李 暢,周 平,溫 平,4,楊克禮,劉 威,郭 銳,劉澤文,袁芳艷,高 婷,宋浩菲,田永祥,周丹娜*

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽細(xì)菌病防治制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430064;2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所畜禽病原微生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430064;3.湖北省獸藥監(jiān)察所,武漢430070;4.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心,武漢 430070)

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus, PCV)為圓環(huán)病毒屬成員,是目前已知最小的動(dòng)物病毒,病毒粒子直徑為15～20 nm,基因組為1 759～2 000 bp的單股環(huán)狀DNA[1]。目前已知的PCV共有4種,其中PCV1被認(rèn)為是細(xì)胞污染物,對(duì)豬和人類(lèi)無(wú)致病性;PCV3首次發(fā)現(xiàn)于2016年美國(guó)某皮炎和腎病綜合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome, PDNS)豬的組織樣品中;PCV4首次發(fā)現(xiàn)于我國(guó)湖南省某豬場(chǎng)的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)樣品中,但PCV3和PCV4的致病性仍有待進(jìn)一步確定[2-3]。自20世紀(jì)90年代,PCV2就被公認(rèn)是導(dǎo)致4～16周齡豬發(fā)生PMWS、PDNS、先天性震顫、繁殖障礙、間質(zhì)性肺炎和肉芽腫型腸炎等疾病的主要病原,能破壞豬的淋巴系統(tǒng),導(dǎo)致豬免疫功能抑制和炎癥反應(yīng)紊亂,從而易引起繼發(fā)感染[4],給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

PCV2的基因組長(zhǎng)度為1 766～1 768 nt,目前已知含有11個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)[5],其中ORF1長(zhǎng)度為945 bp,編碼病毒的復(fù)制相關(guān)蛋白rep(35.7 ku)和rep′(20 ku)[6];ORF2長(zhǎng)度為702～705 bp,編碼病毒的衣殼蛋白(Cap)(27.8 ku)。Cap是PCV2的免疫原性蛋白,可誘導(dǎo)豬產(chǎn)生中和抗體[7]。ORF3編碼一種非結(jié)構(gòu)蛋白(11.9 ku),在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和調(diào)控病毒毒力方面發(fā)揮作用[8]。根據(jù)目前可信度最高的PCV2基因分型標(biāo)準(zhǔn)[1],即:基因型內(nèi)p值最大為13%(根據(jù)ORF2基因計(jì)算)、相應(yīng)內(nèi)部節(jié)點(diǎn)的bootstrap值高于70%、具有至少15個(gè)可用序列,可將其分成PCV2a～PCV2i等9個(gè)基因亞型,其中2a、2b、2d在世界范圍內(nèi)均流行,2c僅在巴西和丹麥出現(xiàn),2e主要在亞洲和美國(guó)發(fā)生,2f和2g主要在亞洲和歐洲流行,2h僅在亞洲流行[9],2i在美國(guó)流行[10]。PCV2基因型在我國(guó)的流行變化趨勢(shì)與世界范圍內(nèi)變化趨勢(shì)基本一致,2002年之前為PCV2a,2002—2008年為PCV2b,2009年之后為PCV2d[1,11]。由于PCV2易發(fā)生基因突變,因此,持續(xù)監(jiān)測(cè)PCV2流行情況對(duì)于疫病防控和疫苗更新具有重要指導(dǎo)意義。

對(duì)于PCV2在我國(guó)豬場(chǎng)中的廣泛感染,接種疫苗能有效降低其流行率,并預(yù)防相關(guān)疾病發(fā)生。針對(duì)不同基因型疫苗株保護(hù)效果的研究發(fā)現(xiàn),多數(shù)情況下,PCV2a和PCV2b為基礎(chǔ)的疫苗仍能針對(duì)其他基因型毒株的感染產(chǎn)生保護(hù)力[11-12]。但是,PCV2d毒株感染可導(dǎo)致比其他基因型毒株更嚴(yán)重的淋巴系統(tǒng)損傷和病毒血癥,更易造成繼發(fā)感染和豬群發(fā)病[13-14]。持續(xù)分離流行毒株,研究其致病力和Cap蛋白的免疫原性,對(duì)于指導(dǎo)臨床用苗和研究PCV2致病機(jī)理具有重要參考價(jià)值。

