李平會(huì),蒲 廣,王中宇,周五朵,3,牛培培,吳承武,侯黎明,3,黃瑞華,3*,李平華,3*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)養(yǎng)豬研究所(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽(豬)資源評(píng)價(jià)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(南京)),南京 210095;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)淮安研究院,淮安 223001;3.江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(生豬)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系集成創(chuàng)新中心,南京 210095)

麥麩是小麥加工制粉過程中的主要副產(chǎn)物[1],營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富,主要由非淀粉多糖、淀粉、蛋白質(zhì)和木質(zhì)素組成。2021年我國(guó)小麥年產(chǎn)量高達(dá)1.37億噸,麥麩產(chǎn)量達(dá)到2 700多萬噸[2],資源豐富。因此,麥麩在豬養(yǎng)殖中的合理利用對(duì)于降低養(yǎng)殖成本,緩解人畜爭(zhēng)糧問題,以及提高我國(guó)非常規(guī)飼料資源的利用率具有重要意義。膳食纖維在維持豬的消化道的正常生理功能中具有重要的作用[3],能夠改變腸道微生物群落結(jié)構(gòu)[4-5],影響飼糧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收[6],改善腸道健康[7]和調(diào)節(jié)宿主的免疫力[8]。Pu等[9]發(fā)現(xiàn),在蘇淮育肥豬日糧中添加適宜的纖維提高了后腸微生物的多樣性和代謝能力。He等[10]研究表明,在日糧中補(bǔ)充發(fā)酵麥麩可顯著提高杜×長(zhǎng)×大三元雜交生長(zhǎng)育肥豬血清免疫球蛋白水平和腸道微生物的多樣性,增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力。同時(shí)Luo等[11]也指出,燕麥麩對(duì)杜×長(zhǎng)×大三元雜交生長(zhǎng)豬的腸道健康是有益的,主要改善了結(jié)腸的腸道屏障。

梅山豬是我國(guó)太湖流域最具代表性的地方豬種,具備耐粗飼和抗逆性強(qiáng)的特性。許多國(guó)內(nèi)外的研究[12-13]表明,與外國(guó)商品豬相比,梅山豬對(duì)許多疾病有更強(qiáng)的耐受性和抵抗能力。Halbur等[14]發(fā)現(xiàn),與漢普夏豬和杜洛克豬相比,梅山豬更少感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒。Chen等[15]比較了梅山豬和杜×長(zhǎng)×大三元雜交豬小腸、脾和肝等多個(gè)組織中與免疫力相關(guān)的β-防御素的表達(dá),發(fā)現(xiàn)梅山豬的表達(dá)更高。Dong等[16]也發(fā)現(xiàn),與雜交新生仔豬相比,梅山豬仔豬擁有更強(qiáng)的腸道屏障功能。前人關(guān)于日糧纖維水平對(duì)豬免疫調(diào)節(jié)的研究大多集中在外種豬,而日糧纖維對(duì)梅山豬免疫能力的影響及其相關(guān)機(jī)理的研究較少。

因此,本研究以大白豬為對(duì)照,選擇梅山豬作為試驗(yàn)動(dòng)物,旨在分析不同水平麩皮替代基礎(chǔ)日糧對(duì)梅山豬的血常規(guī)和血液生化指標(biāo)、血清免疫球蛋白和腸道黏膜SIgA濃度的影響,以及日糧麩皮對(duì)梅山豬腸道基因表達(dá)和微生物群落結(jié)構(gòu)的影響,研究日糧纖維對(duì)中西方豬種免疫能力的不同調(diào)節(jié)和對(duì)梅山豬免疫機(jī)制的影響,為更科學(xué)地利用我國(guó)麥麩等非常規(guī)飼料資源進(jìn)行地方豬種的健康飼養(yǎng)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)選取梅山豬(初始體重(67.08±1.53)kg)和與梅山豬相同生理階段的大白豬(初始體重(81.04±1.64)kg)各28頭,隨機(jī)各分成4個(gè)處理組,每組7個(gè)重復(fù),采用自動(dòng)飼喂系統(tǒng)奧飼本(OSB Livestock Technology Co, 111 Ltd,上海,中國(guó))飼喂試驗(yàn)豬只,每個(gè)重復(fù)1頭豬,預(yù)試期7 d,正試期28 d,結(jié)束時(shí)將試驗(yàn)豬全部屠宰。預(yù)試期所有豬只飼喂相同的基礎(chǔ)日糧,正試期4個(gè)處理組豬分別飼喂基礎(chǔ)日糧(Basal)、7%麩皮替代基礎(chǔ)日糧(7% WBR)、10.5%麩皮替代基礎(chǔ)日糧(10.5% WBR)和14%麩皮替代基礎(chǔ)日糧(14% WBR)。目前沒有一個(gè)日糧配方能同時(shí)滿足脂肪型梅山豬和瘦肉型大白豬兩個(gè)不同類型豬種的能量需求,同時(shí)考慮到本試驗(yàn)是以大白豬為對(duì)照,梅山豬為試驗(yàn)豬,分析日糧纖維水平對(duì)梅山豬血液和腸道免疫指標(biāo)的影響及其機(jī)理,因此決定先以滿足梅山豬需求為主,選擇豬營(yíng)養(yǎng)需要(GB/T 39235—2020)中脂肪型生長(zhǎng)肥育豬相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行基礎(chǔ)日糧的配制。各處理組飼糧組成除纖維水平不一致,飼糧中蛋白質(zhì)、能量、鈣、磷、賴氨酸、蛋-胱氨酸均進(jìn)行了調(diào)平,各項(xiàng)指標(biāo)基本一致。同時(shí),考慮到(GB/T 39235—2020)中脂肪型生長(zhǎng)肥育豬相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)日糧中能量低于大白豬的需求,因此本試驗(yàn)設(shè)計(jì)中所有試驗(yàn)豬都自由采食,通過采食量來彌補(bǔ)能量不足問題。具體試驗(yàn)日糧原料組成及部分營(yíng)養(yǎng)成分見表1,飼料原料和預(yù)混料中均未添加任何抗生素產(chǎn)品。

