張芳源,楊大為,仇德洋,姜國騫,李桂梅,2,3*,單 虎,2,3

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,青島 266109;2.山東省新獸藥創(chuàng)制協(xié)同創(chuàng)新中心,青島 266109;3.山東省獸藥診斷試劑工程技術(shù)研究中心,青島 266109)

非洲豬瘟 (African swine fever, ASF) 又稱疣豬疫,是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的一種急性、出血性且具有嚴(yán)重危害的傳染病,其臨床癥狀和病理變化與急性豬瘟相類似,病程短,死亡率高達(dá)100%[1-2],世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為必須報(bào)告的動(dòng)物疫病,我國將該病列為一類動(dòng)物疫病。1921年,在非洲地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟病毒,一直僅限于非洲地區(qū)流行;到1957年,在歐洲的葡萄牙被發(fā)現(xiàn),開始了在歐洲地區(qū)的流行;2007年該病在高加索地區(qū)暴發(fā),并很快侵入俄羅斯[2-4]。直至2018年,我國首例非洲豬瘟在遼寧省出現(xiàn)[5-6],隨后在全國多個(gè)省份蔓延,給我國養(yǎng)豬業(yè)乃至整個(gè)社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成了巨大的損失。非洲豬瘟病毒傳播迅速,傳播途徑廣,目前尚沒有研制出對(duì)應(yīng)的疫苗,只有及時(shí)的診斷,才能遏制此病毒的傳播。

ASFV是非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬的唯一成員,是一種以雙鏈DNA為遺傳物質(zhì)的蟲媒病毒[7]。非洲豬瘟病毒粒子直徑為250～300 nm,基因組長為170～194 kb,病毒粒子基因組和核蛋白形成病毒核心部分[8-9]。成熟的病毒粒子能夠表達(dá)50種以上的結(jié)構(gòu)蛋白,P30蛋白是ASFV的內(nèi)囊膜蛋白之一,也是最具抗原性的蛋白之一,由CP204L基因編碼,常在感染后的2～4 h表達(dá),12 h后合成減少,能誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生,在整個(gè)感染期都能檢測(cè)到,是ASFV重要的結(jié)構(gòu)蛋白[10]。

為更好地防控非洲豬瘟,開展非洲豬瘟相關(guān)檢測(cè)技術(shù)尤為重要。目前針對(duì)非洲豬瘟病毒最常用的血清學(xué)檢測(cè)手段是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA),如張錦等[11]、徐黎暉等[12]和于學(xué)祥等[13]用P30蛋白作為抗原建立了間接ELISA檢測(cè)方法,但ELISA不能同時(shí)大量檢測(cè)多種病原, 難以滿足高通量檢疫的要求。液相芯片技術(shù)[multi-analyte profiling solve for unknown x (xMAP) technology]作為一種新型的檢測(cè)技術(shù),具有高通量、多靶標(biāo)、靈敏度高、特異性好等諸多優(yōu)勢(shì),該技術(shù)操作簡單、應(yīng)用靈活,可以同時(shí)對(duì)不同的指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè),迄今為止,全球已有數(shù)百套液相芯片技術(shù)用于蛋白質(zhì)、核酸等檢測(cè)[14-15]。

本研究將P30蛋白作為抗原,建立并優(yōu)化了ASFV液相芯片檢測(cè)方法,以期用于ASFV的血清學(xué)檢測(cè)及評(píng)估機(jī)體感染后體內(nèi)的抗體水平。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體和血清

大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,購自天根生化科技有限公司;大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,購自TaKaRa生物技術(shù)有限公司;原核表達(dá)載體pET-28a由本實(shí)驗(yàn)室保存并提供;非洲豬瘟標(biāo)準(zhǔn)陽性血清購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中心;32份無特定病原體(specific pathogen free,SPF)豬血清由哈爾濱獸醫(yī)研究所饋贈(zèng);塞內(nèi)卡病毒(Seneca virus A,SVA)陽性血清、口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)陽性血清、20份非洲豬瘟陰性血清由本實(shí)驗(yàn)室保存;92份未知豬血清來自山東各養(yǎng)殖場(chǎng)送檢樣本;豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)陽性血清、豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)陽性血清、水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)陽性血清和豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)陽性血清由云南海關(guān)饋贈(zèng)。