本研究從湖北省某規(guī)?；i場(chǎng)采集發(fā)病仔豬組織樣品,經(jīng)PCR檢測(cè)證明為PCV2陽(yáng)性;利用組織勻漿液接種PK-15細(xì)胞分離病毒,使用間接免疫熒光測(cè)定其生長(zhǎng)特性;通過(guò)全基因組克隆、測(cè)序和序列分析,研究其遺傳進(jìn)化特點(diǎn);使用生物信息比對(duì)、蛋白表達(dá)和免疫血清中和病毒試驗(yàn),分析和評(píng)價(jià)其Cap蛋白的抗原表位差異和免疫原性,評(píng)價(jià)Cap蛋白免疫血清的抗PCV2感染效果,為研究湖北省的PCV2流行特點(diǎn)提供參考,為研究PCV2致病機(jī)制提供材料和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣品、細(xì)胞和動(dòng)物 淋巴結(jié)、肺和腎樣品采自湖北省某規(guī)?；i場(chǎng)疑似PMWS仔豬;BL21(DE3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司;DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞、PK-15細(xì)胞由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)室保存;SPF級(jí)別BALB/c小鼠購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑和儀器 DNA提取試劑盒購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司;2×Phanta Max Master Mix、Taq Pro HS Universal Probe Master Mix、FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit等購(gòu)自諾唯贊生物科技有限公司;pMD-18 T載體和pET-28a載體購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司;S1000TM Thermal Cycler(PCR儀)購(gòu)自Bio-Rad公司;ViiATM7實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自ABI公司;磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、TSA、TSB、瓊脂糖等購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)制藥有限公司;胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基、胰酶購(gòu)自Gibco公司;HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF(His標(biāo)簽蛋白瓊脂糖高速純化樹(shù)脂)購(gòu)自翌圣生物科技股份有限公司;PCV2豬多克隆抗體(貨號(hào):210-70-PCRV)購(gòu)自VMRD公司;6×His tag抗體(貨號(hào):GTX115045)、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(貨號(hào):GTX213110-01)和FITC標(biāo)記兔抗豬IgG抗體(貨號(hào):GTX26773)購(gòu)自GeneTex公司。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)和合成 參考PCV2基因組序列和限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn),設(shè)計(jì)全基因組擴(kuò)增引物和檢測(cè)引物;根據(jù)PCV2 Cap的核定位序列和抗原表位,設(shè)計(jì)Cap蛋白的擴(kuò)增引物;參考GB/T 35901—2018設(shè)計(jì)PCV2定量PCR引物和探針,由武漢擎科生物有限公司合成,引物序列見(jiàn)表1。

表1 本研究所用的引物和探針

1.2 方法

1.2.1 臨床樣品的處理 淋巴結(jié)、肺和腎樣品各200 mg,在冰上剪碎,按照體積比1∶3加入磷酸鹽緩沖液(PBS),用組織破碎儀破碎10 min,-80 ℃反復(fù)凍融3次,4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min,取上清用于病原檢測(cè)和分離培養(yǎng),其余于-80 ℃保存。

1.2.2 PCR 根據(jù)DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取樣品DNA,使用表1中相應(yīng)引物和高保真DNA聚合酶擴(kuò)增PCV2全基因組、檢測(cè)區(qū)域和Cap蛋白抗原表位區(qū)域。PCR反應(yīng)體系:DNA 100 ng、引物F/R各2 μL、2×Phanta Max Master Mix (Dye Plus) 25 μL,加無(wú)酶ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 3 min;(95 ℃ 15 s、Tm值溫度 15 s、72 ℃ 30 s·kb-1)35個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。

定量PCR(qPCR):使用表1中PCV2定量檢測(cè)引物和Taq Pro HS Universal Probe Master Mix,依據(jù)說(shuō)明書(shū)推薦反應(yīng)體系定量檢測(cè)PCV2,反應(yīng)條件:95 ℃ 30 s;95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s,45個(gè)循環(huán)。

