畢 歡,覃 海,袁 巍,張雨丹,張依裕,,陳 偉*

(1.高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴陽(yáng) 550025;2.貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴陽(yáng) 550025;3.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴陽(yáng) 550025)

香豬是一種原始小型豬種,經(jīng)濟(jì)早熟,肉嫩味鮮,皮薄骨細(xì),是加工高檔豬肉產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)原料;香豬耐粗飼,抗病力強(qiáng),對(duì)氣候變化具有較強(qiáng)的適應(yīng)性,是抗病育種的良好素材;小型豬的生理值與人類相似,是一種理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。毛色作為香豬重要的表型特征之一,它在確定品種純度、親緣關(guān)系和雜交組合以及評(píng)價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量等方面均有很強(qiáng)的參考價(jià)值。隨著豬雜種優(yōu)勢(shì)的廣泛應(yīng)用,為使商品豬具有理想的毛色,親本的毛色也成為一個(gè)需要認(rèn)真考慮的性狀[1]。因此,揭示豬毛色的遺傳機(jī)制及其影響毛色的相關(guān)基因的遺傳規(guī)律,對(duì)于豬的育種具有重要意義。

豬毛色的形成機(jī)制較復(fù)雜,是由一系列與黑色素的形成與種類有關(guān)的生理、生化反應(yīng)決定的[2-6]。動(dòng)物體內(nèi)的黑色素主要有兩種:真黑素和褐黑素,真黑素主要形成黑、褐兩種毛色,褐黑素主要形成紅色和黃色的毛發(fā)[7]。哺乳動(dòng)物的毛色是由多個(gè)基因決定的,這些基因影響著黑色素的生成或黑素細(xì)胞的生成、增殖和遷移,如MC1R、TYR家族(TYR、TYRP1、TYRP2)、KIT和MITF等基因可以調(diào)節(jié)黑色素的沉積而決定動(dòng)物毛發(fā)的顏色。黑色素細(xì)胞又稱黑素細(xì)胞(melanocyte cell, MC),是合成黑色素的細(xì)胞,起源于胚胎神經(jīng)嵴細(xì)胞,主要分布于哺乳動(dòng)物皮膚(表皮基底層)、毛發(fā)基質(zhì)、黏膜和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(軟腦膜)、眼睛(視網(wǎng)膜色素上皮、葡萄膜束)、耳朵(血管紋)中[8]。黑色素生成是一種酶的級(jí)聯(lián)調(diào)控,由酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)、酪氨酸相關(guān)蛋白酶1(tyrosinase-related protein 1,TYRP1)和酪氨酸酶相關(guān)蛋白2(tyrosinase-related protein 2,TYRP2)共同調(diào)控[9]。TYRP1是黑色素生成過(guò)程中的關(guān)鍵酶,哺乳動(dòng)物皮膚色素的沉著程度取決于它的催化活性[10-11]。Dell′angelica[12]研究發(fā)現(xiàn),TYRP1基因在人黑色皮膚黑素細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于白色皮膚。Manga等[13]發(fā)現(xiàn),TYRP1基因突變會(huì)引起南非人種產(chǎn)生白化病。Cargill等[14]研究表明,TYRP1基因可能與犬白色背部皮膚上的黑色和褐色斑點(diǎn)的形成有關(guān)。覃海等[15]發(fā)現(xiàn),TYRP1基因在劍白香豬黑色被毛皮膚中的表達(dá)量顯著高于白色被毛皮膚。TYRP1是影響黑色素生成的重要候選基因之一,通過(guò)對(duì)黑色素生成相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控以及在體內(nèi)表達(dá)產(chǎn)物間相互作用從而調(diào)控黑色素的生成。

本研究以香豬表皮黑素細(xì)胞為模型,探究敲降TYRP1基因后對(duì)香豬表皮黑素細(xì)胞TYR基因家族mRNA和蛋白表達(dá)及黑色素生成的影響,為研究豬黑色素生成調(diào)控機(jī)制和毛色相關(guān)性狀的選育提供有關(guān)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及處理

