陳雪嬌,劉會(huì)杰,臧 蕾,馮 靜,鵬 達(dá)*,張 浩*

(1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,拉薩 850009;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,高原畜禽遺傳資源研究中心,北京 100193))

雪域白雞,原名拉薩白雞,于2020年通過國家畜禽遺傳資源委員會(huì)新品種審定,并正式命名為“雪域白雞”。雪域白雞是由白來航雞和藏雞雜交選育而來,兼具藏雞的高原適應(yīng)性和白來航的高產(chǎn)蛋性能,屬于高海拔地區(qū)輕型良種蛋雞品種[1],為西藏養(yǎng)雞業(yè)帶來了較高的經(jīng)濟(jì)效益。低氧適應(yīng)研究一直深受人們的關(guān)注。有關(guān)低氧感應(yīng)過程的研究成果獲得了2019年的諾貝爾醫(yī)學(xué)或生理學(xué)獎(jiǎng)。低氧與人類的一些疾病緊密相關(guān),例如心腦血管疾病、缺血性損傷、高原反應(yīng)等[2-3],還是腫瘤微環(huán)境的重要指標(biāo)[4]。世居青藏高原等高海拔地區(qū)的人類和動(dòng)物,經(jīng)過多年的自然選擇和遺傳變異,形成了獨(dú)特的生理特征,能夠耐受高寒、低氧、低壓的環(huán)境[5-6]。

鳥類的生殖方式是卵生,胚胎體外發(fā)育,對(duì)氧氣含量的變化非常敏感[7]。已有研究證明,胚胎期是低氧適應(yīng)的關(guān)鍵時(shí)期[8]。雪域白雞經(jīng)過多年的選育,已經(jīng)適應(yīng)了高原低氧的環(huán)境,在海拔3 780 m的環(huán)境條件下受精蛋孵化率高達(dá)81.33%,而北京油雞僅為1.00%[9]。心臟是雞胚適應(yīng)低氧環(huán)境的關(guān)鍵器官,低海拔雞種在受到低氧刺激時(shí),心臟發(fā)育異常,心室壁變薄,心室容積增大,不利于泵血,而青藏高原本土雞種藏雞的心臟發(fā)育正常[10-11]。本研究選取低海拔雞種白來航雞作為對(duì)照,將種蛋在高海拔地區(qū)(西藏拉薩)進(jìn)行孵化,采集孵化第16天的雞胚心臟組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,鑒定雪域白雞適應(yīng)高原低氧環(huán)境的關(guān)鍵基因及其調(diào)控途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

白來航和雪域白雞的種蛋均在西藏拉薩(平均海拔高度3 650 m)進(jìn)行孵化,溫度37.8 ℃,相對(duì)濕度55%,每天翻蛋12次。選取孵化第16天的白來航雞胚10個(gè)(WL-D16, n=10)和雪域白雞胚10個(gè)(XYW-D16, n=10),采集心臟組織,迅速放置于液氮速凍,然后置于-80 ℃冰箱進(jìn)行保存。

1.2 總RNA提取及質(zhì)控

取適量心臟組織,研磨棒研磨后,使用Trizol法提取雞胚心臟總RNA,微量分光光度計(jì)NanoDrop 2000 (Thermo,美國)檢測(cè)其OD260 nm/OD280 nm值鑒定RNA樣品濃度。使用Agient2100/LabChip GX檢測(cè)RNA的完整性。

1.3 文庫構(gòu)建及測(cè)序

樣品檢測(cè)合格后,進(jìn)行文庫構(gòu)建,每組測(cè)序文庫設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA;加入Fragmentation Buffer將mRNA進(jìn)行隨機(jī)打斷;以mRNA為模板,合成第一條cDNA鏈及二鏈,并進(jìn)行cDNA純化;對(duì)純化的雙鏈cDNA進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾,并連接測(cè)序接頭;然后用AMPure XP beads選擇380 bp左右的片段;最后通過PCR得到cDNA測(cè)序文庫。使用Qubit 3.0 熒光定量儀庫對(duì)文庫進(jìn)行初步定量,濃度需達(dá)到1 ng·μL-1以上,隨后用Qsep400高通量分析系統(tǒng)對(duì)文庫的插入片段進(jìn)行檢測(cè)。文庫質(zhì)檢合格后,使用Illumina Nova Seq6000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行PE150模式測(cè)序。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)處理及差異表達(dá)基因篩選

