張寅梁,岳巧嫻,黃晨軒,陳 輝,王德賀,周榮艷

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,保定 071001)

蛋雞在開(kāi)產(chǎn)后對(duì)鈣有較高的需求,在產(chǎn)蛋初期,蛋雞可利用性成熟前儲(chǔ)存積累的鈣和日糧中所攝入的鈣用于產(chǎn)蛋,而到了產(chǎn)蛋后期,蛋雞積累的鈣消耗殆盡,衰老導(dǎo)致蛋雞新陳代謝減慢使得機(jī)體處于缺鈣狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體鈣缺乏時(shí),則會(huì)分解皮質(zhì)骨為蛋殼形成提供鈣源進(jìn)而導(dǎo)致骨質(zhì)流失,并造成一定的骨骼損傷。而骨骼損傷(龍骨彎曲、骨質(zhì)疏松、骨折等)是威脅蛋雞動(dòng)物健康生產(chǎn)的一個(gè)重要問(wèn)題[1]。高強(qiáng)度的產(chǎn)蛋對(duì)蛋雞骨質(zhì)健康造成威脅[2],蛋雞骨骼健康既影響蛋雞福利,也影響產(chǎn)業(yè)發(fā)展[3]。隨著產(chǎn)蛋周齡增加,蛋殼質(zhì)量下降[4],是限制蛋雞超長(zhǎng)產(chǎn)蛋期(“蛋雞100周齡生產(chǎn)500個(gè)蛋”計(jì)劃)的主要問(wèn)題之一[5],這對(duì)實(shí)現(xiàn)蛋雞養(yǎng)殖業(yè)延長(zhǎng)產(chǎn)蛋期的目標(biāo)[6]是一重大挑戰(zhàn)。蛋雞骨骼健康與營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境和遺傳因素有關(guān)[7],因此研究蛋雞骨骼健康問(wèn)題對(duì)改善蛋雞的動(dòng)物福利和蛋雞產(chǎn)業(yè)發(fā)展有重要意義。

蛋雞的鈣沉積是骨代謝維持穩(wěn)態(tài)后的結(jié)果,當(dāng)參與骨代謝的破骨細(xì)胞骨吸收活動(dòng)增強(qiáng)或成骨細(xì)胞骨生成活動(dòng)減弱時(shí),原有平衡會(huì)被打破從而導(dǎo)致骨量逐漸減少[8]。骨代謝異常會(huì)威脅到蛋雞的骨骼健康[9-10],并對(duì)蛋殼質(zhì)量造成一定的影響[11]。骨是蛋雞生長(zhǎng)和生產(chǎn)的重要器官,因?yàn)樵诘皻ば纬善陂g30%至40%的鈣來(lái)自骨組織中的鈣源沉積。骨組織中的髓質(zhì)骨是蛋雞“鈣庫(kù)”的主要部位[12]。在產(chǎn)蛋初期,骨吸收較多的礦物質(zhì),以備需要時(shí)更容易供給機(jī)體[13]。在產(chǎn)蛋后期,由于鈣沉積減少,當(dāng)髓質(zhì)骨供給不足時(shí)更多依賴消耗皮質(zhì)骨形成蛋殼[14]。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于挖掘表型形成相關(guān)的重要基因上。de Oliveira Peixoto等[15]篩選出5個(gè)影響肉雞骨骼代謝發(fā)育的重要候選基因。Rubin等[16]篩選到3個(gè)在蛋雞骨代謝中發(fā)揮作用的基因。Yue等[17]對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞脛骨高斷裂強(qiáng)度組和低斷裂強(qiáng)度組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,篩選出與產(chǎn)蛋后期骨強(qiáng)度有關(guān)的5個(gè)基因。目前轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已經(jīng)在差異表達(dá)基因的研究中得到廣泛應(yīng)用,但鮮有關(guān)于蛋雞不同產(chǎn)蛋期骨組織的轉(zhuǎn)錄組研究。本研究通過(guò)對(duì)海蘭灰蛋雞的脛骨轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析,探索產(chǎn)蛋初期和產(chǎn)蛋后期蛋雞骨代謝的調(diào)控過(guò)程,為進(jìn)一步研究產(chǎn)蛋期對(duì)蛋雞脛骨骨代謝的分子調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

