張 力,許加龍,黃錦鈺,許子月,雷昕諾,盧會(huì)鵬,朱 睿,孫偉翔,曹海月,王安平,朱善元*

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇現(xiàn)代畜牧與新獸藥工程技術(shù)中心,泰州 225300;2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院,泰州 225300;3.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院,南京 210093)

隨著生活水平的提高,人們對(duì)家畜肉品質(zhì)的要求也日益提高。鵝肉是理想的高蛋白、低脂肪和低膽固醇的營養(yǎng)食品,早在2002年,聯(lián)合國糧農(nóng)組織就將鵝肉列為21世紀(jì)重點(diǎn)發(fā)展的健康產(chǎn)品之一[1]。中國是肉鵝最大的消費(fèi)國和出口國,鵝肉深受消費(fèi)者青睞,因而開展鵝產(chǎn)肉性能品種改良,發(fā)掘影響鵝肌肉生長的功能基因,探究鵝骨骼肌生長發(fā)育調(diào)控的分子機(jī)理,具有重大的經(jīng)濟(jì)效應(yīng)。

獲得具有高分化潛能的鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞是開展鵝肌肉組織生長發(fā)育調(diào)控機(jī)制研究的前提和基礎(chǔ)。骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞來源于肌肉中的一部分成肌祖細(xì)胞,這些細(xì)胞在出生后個(gè)體的肌肉組織中保留未分化狀態(tài),位于肌膜和基底膜之間,具有很強(qiáng)的分化潛能[2-3]。早在1961年,科學(xué)家就通過電子顯微鏡觀察青蛙骨骼肌肌纖維外圍區(qū)域發(fā)現(xiàn)了肌源性衛(wèi)星細(xì)胞[4]。1974年,首次從成年大鼠骨骼肌中分離出衛(wèi)星細(xì)胞[5]。之后,人們通過不斷優(yōu)化分離方法,逐漸分離出人類[6-7]、牛[8-10]、羊[11]、雞[12]、豬[13-15]等不同物種的衛(wèi)星細(xì)胞。然而到目前為止,有關(guān)鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的研究很少,且現(xiàn)有方法分離得到的細(xì)胞分化能力有限[16]。

經(jīng)過多年的發(fā)展,目前常用于分離衛(wèi)星細(xì)胞的方法有單根肌纖維分離法和酶消化法。單根肌纖維法是利用I型膠原酶消化肌肉組織并溫和研磨,從肌肉組織中分離出單根肌纖維[17-18]。單根肌纖維法分離培養(yǎng)得到的衛(wèi)星細(xì)胞能夠達(dá)到95%以上的純度。但是,解剖單根肌纖維非常耗時(shí),因而此方法有較大局限性。為了能夠獲得大量衛(wèi)星細(xì)胞,研究人員開發(fā)了酶消化法。酶消化法利用單酶或者多種酶組合消化肌肉組織將衛(wèi)星細(xì)胞徹底釋放到消化液中。不同酶組合的消化效果不同,與其他方法相比,酶消化法耗時(shí)短,獲得衛(wèi)星細(xì)胞的產(chǎn)量高,但是通常分離得到細(xì)胞是衛(wèi)星細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等的混合細(xì)胞,如果想要得到較高純度的衛(wèi)星細(xì)胞,則需要進(jìn)一步純化。常用的純化方法有差速貼壁法、Percoll梯度離心法和流式細(xì)胞分選(FACS)等[19-21]。但是,已有分離方法分離得到的細(xì)胞普遍存在耗時(shí)長、細(xì)胞純度低和存活率低等問題,因此,建立一種簡便、高效的體外分離培養(yǎng)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的方法尤為重要。鑒于此,本研究對(duì)傳統(tǒng)分離細(xì)胞使用的酶和細(xì)胞生長培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化,以期獲得具有高度分化潛能的鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞,為研究鵝骨骼肌生長和發(fā)育調(diào)控機(jī)制提供細(xì)胞模型和材料支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

