楊安琪,李嘉誠(chéng),宋 穎,陳 欣,靳榮帥,趙博昊,吳信生,陳 陽(yáng)

(揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,揚(yáng)州 225009)

顆粒細(xì)胞(granulosa cells,GCs)對(duì)卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)與成熟起著重要的調(diào)節(jié)作用,GCs參與維持成熟分裂的阻斷和誘導(dǎo)排卵,調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞成熟分裂[1-3]。在所有哺乳動(dòng)物中,GCs的增殖率會(huì)隨著卵泡大小的變化而改變[3]。在原始卵泡中,GCs增殖率低,但隨著卵泡腔的生長(zhǎng)和卵泡的增大,細(xì)胞由分裂逐步向分化轉(zhuǎn)變,限制了正在分化的GCs增殖[3]。GCs的增殖和凋亡受到許多基因的控制。SMAD7基因抑制山羊卵巢顆粒細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其凋亡[4]。IGF1R基因表達(dá)下調(diào),使AKT /mTOR信號(hào)通路下調(diào),進(jìn)而抑制卵巢GCs增殖及促進(jìn)其凋亡[5]。抑制WNT5a基因的表達(dá),使BAX/BCL-2的比值上調(diào),從而調(diào)控Wnt/β-Catenin通路來(lái)抑制卵巢GCs的增殖及促進(jìn)凋亡[6]。外源BMP6對(duì)雞卵泡GCs體外增殖有顯著影響[7]。在母兔卵巢卵泡發(fā)育過(guò)程中,哪些因子發(fā)揮了重要作用,還有待進(jìn)一步挖掘。

芳香化酶(aromatase, CYP19)是細(xì)胞色素P450酶系中的一種,P450芳香化酶(cytochrome P450, family 19, subfamily A, polypeptide 1,CYP19A1)是芳香化酶的編碼基因。研究發(fā)現(xiàn),CYP19A1是豬卵巢GCs中的抗凋亡因子,也是豬卵巢GCs中雌二醇(E2)合成必需的[8]。牦牛卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)成熟過(guò)程中CYP19A1上調(diào)內(nèi)源性E2水平,使早期卵母細(xì)胞的發(fā)育水平得到提升[9]。GCs中CYP19A1 mRNA水平與E2水平呈正比例關(guān)系,在一定范圍內(nèi),CYP19A1 mRNA表達(dá)量越高,分泌的E2越多,說(shuō)明CYP19A1可以通過(guò)調(diào)控激素水平間接影響卵泡的發(fā)育,CYP19A1 mRNA表達(dá)量的變化與卵泡發(fā)育的數(shù)量密切相關(guān)[10]。而CYP19A1基因?qū)ν寐殉睪Cs增殖和凋亡的調(diào)控功能尚不明確。

課題組前期通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選了多個(gè)參與母兔繁殖周期調(diào)控的基因,其中關(guān)鍵差異表達(dá)基因CYP19A1在甾類激素生物合成、卵巢類固醇生成等信號(hào)通路中都有所富集,由此推測(cè)CYP19A1可能對(duì)母兔繁殖周期的調(diào)控也起著重要的作用[11-13]。本研究計(jì)劃克隆CYP19A1基因,利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和理化性能。進(jìn)一步分離并鑒定兔卵巢GCs,構(gòu)建pcDNA3.1-CYP19A1過(guò)表達(dá)載體和siRNA,分別轉(zhuǎn)染卵巢GCs,以探究CYP19A1對(duì)GCs增殖和凋亡的影響,以及對(duì)類固醇激素合成相關(guān)基因表達(dá)的影響,為進(jìn)一步了解母兔卵泡發(fā)育和繁殖周期調(diào)控的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 卵巢GCs的分離和培養(yǎng)

采集8月齡健康新西蘭白兔母兔的卵巢,置于含有DMEM培養(yǎng)基的無(wú)菌培養(yǎng)皿中,刺破卵泡,使GCs釋放到培養(yǎng)基中。將GCs混合液過(guò)濾、低速離心后棄上清液。加入2 mL紅細(xì)胞裂解液,輕吹混勻后裂解5 min,再次放入離心機(jī)低速離心后棄去上清液。加入含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM-F12,制成細(xì)胞懸液后接種到6孔板中,在5% CO2,37 ℃的條件下培養(yǎng)。