1.2 主要試劑和試劑盒

質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司;IPTG購自上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(包涵體)購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;T4 DNA連接酶、BamHⅠ限制性內(nèi)切酶、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa生物技術(shù)有限公司;綠色熒光核酸染料、尿素和生物素標(biāo)記的羊抗豬IgG均購自北京索萊寶科技有限公司;Omni-EasyTM一步法 PAGE凝膠快速制備試劑盒(12.5%)購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司;Goat Anti-Pig IgG H&L(HRP)購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司;生物素化的抗His的抗體(6X-His Tag Monoclonal Antibody, Biotin)購自美國Invitrogen公司;Bio-Plex偶聯(lián)試劑盒、Bio-Plex羧基磁珠、Bio-Plex檢測(cè)反應(yīng)試劑盒、多肽氨基偶聯(lián)試劑盒均購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司;非洲豬瘟病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒(P30)購自哈爾濱國生生物科技股份有限公司。

1.3 目的基因的篩選和設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank發(fā)表的African swine fever virus isolate Pig/HLJ/2018(MK333 180.1)基因中的CP204L基因序列,進(jìn)行序列分析和密碼子優(yōu)化,由中美泰和生物有限公司合成和測(cè)序,構(gòu)建pCold-TF-p30重組載體。

1.4 P30基因克隆及重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

根據(jù)所合成的基因序列用SnapGene軟件設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,上游引物:5′-ATGGGTCGCG-GATCCGACTTTATCCT-3′(劃線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn));下游引物:5′-GTGGTGCTCGAGTT-TCTTCTTCAGCAG-3′(劃線部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn)),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

取上、下游引物各2 μL、p30基因模板4 μL、ddH2O 17 μL、Taq酶25 μL,充分混勻,按以下程序進(jìn)行PCR反應(yīng):94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min,共30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后用膠回收試劑盒回收p30基因片段。

用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ對(duì)回收的p30基因片段和pET-28a載體進(jìn)行雙酶切,經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后用膠回收試劑盒回收。用T4連接酶對(duì)回收的酶切產(chǎn)物連接過夜,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)菌液PCR和雙酶切鑒定后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將鑒定正確的pET-28a-p30重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,涂板過夜培養(yǎng),取生長良好的單菌落接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,過夜培養(yǎng),待OD600 nm值達(dá)0.6～0.8之間加入IPTG至終濃度為1 mmol·L-1,并設(shè)置不加誘導(dǎo)劑的空白對(duì)照,繼續(xù)培養(yǎng)8 h后,4 ℃、12 000 r·min-1離心8 min,棄去上清,用1 mL PBS重懸菌體沉淀,離心、棄上清,1 mL PBS重懸菌體后再離心,最后用1 mL PBS重懸菌體沉淀。取一管重組載體誘導(dǎo)后的菌液在冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎,離心10 min取上清和沉淀,對(duì)所有樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.6 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的條件優(yōu)化

1.6.1 IPTG誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化 將空載體菌液和重組菌液37 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)至OD600 nm值達(dá)到0.6～0.8之間,不同搖菌管中加入IPTG的終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol·L-1,在37 ℃條件下,誘導(dǎo)表達(dá)8 h后,將樣品進(jìn)行離心和重懸,進(jìn)行SDS-PAGE鑒定分析。

1.6.2 誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間優(yōu)化 將空載體菌液和重組菌液37 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)至OD600 nm值達(dá)到0.6～0.8之間,在37 ℃條件下,加入相同終濃度的IPTG(1.0 mmol·L-1),在誘導(dǎo)表達(dá)3、6、9、12、22及24 h時(shí)間段分別拿出一管進(jìn)行離心和重懸,將樣品進(jìn)行SDS-PAGE鑒定分析。