試驗(yàn)動(dòng)物為貴州大學(xué)香豬育種場(chǎng)的3月齡健康香豬3頭,具有頭部和尾部為黑色、其他部位均為白色被毛的“兩頭烏”外貌特征。用耳鉗和鉆孔器分別采集香豬耳朵和背部的皮膚組織,使用75%乙醇消毒后,用含雙抗的PBS沖洗3次后放入含雙抗的DMEM培養(yǎng)基中并置于冰盒,在2 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)處理。

1.2 主要試劑和器材

乙醇、二甲苯、石蠟、4%多聚甲醛(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)、蘇木素-伊紅染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基(Gibco)、MelM培養(yǎng)基(ScienCell)、0.25% 胰蛋白酶-EDTA(Gibco)、青鏈霉素混合液(Solarbio)、DispaseⅡ(Gibco)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、多巴(L-Dopa,Sigma)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(CWBIO)、熒光定量試劑(MagicSYBR Mixture,CWBIO)、2×Taq MasterMix(CWBIO)、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen)、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(CWBIO)、PVDF膜、脫脂奶粉、Tween-20(博士德)、蛋白彩虹Maker(Thermo)、甲醇、兔抗多克隆一抗:TYR、TYRP1、TYRP2和MITF (Abcam),兔抗 β-actin多克隆一抗(Abcam),山羊抗兔二抗(Abcam)等均購(gòu)自卓一生物技術(shù)有限公司。超高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Thermo SL40)購(gòu)自德國(guó)Thermo Electron 公司,PCR 擴(kuò)增儀(C1000 TouchTM)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio Sens SC710)購(gòu)自美國(guó) BIO-RAD 公司,CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(SERIES II WATER JACKET)購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司,倒置熒光顯微鏡(Nikon C-SHG1)購(gòu)自日本NIKON尼康公司,酶標(biāo)儀(Synergy Mx )購(gòu)自美國(guó)伯騰公司,超凈工作臺(tái)(SW-CG-1F)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 皮膚組織蘇木素-伊紅(HE)染色 將采集的皮膚組織放入4%多聚甲醛溶液中過(guò)夜固定,用解剖刀修成0.5 cm×0.5 cm的正方形進(jìn)行脫水、透明。將皮膚組織包埋后修整蠟塊,用切片機(jī)從蠟塊上切下適當(dāng)長(zhǎng)度的蠟帶并展片,用載玻片將蠟片撈起置于烘箱中65 ℃烘烤過(guò)夜。HE染色前對(duì)片子進(jìn)行脫蠟水化,按照蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色。最后用中性樹(shù)脂進(jìn)行封片,自然風(fēng)干后用二甲苯將玻片上多余殘留的中性樹(shù)脂擦掉,再次風(fēng)干后在顯微鏡下觀察。

1.3.2 香豬表皮黑素細(xì)胞培養(yǎng) 在超凈臺(tái)中用剪刀將耳組織多余毛發(fā)剪掉,去掉皮下脂肪,用75%乙醇和含1%雙抗的PBS交替清洗3次。將清洗好的皮膚剪小至2 mm×5 mm,放入盛有0.15%Dispase II酶消化液的離心管中,使消化液沒(méi)過(guò)皮膚組織,37 ℃培養(yǎng)箱中消化2～4 h,期間更換消化液一次。在超凈工作臺(tái)內(nèi)取出新的培養(yǎng)皿,加入含雙抗的PBS溶液,依次洗滌皮膚組織,然后用鑷子輕輕將表皮與真皮分離,收集并剪碎表皮并放入15 mL離心管,加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液使其沒(méi)過(guò)皮膚組織,置37 ℃水浴鍋中消化8～12 min,用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞消化情況。在消化液中迅速加入等量的含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化,200目篩網(wǎng)過(guò)濾后400目篩網(wǎng)再次過(guò)濾,然后將濾液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中,4 ℃ 1 000 r·min-1離心10 min。棄上清液,取適量 MelM培養(yǎng)基(含1%黑素細(xì)胞生長(zhǎng)因子、10%胎牛血清、1%雙抗)加入離心管中,吹打混勻后形成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液放入培養(yǎng)瓶中,置37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),72 h首次換液,之后每2～3 d換液1次,傳至4～5代時(shí)可獲得較純的黑素細(xì)胞。