1.2 卵巢GCs的鑒定

原代GCs培養(yǎng)24 h后,用4%多聚甲醛固定液在室溫下固定30 min,再用0.3% TritonX-100處理60 min,每步完成后都需要用PBS洗3次。1% BSA室溫封閉60 min,棄去封閉液后向其中加入一抗(anti-FSHR,1∶250),在4 ℃環(huán)境下培養(yǎng)過(guò)夜。過(guò)夜后用PBST漂洗3次,加入1∶2 000稀釋過(guò)后的山羊抗兔IgG(FITC)二抗,在37 ℃孵育60 min。PBST漂洗3次,滴加DAPI,在室溫下染色10 min后,用熒光顯微鏡觀察顯色,拍照保存。

1.3 pcDNA3.1-CYP19A1質(zhì)粒構(gòu)建

以pcDNA3.1(+)質(zhì)粒作為載體,使用CE Design軟件設(shè)計(jì)一步克隆引物,構(gòu)建CYP19A1的真核表達(dá)載體。在上游引物中加入XbaⅠ酶切位點(diǎn)和上游載體末端同源序列,在下游引物中加入EcoR Ⅴ酶切位點(diǎn)和下游載體末端同源序列(表1)。使用XbaⅠ酶和EcoR Ⅴ酶對(duì)pcDNA3.1(+)載體進(jìn)行雙酶切,瓊脂糖凝膠回收。使用重組酶Exane?Ⅱ把CYP19A1 CDS擴(kuò)增產(chǎn)物和雙酶切后的pcDNA3.1(+)載體連接。轉(zhuǎn)化后,測(cè)序,進(jìn)行無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提。

表1 兔CYP11A1克隆的引物序列

1.4 siRNA的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)兔CYP19A1序列設(shè)計(jì)出siRNA序列(表2),用于兔卵巢GCs的轉(zhuǎn)染。

表2 兔CYP19A1 siRNA序列信息

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

在24孔板中用DMEM-F12培養(yǎng)基對(duì)卵巢GCs進(jìn)行培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到70%左右時(shí)利用LipofectamineTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染,每組3個(gè)重復(fù)。8 h后棄去培養(yǎng)上清,在每個(gè)孔中加入500 μL DMEM-F12培養(yǎng)基,繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后,提取并保存細(xì)胞總RNA,用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.6 細(xì)胞增殖檢測(cè)

將轉(zhuǎn)染后的卵巢GCs接種到96孔板中,隨后每24 h檢測(cè)一次細(xì)胞的增殖水平。每次測(cè)定先加入10 μL CCK-8 Solution,混合均勻后放入培養(yǎng)箱共同培育,2 h后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光值,并做好相應(yīng)記錄。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

用Annexin V-FITC-PI試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的凋亡水平。轉(zhuǎn)染后的GCs培養(yǎng)48 h后用胰酶消化并收集,1 000 r·min-14 ℃離心5 min,棄去上清液;使用預(yù)冷過(guò)的PBS洗滌細(xì)胞2次,1 000 r·min-1、4 ℃離心5 min,棄上清液;加入100 μL Binding Buffer、5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI Staining Solution,每加入一種試劑都要吹打均勻后再加入下一種試劑;全部加入并混勻后在避光、室溫的環(huán)境下孵育10 min;加入400 μL Binding Buffer,輕輕混勻;染色完成后在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè),并使用軟件進(jìn)行分析,計(jì)算出細(xì)胞凋亡率。

1.8 細(xì)胞總RNA提取

收獲1×107～5×107GCs,加入1 mL Trizol,反復(fù)抽取混勻后室溫靜置5 min。加入200 μL 氯仿,劇烈振蕩25 s左右,靜置2 min。12 000 g 4 ℃離心15 min,小心吸取上清,加入500 μL異丙醇,搖勻后在室溫條件下靜置10 min。12 000 g 4 ℃離心10 min,棄去上清液,加入75%乙醇(冰冷)1 mL,振搖,充分洗滌沉淀。12 000 g 4 ℃離心5 min,棄上清,短暫離心,小心吸取棄上清。加入適量(20 μL)無(wú)酶水溶解,測(cè)定RNA濃度及純度,置-80 ℃保存。