1.7 重組蛋白的大量表達(dá)、純化及復(fù)性

取保種的菌液按1%的比例接入含有卡那霉素的液體培養(yǎng)基進(jìn)行過夜復(fù)蘇,復(fù)蘇后按3%比例接入含有卡那霉素的液體培養(yǎng)基,培養(yǎng)至OD600 nm值達(dá)到0.6～0.8之間,在最佳誘導(dǎo)條件下進(jìn)行大量表達(dá),對(duì)表達(dá)后的菌液進(jìn)行離心、重懸和超聲破碎,破碎后離心15 min,收集沉淀。將沉淀重懸于Binding Buffer(按照His蛋白純化試劑盒中的說明書配制)中,盡量混勻使包涵體充分溶解,4 ℃、12 000 r·min-1離心20 min收集上清。按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒中的說明書測(cè)定濃度,以梯度洗脫的方式按照His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒中的說明書純化P30蛋白。收集流穿液、洗雜液和洗脫液,取樣并進(jìn)行SDS-PAGE鑒定分析。

配制濃度分別為6、5、4、3、2、1、0 mol·L-1的尿素溶液,調(diào)pH至7.5并加入10%的甘油。將純化后的蛋白裝入透析袋,并將透析袋放入裝有尿素溶液的燒杯中,置于磁力攪拌器上,在4 ℃條件下從6 mol·L-1的濃度進(jìn)行梯度透析,每隔2 h進(jìn)行一次換液。透析結(jié)束后,將蛋白溶液取出4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min收集上清并進(jìn)行SDS-PAGE鑒定分析和蛋白濃度測(cè)定。

1.8 重組蛋白Western blot分析

將透析后的重組P30蛋白和空載體誘導(dǎo)后的樣品經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,轉(zhuǎn)膜后用1×TBST洗膜,泡入5%脫脂奶粉中封閉過夜;洗膜,用ASFV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清作為一抗,按1∶1 000比例稀釋,4 ℃孵育過夜;洗膜,以Goat Anti-Pig IgG H&L(HRP)抗體作為二抗,按1∶10 000比例稀釋,室溫孵育1 h;洗膜,用ECL發(fā)光液進(jìn)行顯色,用凝膠掃描成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.9 微球的活化及偶聯(lián)

將Bio-Plex偶聯(lián)試劑盒取出恢復(fù)室溫,將多肽氨基偶聯(lián)試劑盒取出室溫干燥1 h。取100 μL 54號(hào)微球(約1.25×106個(gè))于包裹錫箔紙的偶聯(lián)反應(yīng)管中。將裝有微球的偶聯(lián)反應(yīng)管漩渦混勻,置于磁力架上靜置1 min,棄掉上清;加入100 μL微球清洗液,漩渦混勻30 s,置于磁力架上靜置1 min,棄掉上清;加入80 μL微球活化液,加入10 μL 50 mg·mL-1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC),然后迅速加入10 μL 50 mg·mL-1的N-羥基硫代琥珀酰亞胺(sulfo-NHS),室溫旋轉(zhuǎn)混合20 min。孵育完用PBS清洗兩遍微球,加入適量P30蛋白,用PBS定容至500 μL,4 ℃過夜孵育。次日,用PBS清洗一遍,加入100 μL微球封閉液,室溫旋轉(zhuǎn)混合30 min,將微球重懸于150 μL微球儲(chǔ)存液中,用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),置于4 ℃保存。

1.10 偶聯(lián)效率驗(yàn)證

取兩個(gè)包裹好錫箔紙的離心管分別加入10 000個(gè)上一步活化并偶聯(lián)后的微球,待測(cè)管加入50 μL稀釋好的生物素化抗His的抗體,陰性對(duì)照管加入50 μL抗體稀釋液,室溫旋轉(zhuǎn)混合30 min;置于磁力架上靜置1 min,棄掉上清,測(cè)試管加入50 μL稀釋好的藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)標(biāo)記的鏈霉親和素(streptavidin-PE,SA-PE),陰性管加入50 μL的分析緩沖液,室溫避光孵育10 min。置于磁力架上靜置1 min,棄掉上清,用125 μL的儲(chǔ)存緩沖液重懸,加入96孔板上,上機(jī)檢測(cè)。