對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控,去除含有接頭和低質(zhì)量的reads得到clean reads。使用HISAT2軟件將clean reads與參考基因組進(jìn)行快速精確的比對(duì)。利用Stringtie 對(duì)mapped reads進(jìn)行組裝和定量,采用FPKM (fragments per kilobase of transcript per Million fragments mapped)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化[12],斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)r (Spearman′s correlation coefficient)作為評(píng)估樣本間基因表達(dá)重復(fù)性的指標(biāo)。以白來航為對(duì)照組,采用DESeq2進(jìn)行基因表達(dá)量差異分析[13],將Fold Change≥2且FDR<0.05 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 差異表達(dá)基因的功能分析

對(duì)篩選到的DEGs進(jìn)行功能富集分析,Gene Ontology(GO)在百邁克在線網(wǎng)站(https:∥international.biocloud.net/)完成,KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析使用KOBAS在線網(wǎng)站(http:∥bioinfo.org/kobas/)完成。使用R包ggplot2進(jìn)行GO和KEGG富集分析可視化。

1.6 轉(zhuǎn)錄因子篩選和靶基因預(yù)測(cè)

在線網(wǎng)站AnimalTFDB(http:∥bioinfo.life.hust.edu.cn/AnimalTFDB4/#/)可下載雞的轉(zhuǎn)錄因子(TF)列表,與篩選的DEGs進(jìn)行對(duì)比,找到測(cè)序數(shù)據(jù)中差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。在線網(wǎng)站JASPAR(https:∥jaspar.genereg.net/)下載轉(zhuǎn)錄因子的基序(motif),選定DEGs轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(transcription start site,TSS )上游5 000 bp為啟動(dòng)子序列,最后在MEME(https:∥meme-suite.org/meme/doc/meme.html)網(wǎng)站對(duì)基序和啟動(dòng)子序列進(jìn)行靶向預(yù)測(cè),建立TF-targets網(wǎng)絡(luò)。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)驗(yàn)證

選取5個(gè)DEGs,肌動(dòng)蛋白γ2(actin γ2,ACTG2)、鉀鈣激活通道亞家族 M α1(potassium calcium-activated channel subfamily M α1,KCNMA1)、叉頭框P2(forkhead box P2,FOXP2)、同源框A2(homeobox A2,HOXA2)、肌動(dòng)蛋白 α2 (actin α2,ACTA2),在NCBI網(wǎng)站設(shè)計(jì)引物(表1),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。選取GAPDH為內(nèi)參基因,對(duì)白來航雞和雪域白雞樣本進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,以檢測(cè)測(cè)序結(jié)果及數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性。采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。采用GraphPad Prism 9.5.1軟件作圖。

表1 qRT-PCR引物

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)

白來航和雪域白雞共6個(gè)樣品的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)量控制,共得到38.53 Gb clean data,每個(gè)樣品的clean data 均達(dá)到了5.97 Gb及以上,Q30堿基百分比在92.85%及以上。將clean reads與雞參考基因組CRCg7b進(jìn)行比對(duì),比對(duì)率在92.01%到93.64%之間(表2)。在白來航和雪域白雞胚胎心臟組織中共鑒定20 291個(gè)陽性表達(dá)基因,其中共同表達(dá)的基因18 258個(gè)。

表2 測(cè)序樣品與參考基因組的序列比對(duì)

2.2 差異表達(dá)基因及功能分析

白來航與雪域白雞胚胎心肌組織中篩選到253個(gè)DEGs,其中在雪域白雞中122個(gè)基因顯著上調(diào),131個(gè)基因顯著下調(diào)(圖1)。差異表達(dá)的253個(gè)基因主要富集于心肌組織發(fā)育調(diào)節(jié)、心肌細(xì)胞增殖、

灰色是表達(dá)差異不顯著的基因;紅色是表達(dá)上調(diào)的基因;藍(lán)色是表達(dá)下調(diào)的基因Non-differentially expressed genes are showed in grey color; red show upregulated genes; blue show downregulated genes圖1 差異表達(dá)基因的火山圖Fig.1 Volcanic map of differentially expressed genes

心肌組織生長、肌原纖維、細(xì)胞外基質(zhì)、蘋果酸脫氫酶(脫羧)(NADP+)活性、MAP激酶磷酸酶活性、鈣釋放通道活性和鈣離子結(jié)合等GO 條目(圖2)。