以海蘭灰蛋雞為試驗(yàn)動(dòng)物,采樣前連續(xù)觀察7 d,選擇每天正常產(chǎn)蛋的19和79周齡雞各3只,在產(chǎn)蛋后3 h內(nèi)采集脛骨組織,將脛骨切割成骨塊,置于液氮中速凍,轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱中凍存,用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。以19周齡蛋雞為對(duì)照組,以79周齡蛋雞為處理組。

1.2 cDNA文庫(kù)構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

利用TRIzol法提取脛骨組織總RNA,Nanodrop檢測(cè)RNA的純度(OD260 nm/OD280 nm)、濃度、核酸吸收峰是否正常,Agilent 2100精確檢測(cè)總RNA完整性。樣品檢測(cè)合格后,用帶有Oligo(dT)的磁珠,通過(guò)A-T互補(bǔ)配對(duì)與mRNA的ployA尾結(jié)合的方式富集mRNA。隨后加入fragmentation將mRNA打斷成短片段,以mRNA為模板,用隨機(jī)引物合成一鏈cDNA,后加入緩沖液、dNTPs和DNA polymerase I合成二鏈cDNA,隨后利用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA。最后用PCR法富集cDNA,構(gòu)建海蘭灰蛋雞脛骨cDNA文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建完成后,使用Agilent 2100對(duì)文庫(kù)的insert size進(jìn)行檢測(cè)。在Illumina HiSeq平臺(tái)上對(duì)6個(gè)脛骨組織cDNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。

1.3 脛骨組織差異表達(dá)基因篩選與分析

對(duì)原始序列進(jìn)行FastQC質(zhì)控,用HISAT2軟件將過(guò)濾后的Clean-Reads比對(duì)到雞基因組(版本號(hào):GRCg6a),運(yùn)用DESeq2以|log2(Fold Change)|>1且FDR<0.05作為篩選條件篩選差異表達(dá)基因。利用clusterProfiler對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析與KEGG富集分析。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)互作關(guān)系,用Cytoscape對(duì)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化處理。

1.5 差異表達(dá)基因熒光定量PCR驗(yàn)證

隨機(jī)選擇5個(gè)差異表達(dá)基因,根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因序列,利用Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(表1)。將提取的19周齡與79周齡組脛骨組織的總RNA樣本反轉(zhuǎn)錄成cDNA,進(jìn)行熒光定量PCR。PCR反應(yīng)體系(20 μL):Forget-Me-Not EvaGreen qPCR Master Mix 10 μL,ROX 3 μL,上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL,cDNA 2 μL,ddH2O 4.2 μL。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性5 s,60 ℃退火延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3次重復(fù)。內(nèi)參基因LBR與目的基因在同等條件下進(jìn)行。采用2-ΔΔCt法計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量?；蛳鄬?duì)表達(dá)量結(jié)果用SPSS進(jìn)行單因素方差分析,并用GraphPad Prism繪圖。

表1 引物信息

2 結(jié) 果

2.1 RNA測(cè)序數(shù)據(jù)分析

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控后,分別從6個(gè)海蘭灰蛋雞脛骨cDNA文庫(kù)中得到19 034 718～22 668 315條clean reads,所有樣本Q30值至少為93.68%(表2),表明測(cè)序數(shù)據(jù)可用于后續(xù)分析。將clean reads與雞的參考基因組進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示每個(gè)樣品所產(chǎn)生的測(cè)序讀數(shù)在雞參考基因組上的比對(duì)率為83.78%～85.72%(表2)。

表2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估及Clean reads與參考基因組比對(duì)結(jié)果