1.3.3 香豬表皮黑素細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第4代香豬表皮黑素細(xì)胞,將細(xì)胞濃度調(diào)整為4×104個(gè)·mL-1后按200 μL每孔接種于96孔板,置37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后,每日在96孔板上隨機(jī)選取3個(gè)孔做MTT比色試驗(yàn),共10 d,剩余細(xì)胞每2 d換液1次。做MTT比色試驗(yàn)時(shí)每個(gè)待測(cè)孔加入20 μL濃度為0.5%的MTT,培養(yǎng)4 h后吸棄液體,每孔加入100 μL DMSO,置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min,待細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶充分溶解后,在自動(dòng)酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下測(cè)得吸光度(OD)。以時(shí)間(d)為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 香豬表皮黑素細(xì)胞的生物學(xué)鑒定

1.3.4.1 L-Dopa染色 取融合度達(dá)80%的第4代黑素細(xì)胞,棄去培養(yǎng)瓶中原有培養(yǎng)基,PBS清洗細(xì)胞3次后使用4%多聚甲醛固定30 min。固定完成后棄去固定液,PBS清洗3次,使用0.3% TritonX-100對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透30 min。PBS對(duì)細(xì)胞沖洗3次后使用0.1% L-Dopa染色液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色,放入37 ℃培養(yǎng)箱孵育,2 h時(shí)更換染液,接著再孵育2 h。染色結(jié)束后PBS沖洗細(xì)胞,顯微鏡觀察,細(xì)胞胞漿內(nèi)觀察到黑色或棕色的色素顆粒,說(shuō)明該細(xì)胞為黑素細(xì)胞。

1.3.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定 黑素細(xì)胞內(nèi)有特異基因表達(dá),如:TYR、TYRP1、TYRP2、MITF、KIT等,運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中毛色相關(guān)基因的表達(dá)水平,以此來(lái)鑒定黑素細(xì)胞。取融合度達(dá)80%的第4代細(xì)胞,利用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA,并反轉(zhuǎn)錄cDNA。以RPS18作為內(nèi)參基因,根據(jù)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)GenBank中公布的野豬(Susscrofa)序列,用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,引物由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成,序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列信息

1.3.4.3 Western Blot鑒定 檢測(cè)細(xì)胞中毛色相關(guān)蛋白TYR、TYRP1、TYRP2和MITF的表達(dá)水平,以此來(lái)鑒定黑素細(xì)胞。將融合度達(dá)80%的第4代黑素細(xì)胞用PBS洗滌3次后使用蛋白裂解液分離提取香豬黑素細(xì)胞的總蛋白,并使用BCA法檢測(cè)蛋白濃度,調(diào)整蛋白濃度后100 ℃水浴鍋中水浴3 min使蛋白變性。按照SDS-PAGE凝膠試劑盒操作說(shuō)明配膠,電泳使蛋白分離,每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。按照蛋白Marker說(shuō)明切下含有目的蛋白的膠條,將目的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上后使用含5%脫脂奶粉的TBST封閉3 h,然后與兔抗TYR、TYRP1、TYRP2和MITF及內(nèi)參兔抗β-actin在4 ℃垂直搖床上孵育過(guò)夜。用TBST洗滌3次后,將膜與HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體在37 ℃下孵育2 h。采用均勻涂抹超敏ELC發(fā)光液,采集圖像后膠片曝光。

1.3.5 小干擾RNA(siRNA-TYRP1)的合成 根據(jù)香豬TYRP1基因(GenBank No.:537161)全序列,由上海吉瑪生物科技有限公司合成5個(gè)siRNA序列,如表2所示。

表2 siRNAs片段詳細(xì)信息

1.3.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的黑素細(xì)胞用胰酶消化后鋪至細(xì)胞6孔板中繼續(xù)培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)基。在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞,待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)80%時(shí)開(kāi)始進(jìn)行轉(zhuǎn)染,將5種小干擾 RNA和一組對(duì)照組(NC)轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞,每組處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。按照轉(zhuǎn)染試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.3.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)毛色相關(guān)基因表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后,用Trizol法提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)香豬黑色素細(xì)胞轉(zhuǎn)染TYRP1-siRNA后TYR、TYRP1和TYRP2基因在mRNA表達(dá)水平的變化。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的引物序列見(jiàn)表1。