健康10周齡溆浦鵝仔鵝來自江蘇現(xiàn)代畜牧科技示范園(江蘇畜禽遺傳資源研究所)。

1.2 主要試劑和儀器

DMEM/F12高糖培養(yǎng)基(Hyclone);DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco);胎牛血清(FBS,Gemini);馬血清(HS,Gibco);青霉素鏈霉素混合液(索萊寶);磷酸鹽緩沖液(Gibco);分散酶Dispase II(Roche);膠原酶II(Sigma-Aldrich);0.25%胰蛋白酶(索萊寶);重組人堿性成纖維生長因子bFGF(PeproTech);基質(zhì)膠(BD Biosciences);4%多聚甲醛(索萊寶);鼠抗Pax7抗體(DSHB);鼠抗MyHC/MF20抗體(DSHB);鼠抗GAPDH抗體(翌圣);羊抗鼠594標(biāo)記二抗(索萊寶);總RNA抽提試劑(碧云天);反轉(zhuǎn)錄試劑(諾唯贊);定量試劑2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq plus(聚合美);RIPA蛋白裂解液(碧云天)。其它試劑均為國產(chǎn)優(yōu)質(zhì)分析純。所有PCR產(chǎn)物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

凈化工作實(shí)驗(yàn)臺(tái)(上海智城分析儀器制造有限公司),CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher),DYY-10C 型電泳儀(北京市六一儀器廠);Tanon 5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);QuantStudio 3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器(Applied Biosystems);Axio Vert A1倒置熒光顯微鏡(Zeiss)。

1.3 鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分離和培養(yǎng)

將10周齡溆浦鵝仔鵝麻醉后處死,75%酒精消毒腿部肌肉組織附近皮膚;剪下肌肉組織,用PBS緩沖液沖洗;用無菌剪刀將肌肉組織剪碎成肉糜狀;加入消化工作液(消化工作液是含有終濃度為2 mg·mL-1分散酶Dispase II和4 mg·mL-1膠原酶II的高糖DMEM培養(yǎng)基溶液,一般1 cm3的肌肉組織需要5～10 mL消化工作液),吹打混勻,并在37 ℃搖床上震蕩消化1 h;消化完成后,加入10 mL含有3% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基終止消化;消化液依次用100 μm和40 μm的細(xì)胞篩進(jìn)行過濾;細(xì)胞懸液1 500 r·min-1離心10 min,棄上層溶液;用3 mL紅細(xì)胞裂解液處理2 min,再加入5 mL DPBS,1 500 r·min-1離心5 min;棄上清,此時(shí)沉淀中包含大量分離得到的鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞,用5 mL骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞生長完全培養(yǎng)基(骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞生長完全培養(yǎng)基為含20% FBS,1%青霉素鏈霉素混合液,5 ng·mL-1bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基溶液)重懸細(xì)胞,輕柔吹打均勻,接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中,放入37 ℃,5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞純化與傳代培養(yǎng)

用生長完全培養(yǎng)基培養(yǎng)衛(wèi)星細(xì)胞。原代細(xì)胞培養(yǎng)時(shí),為促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞貼壁,培養(yǎng)過程中使用的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿均需使用基質(zhì)膠進(jìn)行包被處理(基質(zhì)膠包被液為基質(zhì)膠和DMEM按照1∶24比例混合的溶液)。同時(shí),為減少細(xì)胞損失,最初培養(yǎng)過程中不需要換液,每2 d需添加部分新的生長完全培養(yǎng)基。原代衛(wèi)星細(xì)胞在經(jīng)基質(zhì)膠包被后的培養(yǎng)皿中3～7 d匯合度達(dá)到80%～90%,此時(shí)可進(jìn)行傳代。首次傳代時(shí),通過差速貼壁法對(duì)衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行純化。消化后,收集細(xì)胞到15 mL離心管中,1 500 r·min-1離心5 min。用生長完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,轉(zhuǎn)移至未經(jīng)基質(zhì)膠包被處理的10 cm皿中,放入培養(yǎng)箱中靜置。1 h后,此時(shí)成纖維細(xì)胞已經(jīng)貼壁,衛(wèi)星細(xì)胞沒有貼壁,吸取10 cm皿中上層培養(yǎng)基到新的經(jīng)基質(zhì)膠包被好的10 cm皿中,以此除去成纖維細(xì)胞。

