季錚渝,倪夢茹,張兆博,趙 趕,黃 贊,李平華,黃瑞華,侯黎明

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,南京 210095)

我國是世界養(yǎng)豬第一大國,生豬出欄和豬肉消費量都常居世界之首。近年來隨著國家經(jīng)濟的迅速發(fā)展,人民生活水平的日益提高,消費者對健康美味豬肉的需求在不斷增加。豬肉品質(zhì)主要受肌內(nèi)脂肪(intramuscular fat,IMF)含量,肌纖維數(shù)量、直徑及類型,風(fēng)味物質(zhì)含量等因素影響,其中,IMF含量與豬肉的感官品質(zhì)和食用品質(zhì)密切相關(guān),直接影響著肉的風(fēng)味、多汁性、嫩度和色澤[1]。因此,提高IMF含量有助于提升豬肉品質(zhì),具有較高的經(jīng)濟價值。

在肌肉早期發(fā)育階段,來源于中胚層的間充質(zhì)干細(xì)胞首先增殖,然后分化為成肌源性譜系細(xì)胞或者成纖維/成脂源性譜系細(xì)胞。成肌源性譜系細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育成肌衛(wèi)星細(xì)胞(muscle satellite cells,MUSCs),成纖維/成脂源性譜系細(xì)胞發(fā)育成FAPs細(xì)胞[2]。Joe等[3]鑒定到FAPs細(xì)胞的特異表面抗原為干細(xì)胞抗原-1(SCA-1)和造血祖細(xì)胞抗原CD34,隨后在小鼠和人類肌肉細(xì)胞中又鑒別到FAPs細(xì)胞的一個特有表面抗原標(biāo)記PDGFRα[4]。Du等[5]利用流式分選肉牛肌肉間質(zhì)血管碎片細(xì)胞(stromal vascular fractions, SVFs)中的PDGFRα陽性細(xì)胞,成功分離出牛FAPs細(xì)胞,并在體外誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞,因此PDGFRα可作為鑒定FAPs細(xì)胞的標(biāo)記蛋白。研究表明,IMF含量主要由肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的數(shù)量和大小決定[6],且FAPs細(xì)胞是小鼠和人[7]肌肉再生過程中肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的主要來源。Kruk等[8]發(fā)現(xiàn),限制安格斯牛維生素A的攝入提高了FAPs的細(xì)胞增殖能力,導(dǎo)致IMF含量和大理石紋相應(yīng)增加,提示FAPs的細(xì)胞增殖能力與IMF含量和大理石紋正相關(guān)。另有研究表明,FAPs細(xì)胞在豬背最長肌的SVFs中所占比重大于半腱肌,背最長肌比半腱肌更早出現(xiàn)肌內(nèi)脂肪且脂肪含量更多[9]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的激活劑噻唑烷二酮在背最長肌的含量顯著高于半腱肌。PPARγ是脂肪生成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,其激活促進(jìn)FAPs向脂肪細(xì)胞分化[10],從而增強了骨骼肌SVFs的脂肪生成,提示增強FAPs細(xì)胞的成脂分化能力能夠提高豬肉中的IMF含量。

蘇淮豬是南京農(nóng)業(yè)大學(xué)養(yǎng)豬研究所自主培育的國家級瘦肉型豬新品種,含有25%的淮豬血統(tǒng)和75%的大白豬血統(tǒng),繼承了大白豬生長速度快和淮豬肉質(zhì)好等優(yōu)良特點。近年發(fā)現(xiàn)蘇淮豬的IMF含量降低,因此利用FAPs細(xì)胞開展與豬IMF沉積相關(guān)的研究,可為通過分子育種技術(shù)提高蘇淮豬豬肉IMF含量及其肉品質(zhì)性狀提供理論基礎(chǔ)。獲得純度比較高的豬FAPs細(xì)胞是開展IMF沉積相關(guān)研究的前提,然而目前鮮有關(guān)于豬FAPs細(xì)胞的研究報道。豬骨骼肌MUSCs和前體脂肪細(xì)胞大多使用差速貼壁法進(jìn)行分離純化[11],FAPs細(xì)胞具有較強的貼壁能力[12],提示也可以通過差速貼壁法對豬FAPs細(xì)胞進(jìn)行分離純化。因此本研究擬利用PDGFRα抗體通過免疫熒光評價不同差速貼壁時間分離的FAPs細(xì)胞的純度,以期確定分離高純度豬FAPs細(xì)胞的最佳差速貼壁時間。然后研究豬FAPs細(xì)胞在體外傳代過程中的成脂能力和基因表達(dá)模式變化,研究結(jié)果有望為開發(fā)能維持豬FAPs細(xì)胞體外成脂能力的培養(yǎng)基配方提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣品 本研究涉及到的動物試驗均經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物管理委員會批準(zhǔn)(許可證號:SYXK(蘇)2017-0031)。本試驗動物為1日齡蘇淮公豬,來源于江蘇省淮安市淮陰新淮種豬場(中國,江蘇,淮安),通過鼻咽拭子采樣進(jìn)行非洲豬瘟核酸檢測為陰性后,帶回實驗室進(jìn)行細(xì)胞分離。