2.2 蛋雞脛骨差異表達(dá)基因篩選

蛋雞產(chǎn)蛋初期和后期脛骨的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共鑒定到17 097個(gè)基因,利用DESeq2以|log2(Fold Change)|>1且FDR<0.05為條件共篩選到1 211個(gè)差異表達(dá)基因,其中645個(gè)為下調(diào),566個(gè)為上調(diào)(圖1)。

圖1 蛋雞產(chǎn)蛋初期和產(chǎn)蛋后期脛骨差異表達(dá)基因火山圖Fig.1 Volcano map of differentially expressed genes in the tibia of laying hens during the early and late stages of laying

2.3 差異表達(dá)基因GO功能富集分析

為探究蛋雞產(chǎn)蛋初期和產(chǎn)蛋后期脛骨差異表達(dá)基因的功能,利用clusterProfiler對(duì)1 211個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析,分別富集至生物過(guò)程(biological process,BP)、細(xì)胞組分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)。為進(jìn)一步研究差異表達(dá)基因在蛋雞脛骨代謝中的調(diào)節(jié)作用,篩選排在前10的顯著功能亞類。在BP方面,差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞分化(cell differentiation)與細(xì)胞發(fā)育過(guò)程(cellular developmental process);在CC功能方面,差異表達(dá)基因主要富集在質(zhì)膜(plasma membrane)、胞外區(qū)(extracellular region)和細(xì)胞外間隙(extracellular space);在MF中,差異表達(dá)基因主要富集在信號(hào)受體結(jié)合(signaling receptor binding)、信號(hào)受體活性(signaling receptor activity)和分子傳感器活性(molecular transducer activity)等方面(圖2)。

圖2 19和79周齡蛋雞脛骨差異表達(dá)基因TOP10 GO富集分析Fig.2 Analysis of TOP10 GO enrichment of differentially expressed genes in tibia of laying hens aged 19 and 79 weeks old

2.4 差異表達(dá)基因KEGG功能富集分析

用clusterProfiler對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析。如圖3所示,有114個(gè)差異表達(dá)基因顯著富集在11條KEGG通路(P<0.05),其中有5條與骨代謝相關(guān),分別為MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)、TGF-β信號(hào)通路(TGF-beta signaling pathway)、Toll樣受體信號(hào)通路(toll-like receptor signaling pathway)、糖胺聚糖生物合成-硫酸軟骨素/硫酸皮膚素(glycosaminoglycan biosynthesis-chondroitin sulfate/dermatan sulfate)和糖胺聚糖降解(glycosaminoglycan degradation)。在這5條通路中涉及到59個(gè)差異表達(dá)基因,其中29個(gè)上調(diào),30個(gè)下調(diào)。其中TGFB1、TGFB2和TGFBR2L均與MAPK信號(hào)通路和TGF-β信號(hào)通路相關(guān),MYD88、FOS和IL1B都在Toll樣受體信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路上(圖4),而糖胺聚糖生物合成-硫酸軟骨素/硫酸皮膚素與糖胺聚糖降解通路和上述5條通路間均不存在共有的基因(圖5)。

圖3 19和79周齡蛋雞脛骨差異表達(dá)基因KEGG富集分析Fig.3 KEGG enrichment analysis of differentially expressed gene in the tibia of laying hens aged 19 and 79 weeks old

圖5 糖胺聚糖生物合成-硫酸軟骨素/硫酸皮膚素與糖胺聚糖降解通路差異表達(dá)基因圖譜Fig.5 The differentially expressed genes map of glycosaminoglycan biosynthesis-chondroitin sulfate/dermatan sulfate and glycosaminoglycan degradation pathways

2.5 蛋雞脛骨骨代謝相關(guān)差異表達(dá)基因編碼蛋白互作

為進(jìn)一步研究上述骨代謝通路中所涉及的59個(gè)差異表達(dá)基因的編碼蛋白之間的互作關(guān)系,利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)互作關(guān)系,用Cytoscape對(duì)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化處理。在這59個(gè)差異表達(dá)基因中,共篩選出53種編碼蛋白。在網(wǎng)絡(luò)圖中(圖6),白細(xì)胞介素6(IL6)的Degree值(Degree值越高說(shuō)明節(jié)點(diǎn)核心度越高)最高,共篩選出5個(gè)hub基因的編碼蛋白(Degree≥14)IL6、IL1B、FOS、TGFB2和BMP4。