1.5 鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞誘導(dǎo)分化

取正常培養(yǎng)的細(xì)胞,待細(xì)胞匯合度達(dá)到90%以上時(shí),更換分化培養(yǎng)基(分化培養(yǎng)基為含2%馬血清的高糖DMEM培養(yǎng)基溶液),誘導(dǎo)分化1～7 d,觀察衛(wèi)星細(xì)胞的分化情況。

1.6 鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞免疫熒光鑒定

從培養(yǎng)箱中取出原代鵝衛(wèi)星細(xì)胞或誘導(dǎo)分化后的鵝肌管細(xì)胞,吸棄原培養(yǎng)基,加入PBS洗滌2次后用4%的多聚甲醛固定20 min;固定完成后,用PBS洗滌3次;向培養(yǎng)孔中加入免疫熒光封閉液,室溫封閉1 h;吸凈封閉液,加入Pax7、MyHC/MF20一抗(1∶100稀釋抗體),4 ℃孵育過夜;孵育完成后,用PBS洗滌3次。按照試驗(yàn)需求配制所需二抗;加入羊抗鼠594標(biāo)記二抗,避光室溫孵育1 h;PBS避光洗滌3次;避光將含DAPI抗淬滅封片液加入培養(yǎng)孔中,覆蓋細(xì)胞;避光4 ℃保存以待顯微鏡鏡檢。

1.7 鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞RT-PCR鑒定

分別收集誘導(dǎo)分化前(生長培養(yǎng)基,GM)和誘導(dǎo)分化后(分化培養(yǎng)基,DM)的細(xì)胞樣品,分化前、后每組均3個(gè)重復(fù)。采用Trizol法進(jìn)行總RNA的提取,用試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板,加入Pax7、MyoD1、MyoG、Gapdh基因上、下游引物進(jìn)行qRT-PCR,引物信息詳見表1;qRT-PCR 15 μL反應(yīng)體系:2.9 μL 2×SYBR Green Mix,上、下游引物各0.3 μL,4 μL稀釋后的cDNA,無酶水補(bǔ)齊至15 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 60 s;(95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s)40個(gè)循環(huán)。

表1 本研究所用的引物序列

1.8 鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞Western blotting驗(yàn)證

分別收集誘導(dǎo)分化前后的細(xì)胞樣品,利用添加1%PMSF的RIPA蛋白裂解液提取總蛋白。對(duì)蛋白進(jìn)行變性后,利用Western blotting分別檢測鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖期和分化期Pax7、MyHC的表達(dá)情況。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

qRT-PCR結(jié)果參照2-ΔΔCt方法來評(píng)估Pax7、MyoD1、MyoG的相對(duì)表達(dá)量,以Gapdh作為內(nèi)參基因進(jìn)行待測基因表達(dá)差異的檢測。結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”表示,采用SPSS軟件分析,組間差異性采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)的方法進(jìn)行比較,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離和鑒定

采集健康10周齡溆浦鵝仔鵝骨骼肌,利用分散酶Dispase Ⅱ和膠原酶Ⅱ消化處理,分離并通過差速貼壁法純化獲得骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。分離得到的原代衛(wèi)星細(xì)胞呈球形,體積較小,折光性強(qiáng)(圖1A,紅色箭頭)。用生長完全培養(yǎng)基培養(yǎng)衛(wèi)星細(xì)胞,經(jīng)12 h培養(yǎng)后細(xì)胞開始緩慢貼壁,呈中間彭起兩端針狀的梭形結(jié)構(gòu)(圖1A,黃色箭頭)。培養(yǎng)24 h后絕大多數(shù)衛(wèi)星細(xì)胞完全貼壁,呈紡錘形,貼壁后的衛(wèi)星細(xì)胞開始大量快速增殖(圖1B)。