1.11 ASFV液相芯片檢測(cè)方法的建立

每孔加入5 000個(gè)偶聯(lián)成功的微球,用微球清洗液清洗后每孔加入50 μL稀釋好的陰、陽性血清,設(shè)置空白對(duì)照孔并做3組重復(fù)孔,室溫避光振蕩孵育1 h。將96孔板置于磁力架上靜置1 min棄掉上清,清洗微球后每孔加入50 μL稀釋好的生物素標(biāo)記的羊抗豬IgG抗體,振蕩孵育30 min。棄掉上清、清洗微球,每孔加入50 μL稀釋好的SA-PE,振蕩孵育10 min。棄掉上清、清洗微球,每孔加入125 μL分析緩沖液,上機(jī)檢測(cè)。

1.12 最佳檢測(cè)條件優(yōu)化

1.12.1 蛋白最佳偶聯(lián)濃度的確定 按照“1.9”的方法,每孔分別加入6、8、10、12 μg的蛋白與微球偶聯(lián)。按照“1.10”的方法,對(duì)偶聯(lián)的微球進(jìn)行效率驗(yàn)證,按照平均中值熒光強(qiáng)度(median fluorescence intensity,MFI)值高低確定蛋白最佳偶聯(lián)濃度。

1.12.2 最佳血清稀釋度和最佳二抗稀釋度的確定 按照1.10的方法,加入最佳蛋白濃度偶聯(lián)的微球,利用棋盤法檢測(cè)在不同血清稀釋度(1∶100、1∶200、1∶400和1∶800)和不同二抗?jié)舛?0.5、1.0、2.0、4.0 μg·mL-1)下的MFI值,每孔做三組重復(fù),用陽性孔平均MFI值(P)/陰性孔平均MFI值(N)的計(jì)算方法得出最佳血清稀釋度和最佳二抗稀釋度。

1.13 閾值的確定

閾值也稱為截止值,定義為陰性平均值加3倍的方差(SD)。為了確定ASFV抗體液相芯片檢測(cè)方法的閾值,對(duì)32份SPF豬血清和20份ASFV陰性血清按照最佳檢測(cè)條件進(jìn)行測(cè)定,每孔做3組重復(fù)。

1.14 靈敏性試驗(yàn)

對(duì)ASFV陽性血清和陰性血清,從1∶100到1∶25 600進(jìn)行倍比稀釋,用已建立的ASFV抗體液相芯片檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè),每孔做3組重復(fù),通過測(cè)定的MFI值與閾值比較,判斷該方法的靈敏性。

1.15 特異性試驗(yàn)

用已建立起來的ASFV抗體液相芯片檢測(cè)方法分別檢測(cè)ASFV陽性血清、SVA陽性血清、FMDV陽性血清、TGEV陽性血清、CSFV陽性血清、VSV陽性血清以及PRRSV陽性血清,判斷該方法的特異性。

1.16 重復(fù)性試驗(yàn)

為確定該方法的可重復(fù)性,用已建立起來的ASFV抗體液相芯片檢測(cè)方法分別檢測(cè)兩份ASFV陽性血清和3份ASFV陰性血清,分別做3次批間和3次批內(nèi)試驗(yàn)。

1.17 符合率試驗(yàn)

利用本試驗(yàn)建立的ASFV抗體液相芯片檢測(cè)方法和購買的ASFV酶聯(lián)免疫分析試劑盒對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的92份未知血清進(jìn)行檢測(cè),進(jìn)行對(duì)比,計(jì)算符合率。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ對(duì)回收的p30基因片段和pET-28a載體進(jìn)行雙酶切,用T4連接酶對(duì)回收的酶切產(chǎn)物連接過夜,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)菌液PCR和雙酶切鑒定后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。雙酶切結(jié)果顯示,載體片段為5 335 bp、目的片段大小為579 bp(圖1),符合預(yù)期結(jié)果,證明重組質(zhì)粒pET-28a-p30構(gòu)建成功。