1.1.2 試驗使用儀器及設(shè)備 超凈工作臺,離心機,水浴搖床,CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱,倒置(熒光)顯微鏡,NanoDrop 2000紫外分光光度計,高壓滅菌的剪刀、鑷子、止血鉗、手術(shù)刀柄、刀片,離心管,培養(yǎng)皿(10 cm直徑),T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶等。

1.1.3 試驗試劑 磷酸鹽緩沖液PBS(Hyclone)、DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)、DMEM-F12培養(yǎng)基(Gibco)、澳洲胎牛血清FBS(Gibco)、100×青霉素-鏈霉素溶液(雙抗,Gibco)、胰蛋白酶(Gibco)、谷氨酸鈉GlutaMAX(Gibco)、非必需氨基酸NEAA(Gibco)、丙酮酸鈉SP(Gibco)、胰島素INS(Thermo Fisher)、生長因子bFGF(Gibco)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;I型膠原酶(Sigma)、地塞米松DEX(Sigma)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤IBMX(Sigma)、油紅O染液(Sigma)購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;三碘甲狀腺原氨酸T3(源葉)、吲哚美辛INN(Macklin)、羅格列酮RSG (Macklin)、轉(zhuǎn)鐵蛋白TRF(源葉)、BODIPY(Glpbio)、DAPI(Biosharp)購自南京艾瑞思生物技術(shù)有限公司;生物素Biotin(生工)、泛酸Pantothenic Acid(生工)購自生工生物工程(上海)股份有限公司;anti-PDGFRα抗體(Affinity,Rabbit,AF0241)、Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(Beyotime,A0516)購自南京偉沃生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 蘇淮豬背最長肌混合細(xì)胞的分離及其FAPs細(xì)胞純度的鑒定 將1日齡蘇淮仔豬頸部放血處死后用1%新潔爾滅清洗干凈,用手術(shù)刀沿背中心劃開,剝離脊椎兩側(cè)的背最長肌,用含2%的雙抗PBS清洗2次后,剪碎成泥,使用2倍組織體積的0.28% I型膠原酶水浴振蕩消化1.5～2 h,離心收集組織沉淀,添加3倍體積0.25%胰蛋白酶消化30～45 min。使用孔徑100、70和40 μm的分樣篩依次過濾消化好的組織懸液,收集濾液,加入含10% FBS的DMEM終止消化,離心收集沉淀,PBS清洗后用全價培養(yǎng)基(含1% GlutaMAX、1% NEAA、1% SP、0.02% bFGF、20% FBS、1%雙抗和76% DMEM/F12的培養(yǎng)基)重懸細(xì)胞,移至T25細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)混勻,置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃,5% CO2)中培養(yǎng)。待細(xì)胞差速貼壁不同時間段后(30 min、1 h、90 min、2 h),吸出上清液,添加全價培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),獲得原代細(xì)胞,然后通過anti-PDGFRα免疫熒光檢測FAPs細(xì)胞的純度。