表1 日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 飼養(yǎng)管理

本試驗(yàn)在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)淮安研究院試驗(yàn)豬場(chǎng)進(jìn)行,每欄7頭豬。試驗(yàn)期間,所有試驗(yàn)豬均自由采食和飲水,并按照豬場(chǎng)常規(guī)飼養(yǎng)管理程序?qū)λ性囼?yàn)豬只進(jìn)行飼養(yǎng)管理與免疫,定時(shí)進(jìn)行豬舍的消毒與清掃,保持豬舍清潔與通風(fēng)。飼養(yǎng)過程中全部豬都處于健康狀態(tài),沒有出現(xiàn)疾病和腹瀉問題。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 血液常規(guī)和血液生化指標(biāo)測(cè)定 在正試驗(yàn)期第28天經(jīng)頸靜脈采集全部試驗(yàn)豬的血液樣品,采集的抗凝血樣置于4℃條件下,直接送到淮安市淮陰醫(yī)院南陳集分院,使用邁瑞5300血細(xì)胞分析儀測(cè)定血液常規(guī)指標(biāo),使用貝克曼480生化分析儀測(cè)定血液生化指標(biāo);采集的不抗凝血樣室溫靜置30 min,以3 000 r·min-1離心10 min后,吸取上層血清樣品并保存在-80℃冰箱中,用于測(cè)定血清免疫球蛋白濃度。

1.3.2 血清免疫球蛋白濃度測(cè)定 上述制備的血清樣品用于測(cè)定血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)的含量,使用武漢華美豬免疫球蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行測(cè)定,操作步驟詳見試劑盒說明書。

3）融合——融合的方向包括：通過新零售的技術(shù)手段從線上引流新會(huì)員，吸引到店消費(fèi)；設(shè)立店鋪微商城，讓會(huì)員線上下單后店鋪送貨上門（主要針對(duì)店鋪半徑為3 km以內(nèi)的會(huì)員）；店鋪要融合美容、化妝、美發(fā)、美甲、身體護(hù)理、保健、中醫(yī)養(yǎng)生等項(xiàng)目于一體，為消費(fèi)者提供全方面的服務(wù)、返店和口碑推薦的機(jī)會(huì)；

1.3.3 盲腸和結(jié)腸黏膜分泌型免疫球蛋白A(SIgA)濃度測(cè)定 在正試期第28天屠宰所有試驗(yàn)豬后,迅速取出腸道并剝離盲腸和結(jié)腸,無菌剪刀剪開盲腸和結(jié)腸中段,生理鹽水將內(nèi)容物洗去,吸水紙吸干表面多余的水分,用無菌載玻片刮取黏膜樣品置于2 mL凍存管內(nèi),采樣結(jié)束后,將所有樣品放入-80 ℃冰箱待測(cè)。使用武漢華美豬分泌型免疫球蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定盲腸和結(jié)腸黏膜樣品中SIgA的含量,操作步驟詳見試劑盒說明書。

1.3.4 梅山豬結(jié)腸黏膜的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq) 按照Yeasen的RNA提取試劑盒(MolPure?Cell/Tissue Total RNA Kit)說明書中的步驟提取梅山豬結(jié)腸黏膜RNA樣品,并送至武漢華大基因進(jìn)行RNA-seq測(cè)序,測(cè)序流程包括RNA樣品質(zhì)檢、文庫(kù)建立、Illumina Hiseq 2500測(cè)序平臺(tái)對(duì)樣品進(jìn)行雙末端測(cè)序得到raw reads、利用Fastqc軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控及過濾、最終獲得clean reads。