M. DL10000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1. pET-28a空載體; 2. pET-28a-p30M. DL10000 DNA marker; 1. pET-28a empty vector; 2. pET-28a-p30圖1 重組質(zhì)粒pET-28a-p30的雙酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Restriction digestion of recombinant plasmid pET-28a-p30

2.2 ASFV 重組P30蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析

將鑒定正確的pET-28a-p30重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)之后,對(duì)誘導(dǎo)前后的空載體菌液、重組載體菌液以及超聲破碎后的上清和沉淀取樣進(jìn)行SDS-PAGE鑒定分析。結(jié)果顯示,重組載體菌液泳道約在30 ku處有一條差異性條帶(圖2),與ASFV 重組P30蛋白大小相符,證明ASFV P30蛋白初步表達(dá)成功;目的蛋白在沉淀中大量表達(dá),說明蛋白為包涵體表達(dá)。

M. 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. 未誘導(dǎo)表達(dá)的空載體;2. 誘導(dǎo)表達(dá)的空載體;3. 未誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌;4. 誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌;5. 誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌超聲上清;6. 誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌超聲沉淀M. Protein molecular weight standard; 1. Empty vector without induced expression; 2. Empty vector with induced expression; 3. Recombinant bacteria without induced expression; 4. Induced expressed recombinant bacteria supernatant; 5. Induced expressed recombinant bacteria with ultrasonic supernatant; 6. Induced expressed recombinant bacteria with ultrasonic precipitation圖2 重組菌誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析Fig.2 Recombinant bacteria expression and solubility

2.3 ASFV 重組P30蛋白最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

將空載體菌液和重組菌液培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期,不同搖菌管中加入IPTG的終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol·L-1,誘導(dǎo)表達(dá)8 h。結(jié)果顯示,IPTG濃度在1.0 mmol·L-1時(shí)表達(dá)量最高。

將空載體菌液和重組菌液培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期,加入相同終濃度的IPTG(1.0 mmol·L-1),誘導(dǎo)表達(dá)3、6、9、12、22及24 h。結(jié)果顯示,誘導(dǎo)表達(dá)12、22和24 h蛋白表達(dá)量較高,選擇22 h作為最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

2.4 ASFV 重組P30蛋白的純化及復(fù)性

以梯度洗脫的方式,按照His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒中的說明書純化P30蛋白,收集流穿液、洗雜液和洗脫液,取樣并進(jìn)行SDS-PAGE鑒定分析。結(jié)果顯示,蛋白在流穿液里損失較少,在洗脫液里大量收集,并有較好的純化效果(圖3A、B)。將蛋白用透析袋按梯度復(fù)性后,取樣進(jìn)行SDS-PAGE鑒定分析。結(jié)果顯示,蛋白成功復(fù)性(圖4)。

M. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.流穿液1;2. 流穿液2;3. 洗雜液;4～5. 咪唑濃度為50 mmol·L-1的洗脫液1和2;6～7. 咪唑濃度為100 mmol·L-1的洗脫液1和2;8～9. 咪唑濃度為150 mmol·L-1的洗脫液1和2;10～11. 咪唑濃度為200 mmol·L-1的洗脫液1和2;12～13. 咪唑濃度為250 mmol·L-1的洗脫液1和2;14～15. 咪唑濃度為400 mmol·L-1的洗脫液1和2;16. 純化前的蛋白溶液M. Protein molecular weight standard; 1. Flow through liquid 1; 2. Flow through liquid 2; 3. Wash fluid; 4-5. Eluents 1 and 2 with imidazole concentration of 50 mmol·L-1; 6-7. Eluents 1 and 2 with imidazole concentration of 100 mmol·L-1; 8-9. Eluent 1 and 2 with imidazole concentration of 150 mmol·L-1; 10-11. Eluent 1 and 2 with imidazole concentration of 200 mmol·L-1; 12-13. Eluent 1 and 2 with imidazole concentration of 250 mmol·L-1; 14-15. Eluents 1 and 2 with imidazole concentration of 400 mmol·L-1; 16. Protein solution before purification圖3 重組P30蛋白的純化Fig.3 Purification of recombinant P30 protein

M. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.復(fù)性前;2. 透析液;3. 復(fù)性后M. Protein molecular weight standard; 1. Before renaturation; 2. Dialysate; 3. After renaturation圖4 重組P30蛋白復(fù)性Fig.4 Renaturation of recombinant P30 protein

2.5 ASFV 重組P30蛋白免疫反應(yīng)性鑒定

用透析后的重組P30蛋白和空載體誘導(dǎo)表達(dá)后的樣品進(jìn)行Western blot試驗(yàn),ASFV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清作為一抗,Goat Anti-Pig IgG H&L(HRP)抗體作為二抗,判定透析后的重組P30蛋白的反應(yīng)原性。結(jié)果顯示,透析后的重組P30蛋白與ASFV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清特異性結(jié)合,空載體誘導(dǎo)表達(dá)后未出現(xiàn)特異性條帶(圖5),證明純化后的重組P30蛋白有良好的反應(yīng)原性。

M. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. 透析后的重組P30蛋白;2. 誘導(dǎo)表達(dá)后的空載體M. Protein molecular weight standard; 1. Dialyzed recombinant P30 protein; 2. Empty vector with induced expression圖5 重組P30蛋白的Western blot鑒定Fig.5 Western blot analysis of recombinant P30 protein

2.6 偶聯(lián)效率驗(yàn)證

對(duì)重組P30蛋白和54號(hào)微球的偶聯(lián)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示,偶聯(lián)微球的MFI值為4 968,陰性對(duì)照孔的MFI值為36(根據(jù)說明書上所述,偶聯(lián)MFI值大于2 000、陰性孔小于100判定為成功),證明重組P30蛋白與54號(hào)微球偶聯(lián)成功。

2.7 ASFV液相芯片檢測(cè)方法的建立

用偶聯(lián)成功的微球檢測(cè)ASFV標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清,每孔做三組重復(fù),上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果顯示,陽性孔平均MFI值為11 381.3,陰性孔平均MFI值為84.7(圖6),證明ASFV液相芯片檢測(cè)方法建立成功。

ASFV. 稀釋的ASFV陽性血清;NC. 稀釋的ASFV陰性血清ASFV. Diluted ASFV positive serum; NC. Diluted ASFV negative serum圖6 陽性血清和陰性血清中值熒光強(qiáng)度檢測(cè)Fig.6 Detection of the median fluorescence intensity (MFI) of positive and negative sera

2.8 最佳檢測(cè)條件優(yōu)化

分別用6、8、10、12 μg的蛋白與微球偶聯(lián)。對(duì)偶聯(lián)的微球進(jìn)行效率驗(yàn)證,結(jié)果顯示,偶聯(lián)蛋白濃度為每1.25×106個(gè)微球6 μg偶聯(lián)效果最佳(圖7)。利用棋盤法檢測(cè)在不同血清稀釋度和不同二抗?jié)舛认碌腗FI值,用陽性孔平均MFI值(P)/陰性孔平均MFI值(N)的計(jì)算方法得出最佳血清稀釋度和最佳二抗?jié)舛?。結(jié)果顯示,血清稀釋度在1∶600、二抗稀釋度至1 μg·mL-1時(shí)為最佳(表1)。

表1 不同血清稀釋度和二抗?jié)舛认翽/N的值

PC. 陽性對(duì)照孔;NC. 陰性對(duì)照孔PC. Positive control hole; NC. Negative control hole 圖7 不同偶聯(lián)蛋白濃度的MFI值Fig.7 MFI values of different coupling protein concentrations