A. 鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)12 h后形態(tài),比例尺=20 μm (20×);B. 衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間后顯微鏡下形態(tài),比例尺=200 μm (10×);C. Pax7免疫熒光染色鑒定,比例尺=200 μm (20×)A. Morphology of goose skeletal muscle satellite cells after 12 h culture, scale bar=20 μm (20×); B. Morphology of satellite cells under microscope after different time of culture, scale bar=200 μm (10×); C. Pax7 immunofluorescence staining identification, scale bar=200 μm (20×)圖1 鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定Fig.1 Isolation, culture and identification of goose skeletal muscle satellite cells

Pax7是衛(wèi)星細(xì)胞特異性標(biāo)志基因,經(jīng)免疫熒光鑒定,原代衛(wèi)星細(xì)胞高表達(dá)Pax7(圖1C)。另外,經(jīng)生長完全培養(yǎng)基培養(yǎng)后,分別提取其RNA和蛋白質(zhì),利用qRT-PCR和Western bloting檢測Pax7 mRNA和蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示培養(yǎng)的衛(wèi)星細(xì)胞依舊高表達(dá)Pax7。因此,本分離方法能夠獲得較高純度的鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞,以及該培養(yǎng)體系能夠維持衛(wèi)星細(xì)胞處于較高的未分化狀態(tài)。

2.2 鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化

在細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時(shí),進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在誘導(dǎo)第2天開始拉長、變大,且初顯小肌管。誘導(dǎo)第4天,開始有明顯的肌管形成。之后,這些肌管繼續(xù)融合形成成熟較大的肌管(圖2A)。此時(shí),結(jié)晶紫染色也顯示有大量成熟肌管生成(圖2B)。成熟的肌管能夠維持0.5～1 d,由于培養(yǎng)條件限制,之后逐漸脫落。

A. 衛(wèi)星細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中形態(tài)變化,比例尺=200 μm (10×);B. 衛(wèi)星細(xì)胞誘導(dǎo)分化后結(jié)晶紫染色,比例尺=200 μm(4×)A. Morphological changes of satellite cells during induced differentiation, scale bar=200 μm (10×); B. Crystal violet staining after differentiation of satellite cells, scale bar=200 μm (4×)圖2 鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞在誘導(dǎo)分化過程中的形態(tài)變化Fig.2 Morphological changes of goose skeletal muscle satellite cells after induced differentiation

肌球蛋白重鏈MyHC是肌纖維的組成型蛋白。利用MyHC標(biāo)記成熟肌管,免疫熒光染色結(jié)果顯示,分化后期,肌管與肌管融合形成縱橫的更大肌管,肌管中可能包含近百個(gè)細(xì)胞核(圖3)。此時(shí),細(xì)胞的分化指數(shù)(含有2個(gè)及以上細(xì)胞核的肌管中的細(xì)胞核數(shù)量/細(xì)胞核總數(shù))高達(dá)78% (圖4,P<0.01),說明分離得到的衛(wèi)星細(xì)胞體外具有高度分化的能力,保持較高的分化潛能。

圖3 鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞誘導(dǎo)分化第6天MyHC免疫熒光染色鑒定Fig.3 MyHC immunofluorescence staining identification of goose skeletal muscle satellite cells after 6 days induced differentiation

**. P<0.01,下同**. P<0.01, the same as below圖4 鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞誘導(dǎo)分化前后分化指數(shù)統(tǒng)計(jì)Fig.4 Statistics of differentiation index of goose skeletal muscle satellite cells before and after differentiation