1.3.8 Western Blot檢測(cè)毛色相關(guān)蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后提取黑素細(xì)胞總蛋白,調(diào)整蛋白濃度并變性后進(jìn)行Western Blot試驗(yàn)檢測(cè)TYR、TYRP1和TYRP2的蛋白表達(dá)水平,內(nèi)參選用兔抗β-actin,每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3.9 黑素細(xì)胞中總黑色素含量的測(cè)定 轉(zhuǎn)染48 h后,PBS吹洗并消化計(jì)數(shù)。細(xì)胞懸液4 ℃,12 000 r·min-1離心10 min后棄上清,PBS清洗3次后再次離心,棄去PBS。在沉淀中加入300 μL的1 mol·L-1NaOH溶液,充分溶解后,80 ℃金屬浴裂解30 min。取溶解后的樣品,10 000 r·min-1離心10 min,取上清,設(shè)3個(gè)重復(fù),酶標(biāo)儀475 nm波長(zhǎng)下測(cè)其OD值,記錄數(shù)據(jù),分析計(jì)算黑色素含量的變化。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)2-ΔΔCt法對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算分析。對(duì)獲得的目的蛋白圖像利用Image J軟件測(cè)定灰度值并進(jìn)行半定量分析。Excel表格分析處理數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)用“Means±SD”表示,采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析檢驗(yàn)。單獨(dú)兩樣品之間利用t檢驗(yàn)法檢測(cè)差異顯著性;*.P<0.05為差異顯著,**.P<0.01為差異極顯著;樣本重復(fù)數(shù)n=3,最后利用prism軟件繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 香豬皮膚黑素細(xì)胞的組織學(xué)形態(tài)分析

對(duì)黑色和白色香豬皮膚進(jìn)行橫切和縱切,經(jīng)過(guò)HE染色觀察到香豬不同顏色被毛皮膚中黑素細(xì)胞的分布特征,并觀察到完整的毛囊結(jié)構(gòu)。圖1顯示,黑素細(xì)胞主要分布在香豬黑色被毛皮膚中的毛囊外根鞘部位以及表皮,黑色素顆粒主要在皮膚表皮的基層、毛囊的毛干以及毛乳頭部位沉積,香豬白色被毛皮膚組織中并未觀察到黑色顆粒的沉積。

A、 D. 黑色和白色皮膚毛囊橫切圖(200×);B、E. 黑色和白色皮膚毛囊縱切圖(200×);C. 成熟的黑色毛發(fā)毛囊結(jié)構(gòu)圖(100×);F. 成熟的黑色毛發(fā)毛囊的縱切結(jié)構(gòu)圖(100×)。1. 黑色素顆粒;2.黑素細(xì)胞;3.毛乳頭;4.毛根;5.毛干A,D. The transverse sections of hair follicles of black and white colors (200×); B,E. The longitudinal map of hair follicles of black and white colors(200×); C. The structure of mature black hair follicles (100×); F. The longitudinal structure of mature black hair follicles (100×). 1. Melanin granules; 2. Melanocytes; 3. Hair papilla; 4. Hair root; 5. Hair shaft圖1 香豬不同顏色皮膚HE染色Fig.1 HE staining of skin with different colors of Xiang pigs

2.2 香豬表皮黑素細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察及傳代

使用倒置顯微鏡對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察,原代培養(yǎng)2 h后,培養(yǎng)基中黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞交叉分散,少部分細(xì)胞開(kāi)始貼壁(圖2A);12 h后,基本貼壁完全,在角質(zhì)形成細(xì)胞中散在分布橢圓形、三角形或兩極樹(shù)突狀細(xì)胞(圖2B);24 h后,大部分細(xì)胞胞體橢圓,含2個(gè)對(duì)稱樹(shù)突;少數(shù)細(xì)胞胞體呈多角形或不規(guī)則形,含2個(gè)或以上樹(shù)突(圖2C)。培養(yǎng)約10 d后可初次傳代,傳至第4代時(shí),可分離出密度較大較純的香豬表皮黑素細(xì)胞(圖2D)。