1.3.5 梅山豬結(jié)腸內(nèi)容物的宏基因組測(cè)序 梅山豬屠宰后,迅速剝離結(jié)腸及采樣部位的腸系膜,用無菌剪刀在腸壁上剪個(gè)小孔,將內(nèi)容物擠到2 mL的無菌凍存管中并放入-80 ℃冰箱保存。按照Omega Bio-Tek的DNA提取試劑盒(E.Z.N.A.?Stool DNA Kit)說明書中的步驟提取梅山豬結(jié)腸內(nèi)容物的DNA樣品,并送至上海美吉生物進(jìn)行宏基因組測(cè)序,測(cè)序流程包括DNA質(zhì)檢、超聲波破碎儀Covaris M220將DNA片段化、使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit構(gòu)建PE文庫(kù)、使用軟件Seqprep(https:∥github.com/jstjohn/SeqPrep)、Sickle(https:∥github.com/najoshi/sickle)和BWA(http:∥bio-bwa.sourceforge.net)進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控、使用軟件MEGAHIT(https:∥github.com/voutcn/megahit)進(jìn)行拼接組裝、使用MetaGene(http:∥metagene.cb.k.u-tokyo.ac.jp/)進(jìn)行基因預(yù)測(cè)、使用軟件CD-HIT(http:∥www.bioinformatics.org/cd-hit/)構(gòu)建非冗余基因集、使用軟件SOAPaligner(http:∥soap.genomics.org.cn/)進(jìn)行基因豐度計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過Excel 2019軟件初步整理試驗(yàn)數(shù)據(jù),利用SPSS 26.0軟件中的單因素方差分析(ANOVA)分析不同日糧麩皮替代水平對(duì)各指標(biāo)的線性和二次方的影響;利用SPSS 26.0軟件中的一般線性模型分析品種和日糧的交互作用對(duì)各指標(biāo)的影響;利用R包DESeq2通過FPKM方法對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,并分析差異表達(dá)基因(p-adjust value<0.05; |log2 (fold change)|>1);使用在線數(shù)據(jù)庫(kù)KOBAS(http:∥kobas.cbi.pku.edu.cn)對(duì)差異基因進(jìn)行GO和KEGG功能富集;利用上海美吉生物云平臺(tái)(https:∥cloud.majorbio.com)分析宏基因組測(cè)序數(shù)據(jù)和進(jìn)行相關(guān)性分析。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)”表示。若P<0.05表示差異顯著,若P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同日糧麩皮替代水平對(duì)梅山豬和大白豬血液常規(guī)和血液生化的影響

由表2和3可知,隨日糧麩皮替代水平的升高,梅山豬的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞百分比和嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)呈線性降低(P<0.05),血清球蛋白呈二次方變化(P<0.05);豬品種和日糧的交互作用對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞百分比、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量、紅細(xì)胞分布寬度標(biāo)準(zhǔn)差及血清球蛋白產(chǎn)生顯著的影響(P<0.05);值得注意的是,進(jìn)一步比較兩品種豬的血清球蛋白濃度發(fā)現(xiàn)(圖1),梅山豬和大白豬的Basal組、7%和10.5% WBR組的血清球蛋白濃度差異不顯著(P>0.05),但14% WBR組梅山豬的血清球蛋白濃度顯著高于大白豬(P<0.05)。

MS.梅山豬; LW.大白豬.*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01),下同MS. Meishan pigs; LW. Large white pigs. * means significant difference (P<0.05),** means extremely significant difference (P<0.01), the same as below圖1 不同日糧麩皮替代水平對(duì)梅山豬和大白豬血清球蛋白水平的影響Fig.1 Effects of different dietary wheat bran replacement levels on serum globulin level in Meishan pigs and Large White pigs

表3 不同日糧麩皮替代水平對(duì)梅山豬和大白豬血生化指標(biāo)的影響

2.2 不同日糧麩皮替代水平對(duì)梅山豬和大白豬血清免疫球蛋白的影響

由表4可知,隨日糧麩皮替代水平的升高,梅山豬的血清IgA呈二次方變化,血清IgM和IgG呈線性升高(P<0.01);大白豬血清IgM呈線性和二次方變化(P<0.01);豬品種和日糧的交互作用對(duì)血清IgA和IgG產(chǎn)生顯著的影響(P<0.05)。由圖2可知,14% WBR組梅山豬的血清IgG的濃度顯著高于大白豬(P<0.01)。