2.3 鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞誘導(dǎo)分化前后分子水平變化

分別收集誘導(dǎo)分化前(GM)和誘導(dǎo)分化后(DM)的細(xì)胞樣品,提取RNA,反轉(zhuǎn)后通過qRT-PCR檢測其標(biāo)志基因Pax7、MyoD1、MyoG的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示,分化標(biāo)志基因MyoD1、MyoG的表達(dá)均在誘導(dǎo)分化后明顯升高,并且分化后MyoD1、MyoG的相對(duì)表達(dá)量分別是分化前的1.90和44.22倍,而分化前衛(wèi)星細(xì)胞標(biāo)志基因Pax7的相對(duì)表達(dá)量是分化后的2.22倍(圖5A,P<0.01)。另外,Western blotting檢測結(jié)果也顯示,經(jīng)誘導(dǎo)分化后,Pax7蛋白表達(dá)水平降低,而MyHC蛋白表達(dá)水平明顯升高(圖5B)。從分子水平上說明分離的衛(wèi)星細(xì)胞具有較強(qiáng)的分化潛力,可以作為后續(xù)試驗(yàn)的體外分化細(xì)胞模型。

A. 分化前后Pax7、MyoD1、MyoG的相對(duì)表達(dá)量;B. 分化前后Pax7和MyHC蛋白表達(dá)水平A. The relative expression of Pax7, MyoD1 and MyoG before and after differentiation; B. The proteins expression level of PAX7 and MyHC before and after differentiation圖5 鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞誘導(dǎo)分化前后基因表達(dá)變化情況Fig.5 Changes of gene expression in goose skeletal muscle satellite cells before and after differentiation

3 討 論

成體中骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞位于肌肉組織的肌膜和基底膜之間,保留未分化狀態(tài),具有很強(qiáng)的分化潛能。衛(wèi)星細(xì)胞的分化潛能也使其成為成體骨骼肌研究的重要細(xì)胞模型,用于肌肉組織形成和發(fā)育機(jī)制[22-25]、分子育種病理、損傷修復(fù)[2,26]、衰老及再生[27-28]等多方面的研究。

目前,人們已經(jīng)從小鼠[29]、牛[8-9]、豬[13-14]等哺乳動(dòng)物中分離出骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。由于年幼個(gè)體的衛(wèi)星細(xì)胞含量更豐富,所以對(duì)于哺乳動(dòng)物而言,通常選用低日齡動(dòng)物肌肉組織作為分離材料。而對(duì)于家禽而言,通常選用發(fā)育到一定胚齡的胚胎作為材料分選骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。例如,雞一般選用12胚齡左右的雞胚作為生物材料[30-31],鴨一般選用13胚齡左右的鴨胚作為生物材料[32],家鴿一般選用16胚齡左右的鴿胚作為生物材料[33]。但是對(duì)于鵝而言,目前關(guān)于鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的報(bào)道很少,沈龍仙等[16,34]選用10～15日齡鵝胚分離培養(yǎng)衛(wèi)星細(xì)胞。鵝胚取材繁瑣,而且相關(guān)研究甚少涉及對(duì)衛(wèi)星細(xì)胞分化能力的評(píng)估。在鵝衛(wèi)星細(xì)胞分離中,本研究未選用胚胎,而選用10周齡仔鵝的肌肉組織為試驗(yàn)材料,分離得到大量具有高度分化潛能的衛(wèi)星細(xì)胞,且細(xì)胞分化指數(shù)高達(dá)78%。與一定胚齡的鵝胚胎相比,仔鵝更易獲得且個(gè)體肌肉組織甚多,從而大大拓寬了鵝衛(wèi)星細(xì)胞分離的取材范圍。

大量的文獻(xiàn)報(bào)道顯示,目前實(shí)驗(yàn)室多采用多酶混合的方法分離骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。常用于分離衛(wèi)星細(xì)胞的酶包括膠原蛋白酶、鏈酶蛋白酶、胰蛋白酶、膠原酶等,不同酶聯(lián)合消化的時(shí)間不同,分離效果也存在較大差異,一些研究比較了不同酶的消化分離效果[35]。目前,比較成熟的衛(wèi)星細(xì)胞的分離以人、小鼠、豬為主,在禽類中尚無很好的衛(wèi)星細(xì)胞分離方法。本研究選擇膠原酶Ⅱ和分散酶Dispase II的混合液消化剪碎的骨骼肌組織1 h,以徹底將衛(wèi)星細(xì)胞釋放出來。膠原酶Ⅱ可以降解具有三股螺旋的膠原纖維,消化組織; Dispase Ⅱ作用溫和,對(duì)細(xì)胞損傷小。試驗(yàn)證實(shí),膠原酶Ⅱ (終濃度為4 mg·mL-1)和Dispase Ⅱ (終濃度為2 mg·mL-1)的組合及濃度的選擇能夠獲得大量具有活力的衛(wèi)星細(xì)胞。