圖2 差異表達(dá)基因的GO功能注釋Fig.2 GO functional annotation of differentially expressed genes

利用KOBAS數(shù)據(jù)庫分析DEGs功能,發(fā)現(xiàn)它們(TENM2、NOG、SMOC1、CCBE1、END2、ACTG2、和MMP2等)主要參與血管平滑肌收縮、MAPK信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長因子信號(hào)通路和心肌收縮等途徑,這些途徑可能參與心臟形態(tài)發(fā)生和功能。此外DUSP5、UPB1、LPIN2、PLA2G4A和PDGFC等差異表達(dá)基因還參與多種代謝途徑,包括淀粉和蔗糖代謝、泛酸和輔酶A的生物合成以及甘油磷脂代謝等(圖3),這些能量代謝途徑可能為機(jī)體生存和心臟起搏提供能量。

圖3 差異表達(dá)基因的KEGG通路富集分析Fig.3 KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed genes

2.3 轉(zhuǎn)錄因子篩選和靶基因網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

經(jīng)過篩選,差異表達(dá)基因中含有2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,分別是FOXP2和HOXA2。由于motif的每個(gè)位點(diǎn)堿基分布頻率不同,轉(zhuǎn)錄因子和靶基因可能存在一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(表3)。通過將motif與啟動(dòng)子序列比對(duì),構(gòu)建了轉(zhuǎn)錄因子與靶基因網(wǎng)絡(luò)(圖4),值得注意的是,其中一些靶基因(MMP2、ACTA2、ACTG2和KCNMA1等)的功能富集在血管內(nèi)皮生長因子信號(hào)通路、應(yīng)對(duì)低氧和血管生成等途徑,提示與心臟發(fā)育和功能有關(guān)(圖5)。

紅色三角形代表轉(zhuǎn)錄因子;藍(lán)色方形代表靶基因(差異表達(dá)基因)The red triangles represent transcription factors; The blue squares represent target genes (DEGs)圖4 轉(zhuǎn)錄因子-靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Transcription factor-target gene prediction network

藍(lán)色圓形代表轉(zhuǎn)錄因子;綠色三角形代表靶基因(差異表達(dá)基因);橙色方形代表通路Blue circles represent transcription factors; Green triangles represent target genes (DEGs); The orange squares represent the pathways圖5 轉(zhuǎn)錄因子與部分靶基因及通路預(yù)測(cè)網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Transcription factors and partial target genes and pathways prediction network

2.4 差異表達(dá)基因驗(yàn)證

選取5個(gè)差異表達(dá)基因,取白來航和雪域白雞樣品進(jìn)行 qRT-PCR 分析,通過 log2(fold change)對(duì)差異倍數(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換。結(jié)果如圖6所示,qRT-PCR結(jié)果與RNA-seq測(cè)序結(jié)果表達(dá)趨勢(shì)一致,表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的真實(shí)性和準(zhǔn)確性。

圖6 qRT-PCR基因表達(dá)量結(jié)果Fig.6 qRT-PCR gene expression results

3 討 論

氧氣是決定胚胎正常發(fā)育的關(guān)鍵因素之一,包括心臟發(fā)生[14]。心臟發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜而精妙的過程,很容易受到自身基因表達(dá)變化和外界環(huán)境因素的影響而發(fā)育異常[15-16]。有研究指出,胎兒在母體子宮內(nèi)的異常缺氧會(huì)對(duì)心臟發(fā)育產(chǎn)生不利影響,改變心肌結(jié)構(gòu),導(dǎo)致心功能下降[17]。長期暴露于高海拔地區(qū)提高了牦牛對(duì)低氧的生理反應(yīng),較大的心臟有利于它們適應(yīng)低氧環(huán)境[18]。低氧孵化第16天的藏雞胚胎心臟組織表達(dá)譜顯示,藏雞與低地雞種差異表達(dá)基因主要為FGFR1、CTGF、ADAM9、JPH2、SATB1、BMP4和HYAL1等,這些基因可能參與心肺系統(tǒng)發(fā)育[19]。本研究對(duì)高海拔孵化第16天的白來航雞和雪域白雞胚胎心臟組織進(jìn)行基因表達(dá)譜分析,鑒定出的差異表達(dá)基因主要為TENM2、NOG、SMOC1、CCBE1、END2、ACTG2、和MMP2等,這些基因富集在心臟發(fā)育和血管發(fā)育等通路。這些結(jié)果表明,鑒定到的差異基因可能參與雞胚心血管發(fā)育和功能,是研究雪域白雞適應(yīng)低氧環(huán)境的候選基因。