2.9 閾值的確定

為了確定ASFV抗體液相芯片檢測(cè)方法的閾值,對(duì)32份SPF豬血清和20份ASFV陰性血清按照最佳檢測(cè)條件進(jìn)行測(cè)定(圖8)。通過計(jì)算得出,平均MFI值為418.9,方差為385.6,則ASFV檢測(cè)的閾值為1 575.7,大于此值為陽性,小于此值為陰性。

圖8 32份SPF豬血清和20份ASFV陰性血清的MFI值Fig.8 MFI values of 32 SPF pig sera and 20 ASFV negative sera

2.10 靈敏性試驗(yàn)

對(duì)ASFV陽性血清和陰性血清倍比稀釋,用已建立的ASFV抗體液相芯片檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè),通過測(cè)定的MFI值與閾值比較。結(jié)果顯示,當(dāng)陽性樣品稀釋度為1∶25 600時(shí)檢測(cè)仍為陽性(圖9),證明該方法具有良好的靈敏性。

2.11 特異性試驗(yàn)

用已建立起來的ASFV抗體液相芯片檢測(cè)方法分別檢測(cè)ASFV陽性血清、SVA陽性血清、FMDV陽性血清、TGEV陽性血清、CSFV陽性血清、VSV陽性血清以及PRRSV陽性血清。結(jié)果顯示,ASFV血清檢測(cè)為陽性,其他血清檢測(cè)均為陰性,且熒光值差異較大(圖10),證明該方法具有良好的特異性。

圖10 特異性試驗(yàn)Fig.10 Specificity test

2.12 重復(fù)性試驗(yàn)

為確定該方法的可重復(fù)性,用已建立起來的ASFV抗體液相芯片檢測(cè)方法分別檢測(cè)兩份ASFV陽性血清和三份ASFV陰性血清,分別做3次批間和3次批內(nèi)試驗(yàn)。結(jié)果顯示,批內(nèi)和批間的變異系數(shù)均小于10%(表2),證明該方法具有良好的重復(fù)性。

PC. 陽性對(duì)照;NC. 陰性對(duì)照PC. Positive control; NC. Negative control 圖9 血清不同稀釋度下的檢測(cè)結(jié)果Fig.9 Detection results of sera at different dilutions

2.13 符合率試驗(yàn)

利用本試驗(yàn)建立的ASFV抗體液相芯片檢測(cè)方法和購買的ASFV酶聯(lián)免疫分析試劑盒對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的92份未知血清進(jìn)行檢測(cè)。兩種方法的相對(duì)靈敏度為100%(15/15),相對(duì)特異性為90.9%(70/77),總符合率為92.39%[(15+70)/92](表3)。

表3 符合率試驗(yàn)

3 討 論

非洲豬瘟自1921年被發(fā)現(xiàn)以來,對(duì)全世界養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,雖然近年來對(duì)于ASFV的防控已經(jīng)有所成效,但在商品化的疫苗研制出之前,對(duì)于ASFV的防控大多都是增強(qiáng)機(jī)體免疫力、加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、強(qiáng)化豬場(chǎng)生物安全建設(shè)以及早期發(fā)現(xiàn)及時(shí)屠宰等措施[16],所以對(duì)ASFV及時(shí)診斷的研究顯得尤為重要。