1.9 熒光定量PCR

用NCBI Blast(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)網(wǎng)頁(yè)設(shè)計(jì)熒光定量引物,檢測(cè)與CYP19A1以及類固醇激素合成相關(guān)基因CYP1B1、CYP1A1、IGF1R、BMP6、CYP17A1的表達(dá)量,內(nèi)參基因選用GAPDH,引物詳細(xì)信息見(jiàn)表3。反應(yīng)體系20 μL:2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL,上游引物0.4 μL,下游引物0.4 μL,50×ROX Reference Dye2 0.4 μL,cDNA 1 μL,ddH2O 7.8 μL。反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性:95 ℃ 30 s;循環(huán)反應(yīng):95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s(循環(huán)40次);熔解曲線采集:95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s。

表3 熒光定量引物信息

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

采用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),用2-ΔΔct法處理熒光定量結(jié)果,用SPSS 25.0成對(duì)T檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析,最后使用GraphPad prism 8繪圖。*為差異顯著(P<0.05),**為差異極顯著(P<0.01)。

2 結(jié) 果

2.1 CYP19A1基因克隆和過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

提取GCs總RNA,以cDNA為模板,擴(kuò)增出CYP19A1基因1 500 bp左右的片段(圖1A)。經(jīng)比對(duì),CYP19A1基因序列全長(zhǎng)1 512 bp,序列同源性高達(dá)99%。進(jìn)一步構(gòu)建了pcDNA3.1-CYP19A1質(zhì)粒,載體經(jīng)XbaⅠ酶和EcoR Ⅴ雙酶切后的載體片段與插入片段大小符合預(yù)期(圖1B)。

A.CYP19A1擴(kuò)增電泳圖;B.雙酶切電泳圖A. CYP19A1 amplification electrophoresis figure; B. Double enzyme digestion electrophoresis figure圖1 CYP19A1擴(kuò)增及雙酶切電泳結(jié)果圖Fig.1 Plots of CYP19A1 amplification and double enzyme digestion electrophoresis

2.2 CYP19A1氨基酸序列的預(yù)測(cè)分析

經(jīng)ExPASy ProtParam預(yù)測(cè),CYP19A1為穩(wěn)定的親水性蛋白(圖2A),其蛋白分子式為C2599H4114N672O711S39,不穩(wěn)定系數(shù)為37.24,親水性平均值為0.088。使用SOPMA和SWISS-MODEL預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),CYP19A1二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和無(wú)規(guī)卷曲構(gòu)成(圖2B),三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表現(xiàn)為彎曲螺旋狀(圖2C)。STRING預(yù)測(cè)其互作蛋白質(zhì)主要有HSD17B1、HSD17B2、HSD17B3、CYP1A1、SULT1E1、SRD5A2和SRD5A1等蛋白(圖2D)。

利用NetPhos預(yù)測(cè),CYP11A1蛋白有31個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)(圖2E)。經(jīng)過(guò)PSORT Ⅱ Prediction亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析,發(fā)現(xiàn)CYP19A1蛋白主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上(圖2F)。共編碼503個(gè)氨基酸,其中亮氨酸(Leu)含量最多,占比10.1%,色氨酸(Trp)含量最少,所占比例為1.2%(表4)。CDD database預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),CYP19A1蛋白含有一個(gè)結(jié)構(gòu)域,屬于P450家族(圖2H)。

表4 兔CYP19A1蛋白氨基酸組成

通過(guò)MEGA11軟件將人(Homosapiens)、北美鼠兔(Ochotonaprinceps)、牛(Bostaurus)等9個(gè)物種的CYP19A1蛋白序列與兔進(jìn)行同源性對(duì)比,發(fā)現(xiàn)兔與北美鼠兔聚類為一支(圖2G)。

2.3 兔卵巢GCs分離培養(yǎng)和鑒定

卵巢GCs為貼壁細(xì)胞,細(xì)胞培養(yǎng)8～12 h后即可貼壁生長(zhǎng),形態(tài)為不規(guī)則的多邊形或梭形。利用FSHR在GCs細(xì)胞膜特異性表達(dá)的特點(diǎn),對(duì)分離的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色。本試驗(yàn)中細(xì)胞膜呈綠色熒光(圖略),證實(shí)獲得的細(xì)胞為GCs。

