價

利用開發(fā)的ASFV sIgA抗體量子點免疫熒光試紙條檢測本實驗室保藏的20份ASFV陰性口腔液臨床樣本和16份ASFV陽性口腔液樣本。如圖6A所示,本研究建立的檢測方法能夠?qū)崿F(xiàn)口腔液中ASFV sIgA抗體的特異性檢測。此外,分別利用本研究建立的方法和商品化血清抗體ELISA檢測試劑盒檢測人工感染ASFV不同時間點的口腔液樣本和血清樣本,發(fā)現(xiàn)本研究建立方法最早可于感染后第6天檢出,顯著早于商品化試劑盒第16天的最早轉(zhuǎn)陽時間(圖6B)。

3 討 論

目前,ASFV流行形式復雜。表現(xiàn)為亞急性、長潛伏或持續(xù)性感染的ASFV Ⅰ型和Ⅱ型天然弱毒株對ASFV防控構(gòu)成了嚴重威脅。在感染現(xiàn)場第一時間作出準確診斷仍是ASF防控的首要關(guān)鍵。血清學診斷無需核酸提取和擴增、假陽性率、操作便捷,較病毒核酸檢測更適應現(xiàn)場即時檢驗的需求。因此,開發(fā)敏感、快速、高效的ASFV抗體即時檢測方案對助益ASF防控十分必要。

基于全病毒抗原或重組表達抗原(如p72、p54、p30等)的ELISA方法是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)推薦的ASF抗體檢測方法。Gimenez-Lirola等[12]在ASFV早期抗體檢測中利用免疫熒光珠分析(multiple fluorescent beads immunoassay,FMIA)比較了三種ASFV抗原蛋白p30、p54和p72,發(fā)現(xiàn)當以p30作為包被抗原時可在接種后8～12 d感染豬的血清和口腔液中檢測到特異性抗體。袁芳峰等[16]基于p30蛋白建立一種敏感性好、重復性強的ASFV抗體檢測阻斷ELISA方法。ELISA是目前實驗室最常用的ASFV血清抗體檢測方法,由于其操作繁瑣,耗時長,依賴儀器等限制,在缺乏實驗室條件的豬場中應用受限?；谀z體金、乳膠微球和時間分辨率熒光微球(time-resolved fluorescent microspheres)的側(cè)向流免疫層析技術(shù)被越來越多地應用于豬場ASFV抗體的POCT檢測。萬英等[17]和張欣雨等[18]開發(fā)了ASFV膠體金免疫檢測試紙條。Sastre等[19]開發(fā)了基于衣殼蛋白VP72的乳膠微球免疫層析試紙條用于ASFV和CSFV的血清抗體檢測。李成飛等[20]以截短的p54作為靶標抗原,開發(fā)了ASFV血清抗體熒光微球免疫試紙條。但是,上述試紙條方法的敏感性以及對于ASFV臨床早期診斷仍待進一步提高。

與石墨烯、增頻納米粒子和熒光染料相比,量子點具有激發(fā)寬、發(fā)射窄、量子產(chǎn)率高、光化學穩(wěn)定性和生物相容性好等優(yōu)點,在提高生物制品檢測敏感性方面展現(xiàn)出了巨大的應用潛力[21-23]。此外,與離散的量子點相比,量子點聚合微球(QDMs)往往具有更高的熒光信號、較強的反光子漂白性能和光化學穩(wěn)定性。sIgA抗體是宿主黏膜部分應對感染首先產(chǎn)生的免疫抗體。本團隊靶向黏膜抗體成功研制了國際首個豬肺炎支原體sIgA-ELISA抗體檢測試劑盒(新獸藥證字4號,2018)。該試劑盒不僅實現(xiàn)了豬肺炎支原體的早期診斷,還解決了豬氣喘病活疫苗與滅活疫苗缺乏臨床快速評估手段的問題[24]。此外,黏膜抗體IgA作為豬流行性腹瀉病毒抗體檢測靶標的ELISA試劑盒也于近期獲得了批準文號(新獸藥證字04號,2023)。可見,針對黏膜抗體IgA的檢測具有良好的應用前景和商業(yè)化潛能。本研究將側(cè)向流免疫層析技術(shù)的高特異性,與QDMs的超敏感性以及黏膜sIgA抗體的早期性相結(jié)合,開發(fā)了一種靶向ASFV黏膜抗體sIgA檢測的量子點熒光試紙條(圖1)。經(jīng)檢測,該方法對ASFV sIgA抗體檢測靈敏度高、特異性好,對ASFV陽性口腔液的最低檢出稀釋度可達1∶64(圖4),且適用于不同亞型、不同毒力的ASFV sIgA抗體檢測(圖5)。相較于市場上普遍使用的血清IgG抗體檢測,口腔液sIgA檢測無需侵入式樣本采集,耗時更短,能在室溫條件下、約20 min內(nèi)完成目標樣本的檢測,可滿足亞急性感染、慢性感染和臨床健康A(chǔ)SF康復豬場的“拔牙清除”需求。此外,利用本研究方法檢測ASFV人工感染豬口腔液中sIgA抗體時,最早于感染后第6天出現(xiàn)轉(zhuǎn)陽,繼抗體水平短暫下降后,再于感染后第12天起檢測到穩(wěn)定的陽性結(jié)果(圖6B)。這可能是由于口腔液中黏膜抗體均一性較差,或動物飲水、飲食等行為稀釋了口腔液樣本抗體含量導致的。值得注意的是,考慮到此次檢測樣本數(shù)量有限,該方法的最早檢出時間仍需進一步的檢驗。

4 結(jié) 論

本研究基于QDMs-p30檢測探針開發(fā)了量子點免疫試紙條,實現(xiàn)了口腔液中ASFV sIgA抗體靈敏且特異的POCT診斷,填補了市場上ASFV黏膜抗體檢測方法空白。與商品化ASFV抗體檢測ELISA試劑盒相比,應用該方法檢測不同時間點的口腔液樣本,最早可于人工感染后第6天檢出陽性,顯著早于血清抗體ELISA檢測試劑盒第16天的最早檢出時間?？紤]到其靈敏度高、特異性好、操作便捷、處理速度快(整個過程約20 min)、檢出時間早和能現(xiàn)場即時檢驗等優(yōu)點,本研究開發(fā)的口腔液中ASFV sIgA抗體量子點熒光檢測試紙條是豬場ASF現(xiàn)場篩查的一種潛在工具。