液相芯片技術(shù)又稱懸浮芯片技術(shù),是將熒光編碼微球技術(shù)、激光分析技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)、高速數(shù)字信號(hào)處理技術(shù)及計(jì)算機(jī)運(yùn)算法則等多項(xiàng)最新科技成果有機(jī)整合到一起的高通量檢測(cè)技術(shù)[17]。區(qū)別于常用的固相載體反應(yīng)方法,液相芯片技術(shù)采用更接近生物系統(tǒng)的液相反應(yīng)體系,并且利用不同熒光編碼的微球,達(dá)到對(duì)一個(gè)樣品的多重檢測(cè)和分析,具有高通量、反應(yīng)快、靈敏度高、特異性強(qiáng)、樣本用量少、費(fèi)用較低等優(yōu)點(diǎn)[17-19]。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,液相芯片受到廣泛使用,Kuriakose等[20]建立了可同時(shí)快速檢測(cè)所有禽流感病毒(AIV)以及H5、H7、N1和N2亞型的液相芯片檢測(cè)技術(shù);Akhras等[21]設(shè)計(jì)了區(qū)分10種人乳頭瘤病毒基因型的模型試驗(yàn),結(jié)果顯示與擴(kuò)增子焦磷酸檢序?qū)Ρ?所建立的方法敏感性更強(qiáng),可以檢測(cè)兩個(gè)附加的共感染;在腫瘤標(biāo)志物的科學(xué)研究和臨床診斷方面也有應(yīng)用[22]?，F(xiàn)如今,在動(dòng)物疫病的診斷與研究方面,液相芯片技的應(yīng)用也愈加成熟[23-24]。Karanikola等[25]建立了牛糞桿菌和肝片吸蟲的抗體液相芯片檢測(cè)技術(shù),顯示了較高的靈敏性和特異性;Wang等[26]對(duì)藍(lán)舌病病毒(bluetongue virus,BTV)、流行性出血熱病毒(epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)、西尼羅病毒(West Nile virus,WNV)等十種蟲媒病原體建立了液相芯片檢測(cè)技術(shù);李云峰等[27]針對(duì)基孔肯雅熱(Chikungunya fever,CHIKF)、克里米亞-剛果出血熱病毒(Crimea Congo hemorrhagic fever virus,CCHFV)和裂谷熱病毒(Rift Valley fever virus,RVFV)建立多重液相芯片檢測(cè)技術(shù),其靈敏度是傳統(tǒng)RT-PCR技術(shù)的十倍以上。

本研究利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)得到ASFV 重組P30蛋白,大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)有操作簡單、表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn),盡管本試驗(yàn)中重組P30蛋白以包涵體的形式表達(dá),但經(jīng)過純化、復(fù)性等步驟,使得雜蛋白含量大大減少,得到純度較好的重組P30蛋白。將P30蛋白與微球偶聯(lián),成功構(gòu)建了ASFV抗體液相芯片檢測(cè)方法,并針對(duì)蛋白偶聯(lián)濃度、血清稀釋度和二抗?jié)舛鹊葪l件進(jìn)行優(yōu)化,更加完善了該方法。本研究建立的方法在標(biāo)準(zhǔn)陽性血清稀釋25 600倍下,仍能檢測(cè)出陽性,具有極高的靈敏性,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于建立的ASFV抗體ELISA檢測(cè)方法[11-12]。在與商品化ELISA試劑盒的符合率對(duì)比試驗(yàn)中,總符合率可以達(dá)到92.39%,檢出的陽性樣本數(shù)高于商品化ELISA試劑盒所檢出的數(shù)目,這可能與該方法極高的靈敏性有關(guān)。目前,針對(duì)ASFV疫情的防控主要依賴于及時(shí)的診斷和無害化處理,本研究建立的ASFV抗體液相芯片檢測(cè)方法,利用P30蛋白作為抗原,能夠在感染早期作出及時(shí)診斷,有利于ASFV的及時(shí)防控;并且,液相芯片具有高通量的特點(diǎn),能夠一次檢測(cè)出單一樣本中的多種病原體,這使得動(dòng)物體疾病的檢測(cè)更加高效、便捷。

4 結(jié) 論

本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)重組P30蛋白,基于Luminex 200液相芯片檢測(cè)平臺(tái),建立了ASFV抗體液相芯片檢測(cè)方法,具有良好的靈敏性、特異性和重復(fù)性,與商品化試劑盒對(duì)比,具有較高的符合率,可用于ASFV臨床樣品的檢測(cè),為非洲豬瘟的防控技術(shù)提供了借鑒,也為今后多種豬病的液相芯片檢測(cè)技術(shù)的研究奠定了基礎(chǔ)。