1.2.3 全基因組測(cè)序 使用瓊脂糖凝膠電泳分離PCV2全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物,回收相應(yīng)條帶,經(jīng)加尾反應(yīng)后連接pMD-18 T載體,轉(zhuǎn)化到DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)抗生素篩選和PCR鑒定后挑選陽(yáng)性菌落,送至武漢擎科生物有限公司測(cè)序,使用SnapGene進(jìn)行基因注釋。

1.2.4 序列分析 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[15],從GenBank下載PCV2各基因型毒株的全基因組參考序列;使用MEGAX Clustal W算法比對(duì)測(cè)序結(jié)果和參考序列;使用MEGAX neighbor-joiningmethod算法繪制基于全基因組和ORF2序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[16];使用RDP5.0分析基因重組事件[17];使用DNASTAR MegAlign分析序列相似性;使用TMHMM預(yù)測(cè)Cap跨膜區(qū)域;使用SignalP 5.0預(yù)測(cè)Cap信號(hào)肽;獲取Cap抗原表位信息[18],使用在線工具(www.novopro.cn/tools/color_align_prop.html)比對(duì)Cap抗原表位差異。

1.2.5 病毒分離和毒價(jià)測(cè)定 病毒分離:取“1.2.1”的上清液,經(jīng)孔徑0.22 μm的濾器過(guò)濾后,按體積比1∶4同步接種PK-15細(xì)胞懸液,培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)成單層;使用300 mmol·L-1D-氨基葡萄糖孵育30 min,換2% FBS DMEM,繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h,-80 ℃反復(fù)凍融3次后,4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min,取上清即為病毒液。

毒價(jià)測(cè)定:將病毒液作連續(xù)10倍稀釋(10-1～10-10);按照每孔100 μL加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每個(gè)稀釋度作一縱列;每孔加100 μL PK-15細(xì)胞懸液,使細(xì)胞量達(dá)到2×105～3×105個(gè)·mL-1;正常細(xì)胞對(duì)照作兩縱列(100 μL 10% FBS DMEM+100 μL細(xì)胞懸液);37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)成單層,使用300 mmol·L-1D-氨基葡萄糖溶液孵育30 min,換用2% FBS DMEM繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h,使用間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)確定陽(yáng)性孔(未保護(hù))和陰性孔的數(shù)量(保護(hù));按Reed-Muench法計(jì)算50%細(xì)胞感染量(TCID50)。lgTCID50=高于50%感染率的血清稀釋度的對(duì)數(shù)+距離比例×稀釋度對(duì)數(shù)的差,距離比例=(高于50%的感染率-50%)/(高于50%的感染率-低于50%的感染率)。

1.2.6 間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA) 取病毒液同步接種PK-15細(xì)胞,培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)至單層,使用300 mmol·L-1D-氨基葡萄糖孵育30 min,換用2% FBS DMEM繼續(xù)培養(yǎng)48 h;吸棄培養(yǎng)基,用PBS洗2次;加入100 μL·孔-1的預(yù)冷無(wú)水乙醇,-20 ℃靜置30 min,棄去固定液,PBS洗3次,5 min·次-1;加入100 μL·孔-11∶500稀釋的PCV2豬多克隆抗體,37 ℃孵育1 h,PBS洗3次,5 min·次-1;加入100 μL·孔-11∶200稀釋的FITC標(biāo)記兔抗豬IgG抗體,37 ℃孵育1 h,PBS洗3次,5 min·次-1;加入50～100 μL·孔-1PBS,使用倒置熒光顯微鏡觀察熒光信號(hào)。