2.3 不同日糧麩皮替代水平對(duì)梅山豬和大白豬大腸黏膜SIgA的影響

由表5可知,隨日糧麩皮替代水平的升高,梅山豬的結(jié)腸黏膜SIgA濃度極顯著升高(P<0.01),且14% WBR組梅山豬的結(jié)腸黏膜SIgA濃度極顯著高于Basal組和7% WBR組(P<0.01),大白豬的結(jié)腸黏膜SIgA濃度呈線性變化(P<0.05);梅山豬和大白豬的盲腸黏膜SIgA濃度不受日糧麩皮替代水平的影響。

表5 不同日糧麩皮替代水平對(duì)梅山豬和大白豬結(jié)腸和盲腸黏膜SIgA濃度的影響

2.4 Basal組和14% WBR組梅山豬的結(jié)腸黏膜RNA-seq分析

2.4.1 Basal組和14% WBR組梅山豬的結(jié)腸黏膜RNA-seq質(zhì)量分析 提取Basal組和14% WBR組梅山豬的結(jié)腸黏膜RNA進(jìn)行RNA-seq測(cè)序,測(cè)序完成后將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾,每個(gè)樣品得到超過6 G的clean date。測(cè)序結(jié)果見表6,Q20數(shù)據(jù)全部在96%以上,表明測(cè)序深度能滿足后續(xù)分析。

表6 Basal組和14% WBR組梅山豬結(jié)腸黏膜轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量匯總

2.4.2 Basal組和14% WBR組梅山豬的結(jié)腸黏膜RNA-seq差異基因分析和PCA聚類 利用R軟件包DESeq2進(jìn)行差異分析,Basal組和14% WBR組梅山豬的結(jié)腸黏膜共鑒別到26 208個(gè)基因,其中38個(gè)基因在兩組間差異表達(dá),共包括7個(gè)下調(diào)基因和31個(gè)上調(diào)基因見圖3A。根據(jù)各樣品所有基因的FPKM值進(jìn)行PCA主成分分析,Basal組和14% WBR組的組內(nèi)樣品較好的聚在一起,組間樣品出現(xiàn)明顯的分離見圖3B,表明分組具有意義。

圖3 Basal組和14% WBR組梅山豬結(jié)腸黏膜差異表達(dá)基因火山圖(A)和PCA聚類分析(B)Fig.3 Basal group and 14% WBR group Meishan pigs colonic mucosal differentially expressed genes volcano map (A) and PCA cluster analysis (B)

2.4.3 Basal組和14% WBR組梅山豬的結(jié)腸黏膜RNA-seq差異基因功能富集 使用在線數(shù)據(jù)庫(kù)KOBAS對(duì)38個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析,GO富集分析選取細(xì)胞組分(Cellular component,CC)、分子功能(Molecular function,MF)和生物過程(Biological process,BP)三個(gè)功能層面顯著富集的前15個(gè)功能條目做氣泡圖展示,見圖4。在GO富集分析中,CC層面顯著富集到的功能條目是刷狀緣膜(brush border membrane)、細(xì)胞外泌體(extracellular exosome)、膜筏(membrane raft)、含膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)(collagen-containing extracellular matrix)、受體復(fù)合體(receptor complex)及頂端質(zhì)膜(apical plasma membrane)等;MF層面顯著富集到的功能條目是蛋白質(zhì)同二聚化活性(protein homodimerization activity)、層黏連蛋白結(jié)合(laminin binding)、過氧化物酶活性(peroxidase activity)及血紅素結(jié)合(heme binding)等;BP層面顯著富集到的功能條目是氧化還原過程(oxidation-reduction process)、細(xì)胞群增殖的調(diào)節(jié)(regulation of cell population proliferation)、免疫反應(yīng)(immune response)、將螯合的鈣離子釋放到細(xì)胞質(zhì)中(release of sequestered calcium ion into cytosol)及趨化因子介導(dǎo)的信號(hào)通路(chemokine-mediated signaling pathway)等。

在KEGG富集分析中,17條代謝通路被顯著富集見圖5,其中細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互作用信號(hào)通路(Cytokine-cytokine receptor interaction)、病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用信號(hào)通路(Viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor)、趨化因子信號(hào)通路(Chemokine signaling pathway)、原發(fā)性免疫缺陷信號(hào)通路(Primary immunodeficiency)及IgA產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)信號(hào)通路(Intestinal immune network for IgA production)是與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的代謝通路。結(jié)合結(jié)腸黏膜SIgA濃度變化和KEGG富集的信號(hào)通路,最終篩選出調(diào)控SIgA產(chǎn)生的2個(gè)候選差異基因CD4分子(CD4)和CC趨化因子受體9(CCR9),CCR9參與IgA產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)信號(hào)通路。與Basal組相比,14% WBR組顯著提高了梅山豬結(jié)腸黏膜CD4和CCR9基因的表達(dá),見圖6。