1.2.2 細(xì)胞免疫熒光檢測 將滅菌的細(xì)胞爬片放置于24孔板內(nèi),接種適宜數(shù)量FAPs細(xì)胞。待細(xì)胞融合密度達(dá)60%～80%時,用PBS洗3次;加4%多聚甲醛室溫固定10～15 min,PBS洗3次后加0.3% TritonX-100室溫通透10 min,PBS洗3次后利用5% BSA室溫封閉1 h。添加稀釋后的anti-PDGFRα一抗,4 ℃過夜孵育,PBS洗3次后室溫孵育二抗Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG 1 h,PBS洗3次后加入DAPI避光染色5 min。最后利用抗熒光淬滅劑封片,置于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3 FAPs細(xì)胞誘導(dǎo)分化 6孔板接種適宜數(shù)量FAPs細(xì)胞,待細(xì)胞融合密度大于80%后,用PBS洗3次,每孔加2 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含1 μg·mL-1INS、100 μmol·L-1IBMX、2 μg·mL-1DEX、5 nmol·L-1T3、125 μmol·L-1INN、33 μmol·L-1Biotin、1 μmol·L-1RSG、17 μmol·L-1Pantothenic Acid、1 μg·mL-1TRF、10% FBS、1%雙抗和89% DMEM/F12的培養(yǎng)基),每2 d更換一次誘導(dǎo)培養(yǎng)基。在誘導(dǎo)成脂第4天更換為維持培養(yǎng)基(含1 μg·mL-1INS、5 nmol·L-1T3、1 μmol·L-1RSG、10% FBS、1%雙抗和89% DMEM/F12的培養(yǎng)基)[13],每2 d更換一次維持培養(yǎng)基,直到第8天,完成誘導(dǎo)成脂分化。

1.2.4 油紅O染色 FAPs細(xì)胞誘導(dǎo)成脂分化后用PBS洗3次,添加4%多聚甲醛室溫固定。PBS洗3次后,每孔加入油紅O工作液(使用前將油紅O染液與雙蒸水以3∶2的比例配制成工作液,靜置1 h后用3層過濾紙過濾2～3次,即配即用),避光染色1 h。PBS 洗3次后加入1 mL PBS,在倒置顯微鏡下觀察染色情況。

1.2.5 BODIPY染色 將24孔板內(nèi)誘導(dǎo)成脂分化的FAPs細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫固定,PBS洗3次,每孔加入BODIPY工作液(使用前將BODIPY濃縮液與PBS以1∶2 500的比例進(jìn)行稀釋,即配即用),避光染色15 min,PBS洗3次后加入DAPI避光染色15 min。最后利用抗熒光淬滅劑封片,在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6 甘油三酯含量測定 使用RIPA裂解FAPs細(xì)胞,提取總蛋白,利用BCA法測定蛋白濃度。分別加蒸餾水、校準(zhǔn)品(2.26 mmol·L-1)和樣本各10 μL至1 000 μL酶劑工作液中,37 ℃孵育10 min后使用酶標(biāo)儀分別檢測510 nm處的吸光度,利用如下公式計算甘油三酯含量(mmol·gprot-1):

1.2.7 總RNA提取與質(zhì)量檢測 貼壁細(xì)胞經(jīng)PBS清洗2次后,加入1 mL Trizol渦旋混勻。加入200 μL三氯甲烷顛倒混勻,室溫靜置3 min后離心,吸取上清液約550 μL置于新離心管中。加入等量異丙醇,顛倒混勻后室溫靜置30 min后離心,保留RNA沉淀。75%乙醇洗滌2次,殘留液體吹干后加入適量DEPC水溶解RNA。上下顛倒混勻后55 ℃水浴10 min,迅速置于冰上,使用NanoDrop 2000紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度。

1.2.8 RNA-Seq文庫構(gòu)建與測序 RNA樣品質(zhì)檢合格后進(jìn)行cDNA文庫的構(gòu)建,具體包括RNA反轉(zhuǎn)、cDNA片段化、末端修復(fù)、A尾添加、接頭連接、磁珠純化和PCR富集等步驟,使用Qubit 3.0對文庫定量后,用Agilent Tapestation 2200對文庫片段大小進(jìn)行質(zhì)控,采用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量(文庫有效濃度>2 nmol·L-1)。然后把不同文庫等量混合,利用Illumina平臺進(jìn)行雙端測序(paired-end)。