1.2.7 Cap蛋白表達(dá) 回收BamHⅠ-2Cap127/HindⅢ-2Cap663Cap引物的擴(kuò)增產(chǎn)物,連接pMD-18 T載體,轉(zhuǎn)化到DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)抗生素篩選和PCR鑒定挑選陽(yáng)性菌落;擴(kuò)大培養(yǎng)后,提取質(zhì)粒pMD-18 T-2Cap;使用BamHⅠ和HindⅢ酶切質(zhì)粒pMD-18 T-2Cap和pET-28a;使用T4 DNA連接酶連接2Cap和pET-28a;轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)抗生素篩選、PCR鑒定和基因測(cè)序挑選陽(yáng)性菌落。將陽(yáng)性菌接種于LB液體培養(yǎng)基,培養(yǎng)至OD值0.5左右,加入1.0 mmol·L-1IPTG,37 ℃誘導(dǎo)4 h,10 000 r·min-130 min收集菌體,經(jīng)高壓破碎,收集包涵體和破碎上清,使用His標(biāo)簽蛋白瓊脂糖高速純化樹(shù)脂純化Cap蛋白,使用SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)Cap蛋白表達(dá)情況。

1.2.8 小鼠免疫試驗(yàn) 將100 μg Cap和弗氏完全佐劑等體積乳化混勻,經(jīng)皮下注射到小鼠頸背部;3周后,將100 μg Cap和弗氏不完全佐劑等體積混勻乳化后,經(jīng)皮下注射到小鼠頸背部;每周通過(guò)尾靜脈采集小鼠的血液并分離血清。

1.2.9 血清中和病毒試驗(yàn) 固定病毒-稀釋血清法(使用IFA評(píng)價(jià)):將病毒原液稀釋成含200 TCID50·0.1 mL-1;將血清56 ℃滅活30 min,在96孔板中作連續(xù)2倍稀釋(50 μL血清+50 μL 10% FBS DMEM),每個(gè)稀釋度作4孔;再加50 μL病毒液,混勻,37 ℃孵育60 min;同時(shí)設(shè)待檢血清毒性對(duì)照,陰、陽(yáng)性血清對(duì)照,病毒對(duì)照和正常細(xì)胞對(duì)照;每孔加入100 μL PK-15細(xì)胞懸液,培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)成單層,使用300 mmol·L-1D-氨基葡萄糖溶液孵育30 min,換用2% FBS DMEM,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,使用IFA確定陽(yáng)性孔(未保護(hù))和陰性孔的數(shù)量(保護(hù));按Reed-Muench兩氏法計(jì)算中和效價(jià)(PD50)。lgPD50=高于50%保護(hù)率的血清稀釋度的對(duì)數(shù)+距離比例×稀釋度對(duì)數(shù)的差,距離比例=(高于50%的保護(hù)率-50%)/(高于50%的保護(hù)率-低于50%的保護(hù)率)。

血清抑制PCV2試驗(yàn)(使用qPCR評(píng)價(jià)):將100 μL 1/8稀釋的血清與100 μL PCV2(200 TCID50)混合,37 ℃孵育60 min;同時(shí)設(shè)待陰性血清對(duì)照,病毒對(duì)照和正常細(xì)胞對(duì)照;每孔加入100 μL PK-15細(xì)胞懸液,培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)成單層,使用300 mmol·L-1D-氨基葡萄糖溶液孵育30 min,換用2%FBS DMEM,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,使用qPCR檢測(cè)各組細(xì)胞中的PCV2載量。

2 結(jié) 果

2.1 臨床樣品中PCV2的PCR檢測(cè)

以病豬的淋巴結(jié)、肺和腎DNA為模板,使用基因片段檢測(cè)引物494-F/494-R和全基因組檢測(cè)引物SacⅡ-PCV2-F/SacⅡ-PCV2-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果表明,在約494處和1 767 bp處均出現(xiàn)特異性條帶,證明病豬組織存在PCV2感染。將該柱PCV2命名為PCV2 XY2022,GenBank登錄號(hào)為OM249 965.1。