2.4 CYP19A1基因過(guò)表達(dá)和干擾對(duì)類固醇激素合成相關(guān)基因的影響

在GCs中,對(duì)CYP19A1進(jìn)行過(guò)表達(dá)和干擾,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)IGF1R、CYP1B1、CYP1A1、BMP6、CYP17A1基因的表達(dá)量。發(fā)現(xiàn)CYP19A1過(guò)表達(dá)極顯著提高了IGF1R、CYP1B1、CYP1A1的表達(dá)量,BMP6、CYP17A1表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)(圖3A和3B)。與siRNA-NC相比,3個(gè)siRNA均抑制了CYP19A1的表達(dá),以siRNA-2效果最顯著(圖3C)。進(jìn)一步進(jìn)行干擾試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)IGF1R、CYP1B1、CYP1A1基因的表達(dá)量均顯著下降(P<0.05或P<0.01),BMP6和CYP17A1的表達(dá)量均極顯著增加(P<0.01)(圖3D)。結(jié)果說(shuō)明CYP19A1可調(diào)控類固醇激素合成相關(guān)基因的表達(dá)。

A.CYP19A1過(guò)表達(dá)效果分析;B.CYP19A1過(guò)表達(dá)對(duì)類固醇激素合成相關(guān)基因表達(dá)的影響;C.CYP19A1干擾效果分析;D.CYP19A1干擾對(duì)類固醇激素合成相關(guān)基因表達(dá)的影響。*.P<0.05;**.P<0.01,下同A.Analysis of CYP19A1 overexpression effect;B.Effects of CYP19A1 overexpression on the expression of genes related to steroid hormone synthesis;C.Analysis of interference effect of CYP19A1;D.Effects of CYP19A1 interference on the expression of genes related to steroid hormone synthesis. *. P<0.05; ** .P<0.01, the figure below is the same圖3 過(guò)表達(dá)和干擾CYP19A1對(duì)類固醇激素合成相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.3 Effects of overexpression and interference with CYP19A1 on the expression of genes related to steroid hormone synthesis

2.5 CYP19A1基因過(guò)表達(dá)和干擾對(duì)卵巢GCs增殖和凋亡的影響

過(guò)表達(dá)和干擾CYP19A1基因,利用CCK8法和FITC/PI法檢測(cè)GCs的增殖和凋亡情況。結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)CYP19A1基因24 h后顯著提高了GCs的增殖水平,相反,干擾CYP19A1基因24 h后顯著降低了GCs的增殖水平(P<0.01)(圖4A)。進(jìn)一步過(guò)表達(dá)CYP19A1基因顯著抑制了GCs的凋亡,反之干擾CYP19A1基因則顯著加快了GCs的凋亡(P<0.01)(圖4B)。由此可得CYP19A1基因可以促進(jìn)GCs增殖,抑制GCs凋亡。

A.CYP19A1表達(dá)量變化對(duì)GCs增殖的影響;B.CYP19A1表達(dá)量變化對(duì)GCs凋亡的影響A. Effects of CYP19A1 expression changes on the proliferation of GCs; B. Effect of CYP19A1 expression changes on apoptosis of GCs圖4 過(guò)表達(dá)和干擾CYP19A1對(duì)卵巢GCs增殖和凋亡的影響Fig.4 Effects of overexpression and interference with CYP19A1 on proliferation and apoptosis of ovarian GCs

3 討 論

CYP19A1屬于細(xì)胞色素P450超家族,在正常發(fā)育的卵泡GCs中表達(dá)量較高,是催化睪酮轉(zhuǎn)化為雌二醇的關(guān)鍵酶[14-15]。雌激素能夠促進(jìn)有腔卵泡的快速發(fā)育和成熟,在卵泡發(fā)育過(guò)程中起重要作用,是調(diào)控哺乳動(dòng)物進(jìn)入發(fā)情期的主要激素[16-17]。課題組前期研究結(jié)果證實(shí)了CYP19A1參與母兔發(fā)情周期調(diào)控。本研究克隆了兔的CYP19A1基因,經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)CYP19A1蛋白為穩(wěn)定親水性蛋白,進(jìn)化樹(shù)分析確定其是一個(gè)十分保守的基因。