與其他方法相比,酶消化法耗時(shí)短,獲得衛(wèi)星細(xì)胞的產(chǎn)量高,但是通常分離得到的細(xì)胞是衛(wèi)星細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等的混合細(xì)胞,如果想要得到較高純度的衛(wèi)星細(xì)胞,則需要進(jìn)一步純化。常用的純化方法有Percoll梯度離心法、流式細(xì)胞分選(FACS)和差速貼壁法等。Percoll不連續(xù)密度梯度離心法能獲得較純的衛(wèi)星細(xì)胞,但是由于多次離心造成細(xì)胞損失,因此所需初始細(xì)胞總量較大。流式細(xì)胞分選法操作復(fù)雜,成本高。尤其對(duì)于禽類來說,由于可用抗體缺乏,導(dǎo)致此方法很難實(shí)施。本研究選用差速貼壁法純化衛(wèi)星細(xì)胞,即在傳代時(shí)通過差速貼壁1 h對(duì)鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行純化,試驗(yàn)證明此方法能夠去除成纖維細(xì)胞的干擾,獲得高純度衛(wèi)星細(xì)胞。

生長培養(yǎng)基的選擇對(duì)于衛(wèi)星細(xì)胞分化能力的維持尤為重要。本研究選用含有20%FBS和添加bFGF (終濃度為5 ng·mL-1)的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。高血清濃度能夠促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞的增殖而抑制其分化。另外,研究證實(shí)bFGF在干細(xì)胞的體外培養(yǎng)過程中有利于維持干細(xì)胞的未分化狀態(tài),促進(jìn)細(xì)胞增殖[36]。體外誘導(dǎo)分化試驗(yàn)顯示可以形成多核的成熟大肌管,因而說明該生長培養(yǎng)基可以維持鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞保持較高的分化潛能,滿足后續(xù)的試驗(yàn)需求。

目前,通常采用免疫熒光標(biāo)記特異基因的方法鑒定衛(wèi)星細(xì)胞。正常生理狀態(tài)下,衛(wèi)星細(xì)胞處于靜止態(tài),此時(shí)細(xì)胞高表達(dá)標(biāo)志蛋白Pax7,在肌肉損傷或受到生長因子的刺激后,衛(wèi)星細(xì)胞被激活[37-38],激活后的衛(wèi)星細(xì)胞開始表達(dá)成肌調(diào)節(jié)因子MyoD和MyoG[39],分化為成肌細(xì)胞和肌細(xì)胞[40],進(jìn)而融合形成肌管,此時(shí)細(xì)胞高表達(dá)肌管標(biāo)志蛋白MyHC。如果在體內(nèi),肌管進(jìn)一步融合、成熟形成新的肌纖維。因此,本研究采用Pax7鑒定初步衛(wèi)星細(xì)胞的分離及純度,在后續(xù)的試驗(yàn)中,通過檢測MyoD、MyoG和MyHC等的表達(dá)變化,評(píng)估衛(wèi)星細(xì)胞的分化潛能,進(jìn)一步證實(shí)本研究分離的細(xì)胞是具有多潛能分化生物學(xué)特性的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。

4 結(jié) 論

本研究建立了膠原酶Ⅱ和分散酶Dispase II組合的混合酶分離鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的方法,并對(duì)細(xì)胞的生長完全培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化,實(shí)現(xiàn)在體外培養(yǎng)過程中維持衛(wèi)星細(xì)胞的高未分化狀態(tài),保持其巨大的分化潛能,為鵝肌肉組織生長發(fā)育、肉質(zhì)改良、藥理毒理試驗(yàn)、損傷修復(fù)等提供了良好的細(xì)胞模型及研究基礎(chǔ)。