2.2 PCV2 XY2022毒株的分離和鑒定

將陽(yáng)性組織混合、勻漿、凍融、離心和過(guò)濾除菌后,取上清液接種PK-15細(xì)胞,并連續(xù)傳代培養(yǎng)。提取傳代培養(yǎng)物DNA,使用引物SacⅡ-PCV2-F/SacⅡ-PCV2-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,均能擴(kuò)增到1 767 bp左右的特異性條帶(圖1a),說(shuō)明XY2022毒株能在PK-15細(xì)胞上穩(wěn)定傳代。

a. PCV2 XY2022傳代的PCR鑒定[M.DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);N1～N3. 陰性對(duì)照(PBS、DMEM、未感染的PK-15細(xì)胞);P. 陽(yáng)性對(duì)照-PCV2WH;1～6. 第3、6、9、12、15、18代XY2022病毒液];b. PCV2 XY2022的間接免疫熒光檢測(cè)a. PCR results of PCV2 XY2022 strain in different generations (M. DL2000 DNA marker; N1-N3. Negative control (PBS, DMEM, non-infected PK-15 cells); P. Positive control-PCV2WH; 1-6. The 3rd, 6th, 9th, 12th, 15th and 18th generations of PCV2XY2022); b. IFA results of PK-15 cells infected with PCV2 XY2022 strain圖1 PCV2 XY2022毒株的PCR和IFA鑒定Fig.1 PCR and IFA detection of PCV2 XY2022 strain

將第12代病毒液接種PK-15細(xì)胞,在第60小時(shí)使用IFA檢測(cè)感染情況,發(fā)現(xiàn)XY2022和陽(yáng)性對(duì)照毒株P(guān)CV2WH均產(chǎn)生特異性熒光,而未接種病毒的細(xì)胞無(wú)特異性熒光,說(shuō)明XY2022毒株在PK-15細(xì)胞上有效增殖(圖1b)。經(jīng)IFA測(cè)定,XY2022的毒價(jià)為105.70TCID50·mL-1。

2.3 XY2022的基因組序列比對(duì)和遺傳進(jìn)化分析

全基因組測(cè)序結(jié)果顯示,XY2022全基因組長(zhǎng)度為1 767 nt,ORF2基因長(zhǎng)度為705 nt。基于全基因組和ORF2的進(jìn)化分析結(jié)果均表明,XY2022屬于PCV2d基因亞型毒株,與廣西毒株(GenBank號(hào):FJ426398.1)的親緣關(guān)系最近(圖2)。

圖2 PCV2 XY2022毒株的進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of PCV2 XY2022 strain

基于全基因組的核苷酸序列同源性分析顯示,XY2022和參考毒株的相似性為94.3%～99.8%,與廣西毒株(GenBank號(hào):FJ426 398.1)的相似性最高,達(dá)到99.8%?；贠RF2的核苷酸序列同源性分析顯示,XY2022和參考毒株的相似性為89.2%～99.6%,與廣西毒株(GenBank號(hào):FJ426398.1)和黑龍江毒株(GenBank號(hào):HM038031.1)的相似性最高,均為99.6%。

基于RDP5.0多種算法(RDP、P≤1.121×10-27;GENECONV,P≤2.441×10-25;Maxchi,P≤1.125×10-13;Chimaera,P≤5.111×10-15;SiSscan,P≤2.409×10-16;3Seq,P≤1.374×10-35)的基因重組分析結(jié)果顯示,XY2022與參考毒株不存在基因重組事件。

2.4 XY2022 Cap氨基酸序列比對(duì)和抗原表位分析

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[18],Cap蛋白的第65-77、113-139、169-183和193-207位aa是其線性免疫優(yōu)勢(shì)區(qū),第47-63、165-200和230-233位aa是其構(gòu)象中和表位,第156-162、175-192、195-202和231-233位aa是其線性中和表位,第110、191位aa是PCV2毒力調(diào)節(jié)關(guān)鍵位點(diǎn)。XY2022 Cap和參考毒株Cap的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明,XY2022 Cap氨基酸序列存在多個(gè)變異度較高的區(qū)域,分別是47-78、130-136和185-210位aa;線性免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)的68位aa由A突變?yōu)镹、134位aa由T突變?yōu)镹,構(gòu)象中和表位的63位aa由S突變?yōu)镽。此外,相比于PCV2a和PCV2b,PCV2d、PCV2c和部分PCV2e的Cap羧基端多1個(gè)K殘基(圖3)。