氧氣與能量代謝有緊密的關(guān)系,機(jī)體生存和運(yùn)動(dòng)都離不開ATP供能,而ATP的產(chǎn)生依賴于氧氣參與的氧化磷酸化[20]。因此當(dāng)機(jī)體處于低氧環(huán)境時(shí),能量代謝也會(huì)受到影響。先前的研究將高海拔地區(qū)的代謝適應(yīng)歸因于肌肉氧化能力的降低,其中乳酸脫氫酶(LDH)是厭氧糖酵解的關(guān)鍵酶,催化丙酮酸和乳酸之間的轉(zhuǎn)化,在能量代謝過程中起關(guān)鍵作用[21]。高原牦牛背最長肌中的LDH活性較高,能利用有限的氧氣促進(jìn)碳水化合物的利用從而釋放能量[18]。還原性輔酶NADH在生化代謝反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,例如糖酵解和三羧酸循環(huán)等[22]。本研究鑒定的差異表達(dá)基因(DUSP5、UPB1、LPIN2、PLA2G4A和PDGFC等)也在能量代謝途徑有富集,包括蘋果酸脫氫酶(NAD+)活性和丙酮酸代謝等。表明能量代謝方面的差異可能是雪域白雞適應(yīng)低氧環(huán)境的原因。

轉(zhuǎn)錄因子指能夠以序列特異性方式結(jié)合DNA并且調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)[23]。轉(zhuǎn)錄因子與特異性DNA結(jié)合通常概括為“基序”(motif),可用于掃描較長序列(例如啟動(dòng)子)以鑒定潛在的結(jié)合位點(diǎn),轉(zhuǎn)錄因子在基因的啟動(dòng)子區(qū)有一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)[24]。轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子結(jié)合,招募RNA聚合酶或其他因子,促進(jìn)或者抑制基因的轉(zhuǎn)錄,從而調(diào)控生物功能[25]。低氧研究的明星基因HIF-1α,作為轉(zhuǎn)錄因子激活調(diào)控的靶基因表達(dá)[26-28]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是HIF的靶基因,具有促進(jìn)血管通透性增加、細(xì)胞外基質(zhì)變性、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和血管形成等作用,缺氧條件下HIF-1可以調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)[29-30]。本研究鑒定了2個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子FOXP2 和HOXA2,可以靶向調(diào)控KCNMA1、CACNG4、SCN4B、WNT2B、MMP2、CCBE1、ACTG2、ACTA2、PLA2G4A和TENM2等基因表達(dá)。其中MMP2屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族,低氧可以刺激MMP2的表達(dá)上調(diào)[31],參與多種生物學(xué)功能過程,包括血管平滑肌生長、增殖、遷移、松弛、血管生成和細(xì)胞凋亡等,與心血管發(fā)育密切相關(guān)[32-34]。ACTA2基因編碼 α-平滑肌肌動(dòng)蛋白,通常在促進(jìn)血管運(yùn)動(dòng)和收縮的血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá),參與血管收縮和血壓穩(wěn)態(tài)[35-36]。這些基因的功能均與心血管發(fā)育相關(guān),參與心臟發(fā)育和功能相關(guān)通路。因此,本研究認(rèn)為在低氧適應(yīng)過程中,這些轉(zhuǎn)錄因子可能通過調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)而發(fā)揮作用,保證雪域白雞胚胎期心臟正常發(fā)育,泵血功能正常,從而適應(yīng)低氧環(huán)境。

4 結(jié) 論

雪域白雞是西藏自主培育的品種,本研究通過高海拔孵化的雞胚心臟轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,發(fā)現(xiàn)了差異表達(dá)基因富集在心臟發(fā)育、血管發(fā)育和能量代謝途徑,鑒定了轉(zhuǎn)錄因子FOXP2 和HOXA2,它們可能通過調(diào)控靶基因的表達(dá)參與血管生成和心肌收縮等途徑,為進(jìn)一步研究雞高原低氧適應(yīng)分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)。