1.2.9 測序數(shù)據(jù)分析 將測序得到的Raw reads進(jìn)行質(zhì)控,去除帶接頭的、低質(zhì)量的reads,得到Clean reads。使用STAR比對軟件將reads比對到豬Sus Scrofa 11.1參考基因組,然后通過FeatureCounts功能模塊對每個基因的reads數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計,并根據(jù)基因長度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。利用DEseq2軟件鑒別差異表達(dá)基因。差異表達(dá)基因的檢出條件為校正P值(Padj)<0.001且log2(fold change)≥1。依據(jù)差異基因表達(dá)量,利用R軟件Pheatmap程序包對差異基因進(jìn)行聚類分析。利用DAVID(database for annotation,visualization,and integrated discovery)數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分類和KEGG通路富集分析,顯著富集閾值為富集度count≥2且矯正P<0.05。

1.2.10 熒光定量PCR驗證 利用NCBI Primer-BLAST(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)在線工具設(shè)計引物(表1),引物由北京擎科生物科技有限公司合成。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以豬GAPDH基因作為內(nèi)參,對篩選到的差異基因進(jìn)行實時熒光定量檢測。

1.2.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 熒光定量試驗通過2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達(dá)量。所有試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗,使用GraphPad Prism 8軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行圖像化處理。數(shù)據(jù)結(jié)果均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)”表示。

2 結(jié) 果

2.1 評價不同差異貼壁時間分離的豬背最長肌混合細(xì)胞中FAPs細(xì)胞的純度

為了研究不同差速貼壁時間分離的豬背最長肌混合細(xì)胞中FAPs細(xì)胞純度,本研究首先利用酶消化法獲得1日齡蘇淮公豬背最長肌混合細(xì)胞(圖1),在差速貼壁30 min、1 h、90 min和2 h后,使用FAPs細(xì)胞特異表面抗原蛋白PDGFRα抗體,通過免疫熒光對細(xì)胞PDGFRα陽性率進(jìn)行評價。結(jié)果如圖2所示,差速貼壁30 min分離的細(xì)胞中PDGFRα陽性率極顯著高于其余3個試驗組(P<0.001),且隨貼壁時間的增加,分離得到的細(xì)胞中PDGFRα陽性率降低。說明差速貼壁30 min能獲得純度較高的FAPs細(xì)胞,其純度可達(dá)(74.76±2.73)%。

圖1 蘇淮豬背最長肌分離的原代細(xì)胞形態(tài)(100×)Fig.1 The morphology of primary cells isolated from Suhuai pig longissimus dorsi muscle(100×)

A. 差速貼壁30 min細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果(100×);B. 差速貼壁1 h細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果(100×);C. 差速貼壁90 min細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果(100×);D. 差速貼壁2 h細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果(100×);E. 4組差速貼壁時間PDGFRα陽性率比較。藍(lán)色為DAPI細(xì)胞核染色,紅色為PDGFRα染色。橫坐標(biāo)為細(xì)胞差速貼壁時間,縱坐標(biāo)為PDGFRα陽性率,***表示差異極顯著(P<0.001),下同A. Immunofluorescence staining result of 30 min differential adherent cells; B. Immunofluorescence staining result of 1 h differential adherent cells; C. Immunofluorescence staining result of 90 min differential adherent cells; D. Immunofluorescence staining result of 2 h differential adherent cells; E. Comparison of positive rate of PDGFRα in 4 groups of differential adhesion time. Blue show DAPI, nuclear staining, Red show PDGFRα staining. The x-axis represents cell differential adhesion time, the y-axis represents positive rate of PDGFRα,*** indicate P<0.001, the same as below圖2 不同差速貼壁時間對FAPs細(xì)胞純度的影響Fig.2 Effect of differential adhesion time on the purity of FAPs cells