2.5 XY2022 Cap蛋白的表達(dá)和純化

表達(dá)XY2022 Cap和PCV2b(WH)Cap的高變區(qū)和抗原表位突變位點(diǎn)所在區(qū)域,SDS-PAGE結(jié)果表明,該蛋白大小約26 ku,在細(xì)菌包涵體和破碎上清中均可穩(wěn)定表達(dá)(圖4a)。使用His標(biāo)簽蛋白瓊脂糖高速純化樹(shù)脂純化Cap蛋白,獲得單一條帶的XY2022 Cap(圖4b)和WH Cap(圖4c)。進(jìn)一步Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),純化的蛋白與His抗體以及PCV2 Cap蛋白抗體均可特異性結(jié)合,表明純化的蛋白具有良好的生物學(xué)活性(圖4d)。

a. SDS-PAGE檢測(cè)Cap蛋白的表達(dá)(M. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. 包涵體中的XY2022 Cap蛋白;2. 細(xì)菌破碎上清中的XY2022 Cap蛋白;3. 包涵體中的WH Cap蛋白;4. 細(xì)菌破碎上清中的WH Cap蛋白);b. SDS-PAGE檢測(cè)純化的XY2022 Cap蛋白(M. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1～3. Ni填料結(jié)合后洗脫的XY2022 Cap蛋白);c. SDS-PAGE檢測(cè)純化的WH Cap蛋白(M. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1～3. Ni填料結(jié)合后洗脫的WH Cap蛋白);d. Western blot檢測(cè)純化的XY2022 Cap蛋白和WH Cap蛋白(1. XY2022 Cap蛋白;2. WH Cap蛋白)a. Detection of Cap protein expression by SDS-PAGE (M. Protein marker; 1. XY2022 Cap protein in inclusion bodies; 2. XY2022 Cap protein in bacterial lysis supernatant; 3. WH Cap protein in inclusion bodies; 4. WH Cap protein in bacterial lysis supernatant); b. Detection of the purified XY2022 Cap by SDS-PAGE (M. Protein marker; 1-3. XY2022 Cap protein elution after Ni-NTA binding); c. Detection of the purified WH Cap by SDS-PAGE (M. Protein marker; 1-3. WH Cap protein elution after Ni-NTA binding); d. Detection of the purified XY2022 Cap and purified WH Cap by Western blot (1. Purified XY2022 Cap; 2. Purified WH Cap)圖4 XY2022 Cap和WH Cap的表達(dá)和純化Fig.4 expression and purification of XY2022 Cap and WH Cap

2.6 XY2022 Cap的小鼠免疫原性評(píng)價(jià)

為了評(píng)價(jià)抗原表位差異對(duì)PCV2 Cap免疫原性的影響,分別使用PCV2b(WH)Cap和PCV2d(XY2022)Cap免疫小鼠,使用IFA測(cè)定小鼠血清中和效價(jià)。結(jié)果表明,中和抗體最早在免疫后第3周可被檢測(cè)到,并逐周升高,在免疫后第6周達(dá)到最高,其中WH Cap和XY2022 Cap誘導(dǎo)的針對(duì)XY2022毒株的中和效價(jià)最高達(dá)到26.66和25.66(圖5a),即:1/26.66稀釋的WH Cap免疫血清可通過(guò)中和作用殺滅或抑制XY2022,保護(hù)50%的細(xì)胞免于被感染;1/25.66稀釋的XY2022 Cap免疫血清可通過(guò)中和作用殺滅或抑制XY2022,保護(hù)50%細(xì)胞免于被感染。WH Cap和XY2022 Cap誘導(dǎo)的針對(duì)WH毒株的中和效價(jià)最高達(dá)到26.33和26.17(圖5b)。免疫后第7周,WH Cap誘導(dǎo)的中和效價(jià)水平均顯著降低,而XY2022 Cap誘導(dǎo)的中和抗體水平仍保持穩(wěn)定,說(shuō)明WH Cap和XY2022 Cap均能誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,但是XY2022 Cap誘導(dǎo)的中和抗體水平相對(duì)穩(wěn)定。