A. 培養(yǎng)2 h的黑素細(xì)胞;B. 培養(yǎng)12 h的黑素細(xì)胞;C. 培養(yǎng)24 h的黑素細(xì)胞;D. 第4代黑素細(xì)胞?！鼮楹谒丶?xì)胞A . The melanocytes cultured for 2 h;B. The melanocytes cultured for 12 h ;C. The melanocytes cultured for 24 h; D. The 4th generation melanocytes. ↑ showed the melanocytes圖2 體外培養(yǎng)的香豬表皮黑素細(xì)胞Fig.2 Cultured Xiang pig skin melanocytes in vitro

2.3 香豬表皮黑素細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

由圖3可知,第4代黑素細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈“S”型,符合細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律。培養(yǎng)第1～3 天時(shí)細(xì)胞增殖緩慢,處于潛伏期;第4～8 天大量生長(zhǎng),進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期;第8天后生長(zhǎng)開(kāi)始減緩甚至停滯,進(jìn)入平臺(tái)期。

2.4 香豬皮膚黑素細(xì)胞的生物學(xué)鑒定

2.4.1 L-Dopa染色 第4代原代表皮黑素細(xì)胞多巴染色呈陽(yáng)性,細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核被染成棕黑色,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)黑色色素顆粒(圖4)。

圖4 第4代香豬表皮黑素細(xì)胞多巴染色Fig.4 The Xiang pig skin melanocytes of passage 4 stained by L-Dopa

2.4.2 香豬表皮黑素細(xì)胞標(biāo)志基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 對(duì)第4代香豬表皮黑素細(xì)胞進(jìn)行TYR、TYRP1、TYRP2、MITF和KIT基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),結(jié)果顯示,第4代細(xì)胞中TYR、TYRP1、TYRP2、MITF和KIT基因均有表達(dá)(圖5)。說(shuō)明香豬表皮黑素細(xì)胞系在第4代保持著特有的基因和生物學(xué)活性。

圖5 TYR、TYRP1、TYRP2、MITF和KIT 在香豬表皮黑素細(xì)胞中的表達(dá)Fig.5 Expression levels of TYR,TYRP1,TYRP2,MITF and KIT in Xiang pig epidermis melanocytes

2.4.3 Western Blot鑒定 對(duì)第4代香豬表皮黑素細(xì)胞中TYR、TYRP1、TYRP2和MITF的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,第4代細(xì)胞中TYR、TYRP1、TYRP2和MITF蛋白均有表達(dá)(圖6)。說(shuō)明香豬表皮黑素細(xì)胞系在第4代保持著特有的蛋白和生物學(xué)活性。

圖6 香豬表皮黑素細(xì)胞中TYR、TYRP1、TYRP2和MITF蛋白的表達(dá)Fig.6 TYR,TYRP1,TYRP2 and MITF proteins expression in Xiang pig epidermis melanocytes

2.5 TYRP1基因有效siRNA片段篩選

將TYRP1基因的5條siRNAs和對(duì)照組NC分別轉(zhuǎn)染香豬黑素細(xì)胞,培養(yǎng)細(xì)胞48 h后進(jìn)行干擾效率檢測(cè)。結(jié)果表明,TYRP1基因的mRNA表達(dá)量較對(duì)照均顯著下降(P<0.01),其中 si-TYRP1-4干擾效率最高,達(dá)到76.99%(P<0.01)(圖7)。因此選擇si-TYRP1-4用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖7 黑素細(xì)胞中TYRP1基因的沉默效率檢測(cè)Fig.7 Detection of silencing efficiency of TYRP1 gene in melanocytes

2.6 敲降TYRP1基因后細(xì)胞內(nèi)TYR、TYRP1、TYRP2基因mRNA的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,與NC轉(zhuǎn)染組相比,si-TYRP1轉(zhuǎn)染組中TYR、TYRP1、TYRP2基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平均顯著下降(P<0.01,圖8)。