圖6 蛋雞產(chǎn)蛋初期和后期脛骨骨代謝相關(guān)差異表達(dá)基因編碼蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 The protein interaction network diagram of differentially expressed genes related to bone metabolism in the tibia of laying hens during the early and late stages of egg laying

2.6 差異表達(dá)基因熒光定量PCR驗(yàn)證

隨機(jī)選擇5個(gè)差異表達(dá)基因(ROR1、SOST、SPP1、TGFB、WIF1),以LBR為內(nèi)參基因,對(duì)19和79周齡脛骨組織檢測(cè)該差異表達(dá)基因的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果如圖7所示,所有基因79周齡組表達(dá)水平極顯著高于19周齡組(P<0.01),與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果保持一致(圖8)。

*. P<0.05;**. P<0.01圖7 隨機(jī)5個(gè)差異表達(dá)基因qPCR驗(yàn)證結(jié)果Fig.7 qPCR validation results of randomly selecting 5 differentially expressed genes

圖8 隨機(jī)5個(gè)差異表達(dá)基因RNA-Seq測(cè)序結(jié)果Fig.8 RNA-Seq results of randomly selecting 5 differentially expressed genes

3 討 論

本研究對(duì)產(chǎn)蛋初期和后期蛋雞脛骨組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,共鑒定出1 211個(gè)差異表達(dá)基因,篩選出59個(gè)可能與骨代謝相關(guān)的差異表達(dá)基因,qPCR隨機(jī)驗(yàn)證所選基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致,證明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果可靠。此外TGFB1、TGFB2和TGFBR2 L均在MAPK信號(hào)通路與TGF-β信號(hào)通路上,其中TGFB2和TGFBR2 L表現(xiàn)為上調(diào),而TGFB1為下調(diào)。研究表明,TGFB1與下游信號(hào)的激活能阻止軟骨細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化和組織退化[18-19],并且其基因表達(dá)的變化與該基因的甲基化修飾有關(guān)[20]。本研究發(fā)現(xiàn),與產(chǎn)蛋后期相比TGFB1在產(chǎn)蛋初期表達(dá)下調(diào),這可能說(shuō)明該基因參與骨代謝相關(guān)細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)過(guò)程。最近的研究表明,TGFB2對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨具有誘導(dǎo)分化的作用,且Elsafadi等[21-22]提出可將TGFB2作為成骨分化能力的鑒定指標(biāo)。而TGFBR2 L基因功能未知,目前只發(fā)現(xiàn)miR-20a-5p/TGFBR2軸的調(diào)控與肝纖維化有關(guān)[23]。值得注意的是,糖胺聚糖生物合成-硫酸軟骨素/硫酸皮膚素與糖胺聚糖降解相關(guān)通路與其他通路均沒(méi)有共有基因相連。但是硫酸軟骨素作為動(dòng)物軟骨基質(zhì)[24],其合成與分解能夠影響骨骼質(zhì)量,還可作為藥物用于治療關(guān)節(jié)炎。在本研究中,糖胺聚糖生物合成-硫酸軟骨素/硫酸皮膚素相關(guān)差異表達(dá)基因的差異倍數(shù)(log2FoldChange)均小于-1,糖胺聚糖降解相關(guān)差異表達(dá)基因的差異倍數(shù)均大于1,而HYAL3(-1.94)除外,這也說(shuō)明產(chǎn)蛋后期蛋雞糖胺聚糖的合成與分解產(chǎn)生了不平衡。因此,推測(cè)蛋雞在產(chǎn)蛋后期的骨代謝變化很可能與糖胺聚糖的合成與分解有關(guān)。有研究表明,與HYAL1和HYAL2相比,HYAL3在骨關(guān)節(jié)炎和細(xì)胞外基質(zhì)關(guān)節(jié)軟骨降解過(guò)程中未起到關(guān)鍵作用[25],但本研究發(fā)現(xiàn)HYAL3作為調(diào)控透明質(zhì)酸酶-3的差異表達(dá)基因表現(xiàn)為下調(diào)。Hadley等[26]發(fā)現(xiàn),硫酸角質(zhì)素(KS)可能作為一種髓質(zhì)骨活動(dòng)標(biāo)記物,在本次試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)降解KS的β-氨基己糖苷酶亞單位前體的基因HEXA顯著上調(diào),表明產(chǎn)蛋后期髓質(zhì)骨分解增多。此外,MYD88在Toll樣受體信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路上,有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌感染骨細(xì)胞的MYD88有調(diào)控骨吸收的作用[27],而在本試驗(yàn)中MYD88表現(xiàn)為下調(diào),這說(shuō)明正常產(chǎn)蛋情況下的骨吸收可能不受MYD88調(diào)節(jié),而在機(jī)體缺鈣情況下可能存在一種調(diào)控機(jī)制抑制了MYD88的表達(dá)進(jìn)行自我保護(hù)。