a. XY2022 Cap和WH Cap免疫小鼠血清針對(duì)XY2022的中和抗體水平;b. XY2022 Cap和WH Cap免疫小鼠血清針對(duì)PCV2WH的中和抗體水平;c. XY2022 Cap和WH Cap免疫小鼠血清抑制PCV2感染活性的qPCR檢測(cè)結(jié)果,ns.P>0.05a. Levels of neutralizing antibodies against XY2022 strains in sera from XY2022 Cap immunized mice and WH Cap immunized mice; b. Levels of neutralizing antibodies against PCV2WH strains in sera from XY2022 Cap immunized mice and WH Cap immunized mice; c. qPCR results of anti-PCV2 activity in sera from XY2022 Cap immunized mice and WH Cap immunized mice,ns.P>0.05,***圖5 PCV2b Cap和PCV2d Cap免疫小鼠血清的抗PCV2活性Fig.5 Anti-PCV2 activity in sera of mice immunized with PCV2b Cap and PCV2d Cap

另一方面,通過(guò)qPCR評(píng)價(jià)血清抑制PCV2感染的效果發(fā)現(xiàn),相比于非處理組和PBS免疫小鼠血清組,WH Cap和XY2022 Cap免疫小鼠血清和PCV2共孵育再感染PK-15細(xì)胞,可顯著降低細(xì)胞中PCV2的載量(圖5c),表明兩種血清中和抗體均能有效殺滅PCV2,抑制PCV2感染PK-15細(xì)胞。后續(xù)將繼續(xù)分離新型PCV2毒株,評(píng)估其Cap蛋白的免疫原性,測(cè)定其中和抗體抑制不同基因型PCV2的效果。

3 討 論

自1998年首次被報(bào)道以來(lái)[19],PCV2快速成為養(yǎng)豬業(yè)最流行的病原之一,造成巨大經(jīng)濟(jì)損失并持續(xù)威脅生豬產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展[20]。作者團(tuán)隊(duì)以及其他相關(guān)研究表明,湖北省規(guī)?；i場(chǎng)的PCV2檢出率高居不下,近年來(lái)一直維持在38%以上[21-22]。本研究中,作者在湖北省某規(guī)?；i場(chǎng)發(fā)現(xiàn)疑似PMWS的仔豬,通過(guò)PCR等技術(shù)檢測(cè)其PCV2感染情況,結(jié)合豬場(chǎng)后續(xù)的用藥治療情況,證明導(dǎo)致該場(chǎng)仔豬發(fā)病的病原為PCV2。

PCV2基因組突變頻率高,導(dǎo)致我國(guó)PCV2流行毒株經(jīng)歷了PCV2a向PCV2b,2009年后向PCV2d轉(zhuǎn)變的快速過(guò)程[1,11,21]。因此,持續(xù)監(jiān)測(cè)各個(gè)省份的PCV2流行情況并分離新型毒株對(duì)于相關(guān)疾病的防控具有重要意義。本研究中,作者發(fā)現(xiàn)引起湖北省某規(guī)模場(chǎng)仔豬發(fā)病的病原為PCV2,并通過(guò)基于全基因組和ORF2的進(jìn)化分析證明其屬于PCV2d基因亞型,這與國(guó)內(nèi)近年來(lái)的流行病學(xué)報(bào)道以及作者團(tuán)隊(duì)監(jiān)測(cè)結(jié)果[1,11]是相符的。該P(yáng)CV2與各基因型參考毒株的全基因組相似性為94.3%～99.8%,ORF2基因相似性為89.2%～99.6%,與廣西毒株(GenBank號(hào):FJ426 398.1)和黑龍江毒株(GenBank號(hào):HM038 031.1)的相似性最高,推測(cè)其可能源于各省之間的生豬流通和豬肉產(chǎn)品交易。作者進(jìn)一步使用豬腎上皮細(xì)胞系PK-15分離出該P(yáng)CV2d毒株,將其命名為XY2022,并將其序列上傳GenBank獲得登錄號(hào)OM249965.1。PCR和IFA檢測(cè)結(jié)果均證明,XY2022在PK-15細(xì)胞上具有穩(wěn)定的增殖性能,毒價(jià)可達(dá)到105.70TCID50·mL-1,為后續(xù)的PCV2致病性研究和疫苗開(kāi)發(fā)提供關(guān)鍵材料。