圖6 Basal組和14% WBR組梅山豬結(jié)腸黏膜CD4和CCR9基因表達(dá)量Fig.6 Expression of CD4 and CCR9 genes in the colonic mucosa of Meishan pigs in the Basal group and 14% WBR group

2.5 Basal組和14% WBR組梅山豬的結(jié)腸內(nèi)容物宏基因組分析

2.5.1 Basal組和14% WBR組梅山豬的結(jié)腸微生物組成結(jié)構(gòu) 使用群落柱形圖能夠直觀地展示Basal組和14% WBR組梅山豬的結(jié)腸微生物群落組成。Basal組和14% WBR組梅山豬的結(jié)腸微生物結(jié)構(gòu)見圖7A,在門水平上,厚壁菌門(Firmicutes,相對(duì)豐度>43%)和擬桿菌門(Bacteroidetes,相對(duì)豐度>37%)是相對(duì)豐度最高的兩個(gè)菌門,相對(duì)豐度之和大于80%,表明梅山豬結(jié)腸中的大部分微生物屬于厚壁菌門和擬桿菌門;在屬水平見圖7B,優(yōu)勢(shì)菌屬為Prevotella、unclassified_o_Clostridiales、Clostridium、Treponema、Bacteroides、unclassified_f_Lachnospiraceae、unclassified_p_Firmicutes、unclassified_o_Bacteroidales和Lactobacillus。

2.5.2 利用LEFSe分析和相關(guān)性熱圖篩選顯著影響梅山豬免疫調(diào)節(jié)的微生物 為了找到顯著影響梅山豬免疫調(diào)節(jié)的微生物,對(duì)Basal組和14% WBR組梅山豬的結(jié)腸微生物進(jìn)行LEFSe分析。結(jié)果見圖8,在14% WBR組顯著富集5個(gè)種水平微生物(Sutterellasp.、Clostridiumsp.CAG:138、Clostridiumsp.CAG:762、Nitrospirasp.和Desulfurellalesbacterium),1個(gè)屬水平微生物(unclassified_o_Desulfurellales),2個(gè)科水平微生物(Azonexaceae和unclassified_o_Desulfurellales)及1個(gè)綱水平微生物(Rhodocyclales)。為了探究腸道微生物與宿主結(jié)腸黏膜基因的互作,對(duì)體液免疫和結(jié)腸黏膜SIgA的影響,將5個(gè)種水平微生物與調(diào)控SIgA產(chǎn)生的2個(gè)候選結(jié)腸黏膜差異表達(dá)基因(CD4和CCR9)、血清免疫球蛋白和結(jié)腸黏膜SIgA做相關(guān)性分析,結(jié)果見圖9,種水平微生物和調(diào)控SIgA產(chǎn)生的2個(gè)候選宿主結(jié)腸黏膜基因不存在直接互作關(guān)系(P>0.05),但Sutterellasp.、Clostridiumsp.CAG:138、Clostridiumsp.CAG:762和Nitrospirasp.與血清IgG呈顯著正相關(guān),Clostridiumsp.CAG:138和Nitrospirasp.與結(jié)腸黏膜SIgA呈顯著正相關(guān),該結(jié)果表明日糧纖維引起的腸道微生物變化不直接調(diào)控影響SIgA產(chǎn)生的宿主腸道基因的改變,可能通過微生物代謝產(chǎn)物影響機(jī)體免疫。

圖8 LEfSe分析Basal組和14% WBR組梅山豬結(jié)腸顯著富集的微生物Fig.8 LEfSe analysis of significantly enriched microorganisms in the colon of Meishan Pigs in the Basal group and 14% WBR group

圖9 14% WBR組顯著富集的種水平微生物與宿主結(jié)腸黏膜基因、血清免疫球蛋白及SIgA的相關(guān)性分析Fig.9 Analysis of correlation between significantly enriched microorganisms in the 14% WBR group at the species level and host colonic mucosal gene, serum immunoglobulin, and SIgA

2.5.3 KEGG注釋揭示梅山豬Basal組和14% WBR組之間與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)代謝通路的差異 為研究Basal組和14% WBR組梅山豬的結(jié)腸微生物變化所產(chǎn)生的不同功能,將宏基因組數(shù)據(jù)與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋,圖10發(fā)現(xiàn)14% WBR組IgA產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)功能通路(intestinal immune network for IgA production)的相對(duì)豐度顯著高于Basal組(P<0.05)。該結(jié)果表明14%麩皮替代基礎(chǔ)日糧飼喂梅山豬引起改變的結(jié)腸微生物,具有增強(qiáng)結(jié)腸產(chǎn)生IgA的功能。