圖8 轉(zhuǎn)染TYRP1-siRNA后黑素細(xì)胞內(nèi)TYR、TYRP1、TYRP2基因的表達(dá)Fig.8 Expression of TYR,TYRP1 and TYRP2 genes in melanocytes after transfection of TYRP1-siRNA

2.7 敲降TYRP1基因后細(xì)胞內(nèi)TYR、TYRP1、TYRP2蛋白表達(dá)水平

Western Blot結(jié)果顯示,與NC轉(zhuǎn)染組相比,si-TYRP1轉(zhuǎn)染組中TYR、TYRP1、TYRP2蛋白相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低(P<0.01,圖9)。

圖9 轉(zhuǎn)染TYRP1-siRNA后黑色素細(xì)胞內(nèi)TYR、TYRP1、TYRP2蛋白的表達(dá)Fig.9 Protein expression of TYR,TYRP1 and TYRP2 in melanocytes after transfection of TYRP1-siRNA

2.8 敲降TYRP1基因后細(xì)胞內(nèi)黑色素含量的變化

黑色素含量測(cè)定結(jié)果顯示,與NC轉(zhuǎn)染組相比,si-TYRP1轉(zhuǎn)染組的黑色素含量降低了24.78%(P<0.01,圖10)。說(shuō)明敲降TYRP1基因可抑制黑色素的生成。

圖10 轉(zhuǎn)染TYRP1-siRNA后黑素細(xì)胞內(nèi)黑色素含量的變化Fig.10 Changes of melanin content in melanocytes after transfection of TYRP1-siRNA

3 討 論

黑素細(xì)胞主要有3類,第一類分布在表皮中,很少增殖分化,主要功能為生成黑色素抵御紫外線的傷害;第二類是分布在毛囊中的黑素細(xì)胞,每個(gè)毛發(fā)生長(zhǎng)周期中都會(huì)重復(fù)的增殖分化,不生成黑色素顆粒,主要是體內(nèi)黑素細(xì)胞的來(lái)源;第三類是分布在毛球部位,這類黑素細(xì)胞不能增殖分化,但是能產(chǎn)生大量的黑色素顆粒,是由毛囊中的黑素細(xì)胞分化而來(lái)的[16]。高澤成等[17]研究發(fā)現(xiàn),在牦牛皮膚中,黑色素顆粒主要分布在黑色被毛的毛干中,其次在毛乳頭、毛囊外根鞘、皮膚表皮基底層也有分布,黑素細(xì)胞主要分布在皮膚表皮、毛囊與毛囊周圍。謝光躍等[18]發(fā)現(xiàn),在烏骨山羊中,黑色被毛毛囊外根鞘一周的黑色素細(xì)胞呈高度空泡狀, 周圍分布著大量黑色素顆粒,和周圍細(xì)胞區(qū)分明顯;而白色被毛毛囊外根鞘部位的黑色素細(xì)胞樹(shù)突不明顯,與周圍細(xì)胞很難以肉眼區(qū)分,周圍沒(méi)有明顯的黑色素顆粒。張建等[19]提到有色毛豬的毛根和毛囊中的成熟黑素細(xì)胞中充滿黑色素顆粒;而白毛豬的毛囊中沒(méi)有黑素細(xì)胞,且毛囊細(xì)胞較小。本研究結(jié)果顯示,黑素細(xì)胞主要分布在香豬黑色被毛皮膚中的毛囊外根鞘部位以及表皮。黑色素顆粒主要在皮膚表皮的基層,毛囊的毛干以及毛乳頭部位沉積,而香豬白色被毛皮膚組織中并未觀察到黑色顆粒的沉積。黑素細(xì)胞合成色素顆粒是動(dòng)物毛色形成的基礎(chǔ),黑色素的數(shù)量和種類決定了動(dòng)物的毛色和膚色。本研究在參考前人研究方法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn),使用DispaseⅡ和胰酶-EDTA兩步法在體外成功分離培養(yǎng)了香豬表皮黑素細(xì)胞,并對(duì)其生長(zhǎng)特性、特異基因及編碼蛋白表達(dá)、多巴染色進(jìn)行了觀察,結(jié)果與前人[20-22]對(duì)黑素細(xì)胞的鑒定結(jié)果一致,表明培養(yǎng)的黑素細(xì)胞保持了正常的生物學(xué)特性。為后續(xù)試驗(yàn)提供了細(xì)胞模型。