2.2 體外不同代數(shù)蘇淮豬FAPs的PDGFRα陽性率及成脂分化能力的比較

2.2.1 體外不同代數(shù)蘇淮豬FAPs的PDGFRα陽性率比較 在體外培養(yǎng)蘇淮豬FAPs細(xì)胞的過程中,發(fā)現(xiàn)隨著傳代次數(shù)的增加,FAPs的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,并且增殖速度明顯下降。為了評價不同代數(shù)FAPs細(xì)胞的純度,將原代FAPs細(xì)胞(P0)傳代,比較在P1、P3和P5代時FAPs細(xì)胞中的PDGFRα陽性率,結(jié)果如圖3所示。與P1代相比,P3代FAPs細(xì)胞中的PDGFRα陽性率顯著下降(P<0.05),P5代極顯著下降(P<0.01);與P3代相比,P5代極顯著下降(P<0.01),表明FAPs細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中,其純度不斷降低。

A. 不同代數(shù)FAPs細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果(100×);B. 不同代數(shù)FAPs細(xì)胞PDGFRα陽性率比較。藍(lán)色為DAPI細(xì)胞核染色,紅色為PDGFRα染色。橫坐標(biāo)為細(xì)胞代數(shù),縱坐標(biāo)為PDGFRα陽性率,*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01)A. Immunofluorescence staining results of FAPs with different generations (100×); B. Comparison of positive rate of PDGFRα in FAPs of different generations. Blue show DAPI, nuclear staining, Red show PDGFRα staining. The x-axis represents cell generation, the y-axis represents positive rate of PDGFRα antibody, * indicate P<0.05,** indicate P<0.01圖3 體外不同代數(shù)FAPs細(xì)胞PDGFRα陽性率比較Fig.3 Comparison of positive rate of PDGFRα of FAPs cultured in vitro in different generations of Suhuai pig

2.2.2 體外不同代數(shù)蘇淮豬FAPs細(xì)胞成脂分化能力的比較 為評價體外不同代數(shù)蘇淮豬FAPs細(xì)胞成脂分化能力。對P1、P3和P5代FAPs細(xì)胞進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化,分別使用油紅O染液和BODIPY熒光染料對其進(jìn)行脂質(zhì)染色,并收集蛋白進(jìn)行甘油三酯含量檢測,結(jié)果如圖4所示。蘇淮豬P1代FAPs細(xì)胞油紅O染色(圖4A)和BODIPY染色(圖4B)效果均好于P3和P5代細(xì)胞,且甘油三酯含量極顯著高于另兩組(圖4C,P<0.001)。表明P1代FAPs細(xì)胞具有較強的成脂分化能力,在顯微鏡下脂滴清晰可見,且分布比例較高,而P3和P5代的成脂分化能力顯著下降。

2.3 體外不同代數(shù)蘇淮豬FAPs轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)模式對比

2.3.1 體外不同代數(shù)蘇淮豬FAPs轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計 為了研究傳代次數(shù)對蘇淮豬FAPs成脂能力的影響,本研究利用RNA-Seq比較了P1、P3和P5代FAPs細(xì)胞的基因表達(dá)模式,每組3個生物學(xué)重復(fù),收集細(xì)胞后提取RNA,質(zhì)檢合格后構(gòu)建文庫,然后送公司測序。結(jié)果顯示,每個樣品Clean Q30比例均在90%以上,Clean Q20比例均在96%以上,符合生物信息學(xué)分析要求(表2)。

表2 RNA-Seq數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2.3.2 體外不同代數(shù)蘇淮豬FAPs轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)PCA聚類分析 PCA聚類分析顯示(圖5),RNA-Seq送測的每組3個重復(fù)樣品均聚集到一起。表明其重復(fù)性較好。

圖5 體外不同代數(shù)蘇淮豬FAPs測序數(shù)據(jù)PCA聚類分析Fig.5 PCA cluster analysis of sequencing data from FAPs cultured in vitro in different generations of Suhuai pig

2.3.3 體外不同代數(shù)蘇淮豬FAPs細(xì)胞差異表達(dá)基因的鑒定 以Padj<0.001且log2(fold change)≥1為條件,篩選差異表達(dá)基因。P3與P1代FAPs細(xì)胞相比,共鑒定到2 716個差異表達(dá)基因,其中顯著上調(diào)基因1 226個,顯著下調(diào)基因1 490個(圖6A和圖6D);P5與P1代相比,共有3 753個差異表達(dá)基因,其中顯著上調(diào)基因1 787個,顯著下調(diào)基因1 996個(圖6B和圖6E);P5與P3代相比,共有441個差異表達(dá)基因,其中顯著上調(diào)基因349個,顯著下調(diào)基因92個(圖6C和圖6F)。P5與P3代相比,鑒定到的差異基因較少,表明其基因表達(dá)模式更相似。