圖10 Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析Basal組和14% WBR組KEGG代謝通路的差異Fig.10 Difference of KEGG metabolic pathway between Basal group and 14% WBR group analyzed by Wilcoxon rank sum test

3 討 論

在開展中、西方豬對(duì)比試驗(yàn)中,目前沒有一個(gè)日糧配方能同時(shí)滿足脂肪型梅山豬和瘦肉型大白豬兩個(gè)不同類型豬種的能量需求?？紤]到本研究是以梅山豬為試驗(yàn)豬,分析日糧纖維水平對(duì)梅山豬血液和腸道免疫指標(biāo)的影響及其機(jī)理,大白豬作為對(duì)照組,因此試驗(yàn)設(shè)計(jì)以滿足梅山豬能量需求為主,按豬營(yíng)養(yǎng)需要(GB/T 39235—2020)中脂肪型生長(zhǎng)肥育豬相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行基礎(chǔ)日糧的配制。同時(shí),考慮到(GB/T 39235—2020)中脂肪型生長(zhǎng)肥育豬相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)日糧中能量低于大白豬的需求,試驗(yàn)中安排豬自由采食,通過采食量來彌補(bǔ)能量不足問題。Hakansson等[17]和Ramaekers等[18]的研究中發(fā)現(xiàn),自由采食的飼喂方式能讓動(dòng)物通過采食量補(bǔ)充能量攝入。最后,本試驗(yàn)期間大白豬的生長(zhǎng)性能正常,基礎(chǔ)日糧下,大白豬的日增重是826.44 g·d-1,采食量是3.05 kg·d-1(數(shù)據(jù)來自本團(tuán)隊(duì)另外一篇投稿文章,尚未發(fā)表),與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)接近[19-21],綜合反映了通過自由采食可以彌補(bǔ)大白豬能值攝入不足的問題,也間接證明了本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的合理性。

血常規(guī)和血生化指標(biāo)在很大程度上反映動(dòng)物機(jī)體的健康狀況[22]。本試驗(yàn)中,梅山豬和大白豬的血常規(guī)和血生化的所有指標(biāo)都在正常范圍內(nèi),同時(shí),在飼養(yǎng)過程中所有豬只均無腹瀉和明顯異常,表明全部試驗(yàn)豬總體處于健康狀態(tài)。嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞是在骨髓中發(fā)育成熟,都屬于白細(xì)胞的組成部分,它們?cè)谘褐械臄?shù)量變化可以反映機(jī)體的炎癥狀態(tài)[23]。研究發(fā)現(xiàn),機(jī)體嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)的升高與過敏和傳染病等疾病相關(guān),且與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[24]。也有研究表明,嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞主要在發(fā)生炎癥的器官和組織內(nèi)被招募,同時(shí)被激活釋放大量的炎癥介質(zhì)[25]。本研究發(fā)現(xiàn),隨日糧中麩皮替代比例的增加降低了梅山豬血液中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞百分比和嗜堿性粒細(xì)胞數(shù),該結(jié)果表明日糧中添加麩皮降低了梅山豬機(jī)體的炎癥水平。

血清球蛋白是機(jī)體除血清白蛋白外所有蛋白質(zhì)的總稱,血清球蛋白水平升高的主要原因是血清免疫球蛋白水平的升高[26]。本研究比較了梅山豬和大白豬的血清球蛋白濃度,發(fā)現(xiàn)Basal組、7%和10.5% WBR組沒有顯著差異,但14% WBR組梅山豬的血清球蛋白顯著高于大白豬。為研究14%的麩皮替代基礎(chǔ)日糧是否增加梅山豬的血清免疫球蛋白水平,本研究測(cè)定了梅山豬血清中免疫球蛋白的濃度。血清免疫球蛋白是體液免疫的主要組成部分,是反映機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo),包括IgG、IgA、IgM、IgD和IgE[27]。IgG是血清抗體的主要組成部分,是機(jī)體抗感染的“主力軍”,參與各項(xiàng)免疫防御機(jī)制;IgA的含量?jī)H次于IgG,主要發(fā)揮局部免疫作用;IgM是機(jī)體最早合成和分泌的抗體,也是機(jī)體初次應(yīng)答最早出現(xiàn)的抗體[28-29]。He等[10]研究表明,在日糧中補(bǔ)充發(fā)酵麥麩可顯著提高生長(zhǎng)育肥豬血清IgM和IgG的水平。Shang等[30]也報(bào)道基礎(chǔ)日糧中添加麥麩顯著增加了豬血清中IgG、IgA和IgM的濃度。本研究發(fā)現(xiàn)隨日糧麩皮替代水平的升高,梅山豬的血清IgM和IgG以及大白豬的血清IgM濃度顯著增加,與前人的研究結(jié)果類似。本研究進(jìn)一步比較了梅山豬和大白豬品種間的血清IgG濃度,發(fā)現(xiàn)14% WBR組梅山豬顯著高于大白豬,該結(jié)果表明麥麩替代部分基礎(chǔ)日糧改善了梅山豬和大白豬的體液免疫,且日糧麩皮對(duì)梅山豬免疫力的增強(qiáng)優(yōu)于大白豬。