現(xiàn)階段基于PCV2a和PCV2b的商品化疫苗以及基于Cap蛋白的亞單位疫苗仍能為豬群提供抗PCV2a、PCV2b和PCV2d毒株的保護(hù)力[11,23-25]。但是,不同基因型之間的保護(hù)力并不完全,PCV2d感染仔豬可導(dǎo)致更重的臨床癥狀和更早的排毒現(xiàn)象[13-14]。本研究中,作者比較了XY2022和其他基因型毒株的Cap蛋白差異,發(fā)現(xiàn)不同基因型毒株的Cap蛋白氨基酸殘基數(shù)目有所差異,其中PCV2a、PCV2b和PCV2c的氨基酸殘基數(shù)量為233,PCV2d的氨基酸殘基數(shù)為234,這與已報(bào)道結(jié)果一致[14]。另一方面,Cap蛋白有4個(gè)優(yōu)勢(shì)抗原表位,分別是65—87aa、113—139aa、169—183aa和少量的羧基端氨基酸殘基,其中169—183位表位為誘餌表位,導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)PCV2的非中和抗體[26-27]。PCV2d Cap相比于PCV2a Cap,有23個(gè)氨基酸殘基突變,造成抗原表位構(gòu)象改變,可能導(dǎo)致PCV2病毒粒子逃避宿主的免疫清除[28],但其并未通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)證明該假設(shè)。在本研究中,作者比對(duì)了XY2022 Cap和PCV2b Cap之間的抗原表位差異,發(fā)現(xiàn)XY2022 Cap存在多個(gè)高變異度區(qū)域,分別是47—78、130—136和185—210位aa,并且線性免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)的68位aa由A突變?yōu)镹、134位aa由T突變?yōu)镹,構(gòu)象中和表位的63位aa由S突變?yōu)镽,這些可能是造成不同基因型PCV2之間保護(hù)力差異的關(guān)鍵位點(diǎn)。因此,作者通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了含有差異位點(diǎn)的XY2022(2 d)Cap和WH(2b)Cap,并通過(guò)免疫小鼠制備相應(yīng)陽(yáng)性血清。通過(guò)IFA和qPCR試驗(yàn)評(píng)估血清的中和效價(jià)和抗病毒感染效果,發(fā)現(xiàn)2b和2d亞型PCV2的Cap均能有效刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生抗PCV2感染的中和抗體,但兩者誘導(dǎo)中和抗體的水平稍有差異,XY2022 Cap誘導(dǎo)的中和抗體水平相對(duì)穩(wěn)定,說(shuō)明2b Cap和2 d Cap抗原表位的氨基酸差異并不能顯著改變血清中和抗體水平,提示現(xiàn)有基于PCV2a和2b亞型的疫苗仍能有效抵抗PCV2流行毒株感染,但PCV2d疫苗具有更好的臨床應(yīng)用效果。持續(xù)分離流行毒株,研究其致病力和免疫原性,仍舊是未來(lái)防控PCV2相關(guān)疾病的關(guān)鍵。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)PCV2是導(dǎo)致湖北省某規(guī)模豬場(chǎng)PMWS的病原,并成功分離該毒株,將其命名為XY2022(GenBank登錄號(hào):OM249965.1);XY2022屬于PCV2d,相較于其他基因型毒株,其Cap的線性免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)、線性中和表位和構(gòu)象中和表位均存在差異位點(diǎn);XY2022 Cap和WH(2b) Cap均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗PCV2感染的中和抗體,且XY2022 Cap誘導(dǎo)的中和抗體水平更穩(wěn)定。