A. P3與P1代FAPs細(xì)胞差異表達(dá)基因火山圖;B. P5與P1代FAPs細(xì)胞差異表達(dá)基因火山圖;C. P5與P3代FAPs細(xì)胞差異表達(dá)基因火山圖;D. P3與P1代FAPs細(xì)胞差異表達(dá)基因聚類熱圖;E. P5與P1代FAPs細(xì)胞差異表達(dá)基因聚類熱圖;F. P5與P3代FAPs細(xì)胞差異表達(dá)基因聚類熱圖A. The volcano map of DEGs in P3 versus P1; B. The volcano map of DEGs in P5 versus P1; C. The volcano map of DEGs in P5 versus P3; D. Clustering heatmap of DEGs in P3 versus P1; E. Clustering heatmap of DEGs in P5 versus P1; F. Clustering heatmap of DEGs in P5 versus P3圖6 體外不同代數(shù)蘇淮豬FAPs細(xì)胞差異表達(dá)基因火山圖和聚類熱圖Fig.6 Volcano map and clustering heatmap of DEGs from FAPs cultured in vitro in different generations of Suhuai pig

2.3.4 P3與P1代FAPs細(xì)胞差異表達(dá)基因功能富集分析 P3與P1代FAPs細(xì)胞相比,差異上調(diào)基因主要富集于PI3K-AKT、HIF-1、GnRH、FoxO、cGMP-PKG和cAMP等KEGG信號通路(圖7A);鋅離子、ATP結(jié)合、膜構(gòu)成和胞質(zhì)等GO條目(圖7B)。差異下調(diào)基因主要富集于Rap1、DNA復(fù)制、錯配修復(fù)、堿基切除修復(fù)和核苷酸切除修復(fù)等KEGG信號通路(圖7C);轉(zhuǎn)譯、核糖體構(gòu)成、細(xì)胞外隙和鈣離子結(jié)合等GO條目(圖7D)。

2.3.5 P5與P1代FAPs細(xì)胞差異表達(dá)基因功能富集分析 P5與P1代FAPs細(xì)胞相比,差異上調(diào)基因主要富集于軸突導(dǎo)向、粘著斑、PI3K-AKT、Rap1、HIF-1、FoxO和AMPK等KEGG信號通路(圖8A);鋅離子、ATP、Laminin結(jié)合、RNA聚合酶II對轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控、整合素介導(dǎo)的信號通路等GO條目(圖8B)。差異下調(diào)基因主要富集于核糖體、代謝途徑、DNA復(fù)制、錯配修復(fù)、堿基切除修復(fù)和核苷酸切除修復(fù)等KEGG信號通路(圖8C);轉(zhuǎn)譯、核糖體構(gòu)成、線粒體和細(xì)胞核等GO條目(圖8D)。

2.3.6 P3、P5與P1相比共同差異表達(dá)基因富集的KEGG信號通路 鑒于P5和P3代FAPs細(xì)胞的基因表達(dá)模式比較相近,將P3與P1代以及P5與P1代鑒定的差異基因進(jìn)行共有基因分析,發(fā)現(xiàn)1 102個共有差異上調(diào)基因(圖9A),主要富集于PI3K-AKT、HIF-1、FoxO、cGMP-PKG等信號通路(圖9C),其中胰島素受體底物1(IRS1)、叉頭轉(zhuǎn)錄因子3(FOXO3)、表皮生長因子受體(EGFR)、成纖維細(xì)胞生長因子1(FGF1)、細(xì)胞周期素G2(CCNG2)基因在以上通路中富集;共同差異下調(diào)表達(dá)基因1 234個(圖9B),主要富集于DNA復(fù)制、錯配修復(fù)、堿基切除修復(fù)和核苷酸切除修復(fù)信號通路(圖9D),其中集落刺激因子1受體(CSF1R)、信號誘導(dǎo)增殖相關(guān)1型2(SIPA1L2)基因在以上通路中富集。