單胃動(dòng)物的大腸是消化纖維的主要場(chǎng)所[31],因此后腸的健康對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能和整體健康至關(guān)重要[32]。腸道黏膜由腸上皮、腸相關(guān)淋巴組織和覆蓋在上皮的黏液組成,在維持腸道屏障保護(hù)中起重要作用[33]。IgA是黏膜免疫系統(tǒng)中含量最多的抗體,是組成SIgA的二聚體IgA的單體,絕大多數(shù)SIgA由腸道產(chǎn)生,并在原位產(chǎn)生效應(yīng)[34]。SIgA類抗體構(gòu)成了抗原特異性免疫防御的第一道防線,能維持腸道共生微生物之間的平衡,防止黏膜表面的病原體進(jìn)入機(jī)體及促進(jìn)腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)[34-35]。在本試驗(yàn)中,14%的麩皮顯著增加了梅山豬結(jié)腸黏膜的SIgA濃度,大白豬的沒有顯著變化,表明14%的麩皮日糧增強(qiáng)了梅山豬結(jié)腸的黏膜免疫力。Dong等[16]報(bào)道與外種豬相比,梅山豬擁有更強(qiáng)的腸道屏障功能,這可能是梅山豬能在短時(shí)間內(nèi)提高腸道免疫系統(tǒng)適應(yīng)日糧中纖維增加的原因。為了探究日糧纖維對(duì)梅山豬結(jié)腸黏膜免疫的影響,本研究利用轉(zhuǎn)錄組和宏基因組測(cè)序技術(shù)從宿主結(jié)腸黏膜基因和腸道微生物兩個(gè)層面進(jìn)行機(jī)制解析。通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在梅山豬Basal組和14% WBR組鑒別到38個(gè)結(jié)腸黏膜差異表達(dá)基因,對(duì)這38個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG功能富集。在GO的三個(gè)功能層面富集中,細(xì)胞組分(CC)和生物過程(BP)富集的功能條目最多,主要與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(細(xì)胞外泌體(extracellular exosome))、細(xì)胞增殖(細(xì)胞群增殖的調(diào)節(jié)(regulation of cell population proliferation))和免疫系統(tǒng)(免疫反應(yīng)(immune response))等相關(guān),表明麩皮主要通過調(diào)控梅山豬腸上皮細(xì)胞的增殖影響腸道免疫。在KEGG富集中,顯著富集到5條與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的代謝通路:細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互作用信號(hào)通路、病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、原發(fā)性免疫缺陷信號(hào)通路及IgA產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)信號(hào)通路,該結(jié)果進(jìn)一步證明麩皮對(duì)梅山豬結(jié)腸黏膜免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。其中,IgA產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)信號(hào)通路是參與調(diào)控SIgA產(chǎn)生的通路。CCR9是腸道黏膜趨化因子受體,對(duì)于腸道黏膜免疫的發(fā)展和維持有重要作用[36],并且參與刺激“IgA產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)信號(hào)”通路中IgA+B細(xì)胞的腸道歸巢,IgA+B細(xì)胞最終在腸道固有層分化形成能產(chǎn)生IgA的漿細(xì)胞[37]。CD4分子是主要表達(dá)于T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表面的一種單鏈跨膜糖蛋白[38],在免疫應(yīng)答中具有增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞與靶細(xì)胞結(jié)合、促進(jìn)T細(xì)胞激活啟動(dòng)免疫應(yīng)答和作為T淋巴細(xì)胞表面的標(biāo)記性糖蛋白輔助產(chǎn)生記憶細(xì)胞的功能[39-40]。本研究中,14%的麩皮顯著上調(diào)了梅山豬結(jié)腸黏膜與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的基因CD4和CCR9的表達(dá),該結(jié)果暗示14%的麩皮改善了梅山豬結(jié)腸的黏膜免疫,并且通過上調(diào)參與“IgA產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)信號(hào)通路”中的CCR9基因,產(chǎn)生更高水平的SIgA,增強(qiáng)了結(jié)腸黏膜免疫屏障,促進(jìn)腸道健康。