TYRP1是第一個(gè)克隆成功的色素基因,在黑色素生物的形成途徑中起到了關(guān)鍵作用[23]。由于TYRP1基因編碼蛋白與酪氨酸酶同源,因而被稱為酪氨酸酶相關(guān)蛋白1[24]。此前有報(bào)道稱,TYRP1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中充當(dāng)TYR的伴侶,這增加了TYR的穩(wěn)定性,并表明這兩種蛋白質(zhì)在黑素體內(nèi)形成二聚體[25-26]。TYRP1基因有二硫氧基吲哚酸氧化酶的功能,在黑素細(xì)胞合成黑色素的下游途徑中發(fā)揮重要作用,并影響了黑素細(xì)胞的增殖凋亡、黑色素小體的成熟、黑色素的超微結(jié)構(gòu)、黑色素合成過(guò)程、黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、形態(tài)和TYR的活力等[27]。在黑色素合成過(guò)程中,TYRP1影響真黑色素與偽黑色素的轉(zhuǎn)換,高活性TYRP1導(dǎo)致真黑色素的產(chǎn)生,反之則產(chǎn)生偽黑色素[28-29]。到目前為止,TYRP1已經(jīng)在常見(jiàn)動(dòng)物,如綿羊、小鼠、禽類、水產(chǎn)動(dòng)物魚(yú)類等多個(gè)物種中參與色素的沉積,但在豬上的研究則比較匱乏。Wu等[30]發(fā)現(xiàn),五指山豬黑色皮膚和白色皮膚中TYRP1的表達(dá)存在差異。Ren等[31]發(fā)現(xiàn),涼山豬的金色表型與TYRP1的顯性突變有關(guān);TYRP1基因中6 bp缺失導(dǎo)致中國(guó)本土豬棕色表型[32]。

Small interfering RNA (siRNA)是一類長(zhǎng)約21～25 bp的小RNA分子,能夠激發(fā)與之互補(bǔ)的靶mRNA的沉默[33-34]。Li等[35]發(fā)現(xiàn),在體外敲降TYRP1能促進(jìn)MHC1的表達(dá),并作為治療黑色素瘤的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。Gilot等[36]在體外敲降TYRP1后恢復(fù)了miR-16的黑色素瘤抑制功能。為了證明TYRP1與香豬黑色素生成有關(guān),本試驗(yàn)通過(guò)siRNA敲降,降低TYRP1基因在香豬黑素細(xì)胞中的表達(dá),進(jìn)一步研究了TYRP1與毛色相關(guān)基因表達(dá)之間的關(guān)系。結(jié)果表明,敲降TYRP1后會(huì)抑制黑色素生成相關(guān)基因TYR、TYRP1和TYRP2及其編碼蛋白的表達(dá),從而抑制香豬表皮黑素細(xì)胞中黑色素的生成。TYRP1基因及其編碼蛋白的表達(dá)下調(diào)是由于TYRP1的直接敲降引起的,TYRP1表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致TYR和TYRP2的表達(dá)降低。雖然TYRP1能夠影響黑素細(xì)胞中黑色素的生成,但其調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步試驗(yàn)加以驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)HE染色觀察香豬皮膚毛囊結(jié)構(gòu)及黑素細(xì)胞的分布特征,利用兩步法體外分離培養(yǎng)香豬表皮黑素細(xì)胞并進(jìn)行了鑒定,為香豬毛色基因功能研究提供細(xì)胞模型。結(jié)果表明,干擾TYRP1后香豬表皮黑素細(xì)胞中TYR、TYRP1和TYRP2基因mRNA及其編碼蛋白的表達(dá)下調(diào),并且抑制了黑色素的生成。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探究TYRP1對(duì)黑色素生成及沉積的調(diào)控機(jī)制提供了試驗(yàn)參考和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。