本研究對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行了蛋白互作分析,發(fā)現(xiàn)IL6、IL1B、FOS、TGFB2、BMP4等蛋白節(jié)點(diǎn),且其中的IL1B、FOS、TGFB2在KEGG通路分析中就被發(fā)現(xiàn)是多條功能通路的共有基因,這與蛋白結(jié)果保持了一致。IL6和IL1B對(duì)骨代謝的影響主要集中在人類醫(yī)學(xué)和大鼠方面,研究發(fā)現(xiàn)IL6和IL1B的表達(dá)增加和血清中蛋白水平的增加易導(dǎo)致骨質(zhì)疏松,認(rèn)為是絕經(jīng)后的人或大鼠雌激素分泌減少影響了IL6和IL1B的表達(dá)水平[28-29]。FOS與TGFB2都在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨方面起到重要作用[30-31]。BMP4的突變或缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠或人類的骨骼發(fā)育異常[32]。然而本試驗(yàn)中上述5個(gè)基因與骨代謝相關(guān)差異表達(dá)基因的表達(dá)水平結(jié)果與他人研究結(jié)果均不一致,這可能是由于蛋雞獨(dú)特的骨代謝機(jī)制與哺乳動(dòng)物的差異造成的,蛋雞相較于哺乳動(dòng)物,由于產(chǎn)蛋需要消耗更多的鈣,蛋雞可以在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行快速的骨代謝活動(dòng)來(lái)動(dòng)員鈣形成蛋殼,因此蛋雞與哺乳動(dòng)物的骨代謝機(jī)制可能存在差異,具體原因有待進(jìn)一步研究。此外,本試驗(yàn)還對(duì)這些編碼蛋白進(jìn)行了聚類分析,發(fā)現(xiàn)MAPK信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路和Toll樣受體信號(hào)通路的相關(guān)基因的編碼蛋白互作緊密,而糖胺聚糖生物合成-硫酸軟骨素/硫酸皮膚素與糖胺聚糖降解則各聚成兩組。因此,本試驗(yàn)推測(cè)糖胺聚糖的合成與分解與上述3條通路之間可能不存在明顯聯(lián)系,而其合成與分解受何種機(jī)制的調(diào)控還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

試驗(yàn)通過(guò)轉(zhuǎn)錄組技術(shù)構(gòu)建了6個(gè)海蘭灰蛋雞脛骨cDNA文庫(kù),篩選出59個(gè)與骨代謝相關(guān)的差異表達(dá)基因,且顯著富集到多個(gè)信號(hào)通路,篩選出5個(gè)(IL6、IL1B、FOS、TGFB2、BMP4)與蛋雞骨代謝相關(guān)的重要調(diào)控基因。