宿主免疫系統(tǒng)和腸道微生物之間的相互作用非常重要,宿主免疫系統(tǒng)可以調(diào)節(jié)腸道微生物的結(jié)構(gòu)和組成[41],同時(shí)腸道微生物也能影響?zhàn)つっ庖呦到y(tǒng)的發(fā)育和功能[42]。本研究中發(fā)現(xiàn)梅山豬結(jié)腸微生物相對(duì)豐度最高的兩個(gè)門水平微生物是Firmicutes和Bacteroidetes,與Xu等[43]在梅山后備母豬和Jiang等[44]在梅山斷奶仔豬中的研究一致。Firmicutes和Bacteroidetes代表了健康胃腸道中的兩個(gè)主要門[45-46],在腸道微生物發(fā)酵和維持微生態(tài)平衡中起著重要作用。在屬水平,梅山豬結(jié)腸的優(yōu)勢(shì)菌屬為Prevotella、unclassified_o_Clostridiales、Clostridium和Treponema等,與前人的研究基本一致[43]。Basal組和14% WBR組梅山豬的結(jié)腸微生物進(jìn)行LEFSe分析,Sutterellasp.、Clostridiumsp.CAG:138、Clostridiumsp.CAG:762、Nitrospirasp.和Desulfurellalesbacterium5個(gè)種水平微生物在14% WBR組顯著富集。其中Sutterellasp.是革蘭陰性菌,具有調(diào)節(jié)黏膜代謝和腸道上皮完整性的功能,并且能起到免疫調(diào)節(jié)的作用[47]。Clostridium是革蘭陽(yáng)性厭氧菌,具有多種代謝功能,包括將淀粉、蛋白質(zhì)和嘌呤轉(zhuǎn)化為乙酸、丁酸和乳酸等對(duì)機(jī)體健康有益的有機(jī)酸[48]。研究發(fā)現(xiàn),腸腔中的Clostridium能通過誘導(dǎo)結(jié)腸黏膜的調(diào)節(jié)性T Cell維持免疫穩(wěn)態(tài),屬于Clostridium的簇IV和XIVa也與維持黏膜穩(wěn)態(tài)和預(yù)防炎癥性腸病相關(guān)[49]。Clostridiumsp.CAG:138和Clostridiumsp.CAG:762都屬于Clostridium,但這兩個(gè)菌株的功能還沒有明確的報(bào)道。Nitrospirasp.屬于Nitrospira,后者通常作為硝化細(xì)菌,發(fā)揮的主要作用是參與氮循環(huán)及將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽,主要在污水處理[50]和生態(tài)系統(tǒng)[51]中研究較多,與免疫功能相關(guān)的研究鮮有報(bào)道。種水平差異微生物和篩選出的調(diào)控SIgA產(chǎn)生的2個(gè)候選宿主結(jié)腸黏膜差異表達(dá)基因(CD4和CCR9)的互作分析發(fā)現(xiàn)腸道微生物和調(diào)控SIgA產(chǎn)生的宿主結(jié)腸黏膜基因之間不存在直接互作關(guān)系,但Sutterellasp.、Clostridiumsp.CAG:138、Clostridiumsp.CAG:762和Nitrospirasp.與血清IgG呈顯著正相關(guān),Clostridiumsp.CAG:138和Nitrospirasp.與結(jié)腸黏膜SIgA呈顯著正相關(guān)。同時(shí)KEGG功能注釋結(jié)果發(fā)現(xiàn)14% WBR組IgA產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)功能通路的相對(duì)豐度顯著高于Basal組。該結(jié)果表明,14%的麩皮優(yōu)化了梅山豬的結(jié)腸菌群結(jié)構(gòu),增強(qiáng)微生物產(chǎn)生IgA的功能,促進(jìn)結(jié)腸健康。

4 結(jié) 論

4.1日糧中添加麩皮可以降低梅山豬機(jī)體的炎癥水平和增強(qiáng)體液免疫,并且添加14%的麩皮對(duì)梅山豬的促進(jìn)效果優(yōu)于大白豬。

4.2日糧中添加14%的麩皮上調(diào)了調(diào)控SIgA產(chǎn)生的2個(gè)候選結(jié)腸黏膜基因CD4和CCR9的表達(dá),增強(qiáng)梅山豬IgA產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)功能通路,提高腸腔SIgA的水平,有助于改善腸道屏障功能,促進(jìn)機(jī)體健康。

4.3日糧中添加14%的麩皮優(yōu)化了梅山豬的腸道菌群結(jié)構(gòu),Sutterellasp.、Clostridiumsp.CAG:138、Clostridiumsp.CAG:762和Nitrospirasp.可能是增強(qiáng)梅山豬免疫功能的重要菌株。