進(jìn)一步為探究CYP19A1基因調(diào)控母兔發(fā)情周期的分子機(jī)制,構(gòu)建了CYP19A1的過(guò)表達(dá)載體和干擾序列。經(jīng)轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)CYP19A1可使IGF1R、CYP1B1和CYP1A1的表達(dá)量增加,BMP6和CYP17A1的表達(dá)量減少,經(jīng)干擾后,上述基因表達(dá)量的變化趨勢(shì)與過(guò)表達(dá)結(jié)果均相反,符合預(yù)期。已知雌激素是影響動(dòng)物發(fā)情的重要因素[18],CYP1B1、CYP1A1與CYP19A1一樣,同為細(xì)胞色素P450家族成員,可影響雌激素的氧化代謝[19-20]。CYP1A1有4個(gè)位點(diǎn)具有多態(tài)性,其基因多態(tài)性可影響酶的表達(dá)量和活性,從而調(diào)控雌激素的體內(nèi)代謝[21-22]。在發(fā)情前期CYP1B1的表達(dá)水平明顯上升[23]。推測(cè)CYP19A1與CYP1A1、CYP1B1可能存在協(xié)同作用,通過(guò)共同調(diào)控體內(nèi)雌激素水平,間接影響動(dòng)物的發(fā)情周期。雌激素受體(ER)是介導(dǎo)雌激素發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的重要受體,與CYP19A1的表達(dá)量呈正相關(guān),ER與IGF1受體(IGF1R)的表達(dá)量也呈正相關(guān),由此推測(cè)CYP19A1能夠通過(guò)影響ER的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控IGF1R的表達(dá)量[24-25]。CYP17A1為雄激素合成限速酶,其不僅能夠調(diào)控雄激素的合成,也有調(diào)控GCs合成孕酮的功能,影響著卵泡生長(zhǎng)發(fā)育直至排卵的全過(guò)程[26-27]。CYP19A1的主要功能是促進(jìn)雌激素合成,推斷CYP19A1是通過(guò)降低CYP17A1的表達(dá)量來(lái)抑制雄激素和孕酮的合成,從而促進(jìn)雌激素的合成。BMP6屬于BMPs(骨形態(tài)發(fā)生蛋白)家族的一員,BMP屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β(transforming growth factor-β)超家族[28-29],BMPs家族在卵泡發(fā)生的各階段均發(fā)揮著重要作用[30-32]。在哺乳動(dòng)物中,BMP-15、BMP7在原始卵泡的激活及卵泡的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用,而B(niǎo)MP6的表達(dá)缺失對(duì)優(yōu)勢(shì)卵泡的選擇具有較大影響[33-35]。BMP6和BMP7的共同作用會(huì)降低GCs的E2合成量[36]。BMP6還可以促進(jìn)母雞前卵泡顆粒細(xì)胞中的促卵泡生成素(FSH)受體mRNA的表達(dá)[37]。此外,BMP6能夠通過(guò)上調(diào)限速酶CYP19A1的表達(dá)來(lái)促進(jìn)E2和P4的分泌[38]。本研究中,CYP19A1過(guò)表達(dá)后,極顯著抑制了BMP6表達(dá),推測(cè)可能存在負(fù)反饋機(jī)制,但仍需要進(jìn)一步探索。綜上,提示CYP19A1可能通過(guò)調(diào)控類固醇激素合成相關(guān)基因的表達(dá),參與母兔卵泡的發(fā)育。

本研究發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)CYP19A1可促進(jìn)GCs增殖、抑制GCs凋亡,而干擾其表達(dá)則會(huì)抑制GCs增殖,促進(jìn)GCs凋亡。有研究證實(shí),CYP19A1可催化雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素,而雌激素中E2最具生物活性,可促進(jìn)卵巢GCs增殖和卵泡分化[39-40]。為后期深入探究CYP19A1調(diào)控GCs增殖和凋亡的途徑提供了思路。綜上所述,CYP19A1在兔卵泡發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,并可能通過(guò)調(diào)控類固醇激素合成相關(guān)基因的表達(dá),影響GCs增殖和凋亡,參與母兔的發(fā)情周期。

4 結(jié) 論

CYP19A1蛋白是一種穩(wěn)定的親水性蛋白,與其它物種同源性較高。CYP19A1基因可以促進(jìn)GCs增殖,抑制GCs凋亡,調(diào)控類固醇激素合成相關(guān)基因的表達(dá),進(jìn)而參與母兔卵巢卵泡發(fā)育。