A. P3與P1(藍(lán)色)和P5與P1(黃色)共有差異上調(diào)表達(dá)基因維恩圖;B. P3與P1(藍(lán)色)和P5與P1(黃色)共有差異下調(diào)表達(dá)基因維恩圖;C. P5與P1和P3與P1共有差異上調(diào)表達(dá)基因KEGG分析氣泡圖;D. P5與P1和P3與P1共有差異下調(diào)表達(dá)基因KEGG分析氣泡圖A. Venn diagram of common up-regulated DEGs both in P3 versus P1 (blue) and P5 versus P1 (yellow); B. Venn diagram of common down-regulated DEGs both in P3 versus P1 (blue) and P5 versus P1 (yellow); C. KEGG analysis bubble map of common up-regulated DEGs both in P5 versus P1 and P3 versus P1; D. KEGG analysis bubble map of common down-regulated DEGs both in P5 versus P1 and P3 versus P1圖9 P3與P1和P5與P1共有差異表達(dá)顯著基因KEGG信號通路Fig.9 KEGG signaling pathways of DEGs both in P3 versus P1 and P5 versus P1

2.3.7 P5與P3代FAPs細(xì)胞差異表達(dá)基因功能富集分析 P5與P3代FAPs細(xì)胞相比,差異上調(diào)基因主要富集于PI3K-AKT、Ras、cGMP-PKG、NOD-like和MAPK等KEGG信號通路(圖10A),其中TNF-α誘導(dǎo)蛋白3(TNFAIP3)、雙調(diào)蛋白(AREG)、成纖維細(xì)胞生長因子1(FGF1)、成纖維細(xì)胞生長因子9(FGF9)基因在以上通路中富集;GO富集分析發(fā)現(xiàn)差異上調(diào)基因主要富集于質(zhì)膜組成、細(xì)胞外隙、Laminin、胰島素樣生長因子結(jié)合、I型干擾素信號通路和非典型Wnt信號通路等條目(圖10B)。

A. P5與P3代FAPs細(xì)胞差異上調(diào)表達(dá)基因KEGG分析氣泡圖;B. P5與P3代FAPs細(xì)胞差異上調(diào)表達(dá)基因GO分析氣泡圖;C. P5與P3代FAPs細(xì)胞差異下調(diào)表達(dá)基因KEGG分析氣泡圖;D. P5與P3代FAPs細(xì)胞差異下調(diào)表達(dá)基因GO分析氣泡圖A. KEGG analysis bubble map of up-regulated DEGs in P5 versus P3; B. GO analysis bubble map of up-regulated DEGs in P5 versus P3; C. KEGG analysis bubble map of down-regulated DEGs in P5 versus P3; D. GO analysis bubble map of down-regulated DEGs in P5 versus P3圖10 P5與P3代FAPs細(xì)胞差異表達(dá)基因KEGG和GO分析氣泡圖Fig.10 KEGG and GO analysis bubble maps of DEGs in P5 versus P3 FAPs cells

差異下調(diào)基因主要富集于脂肪細(xì)胞中脂肪分解的調(diào)節(jié)、VEGF、PPAR、IL-17、cAMP和鞘脂等KEGG信號通路(圖10C),其中過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)、脂質(zhì)運載蛋白2(LCN2)、CCAAT增強子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)基因在以上通路中富集;GO富集分析發(fā)現(xiàn)差異下調(diào)基因主要富集于磷脂酰肌醇3-激酶信號的正向調(diào)控、MAPK級聯(lián)的正向調(diào)控、鞘氨醇-1-磷酸受體和Notch信號通路等GO條目(圖10D)。

2.4 熒光定量PCR驗證

進(jìn)一步對其中7個DEGs進(jìn)行RT-qPCR驗證,如圖11所示,4個基因(IRS1、FGF9、TNFAIP3、AREG)隨細(xì)胞傳代次數(shù)增加表達(dá)量上調(diào),3個基因(CSF1R、C/EBPα、PPARγ)隨細(xì)胞傳代次數(shù)增加表達(dá)量下調(diào),其表達(dá)量變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致。

圖11 體外不同代數(shù)蘇淮豬FAPs差異表達(dá)基因qPCR驗證Fig.11 qPCR verification of DEGs from FAPs cultured in vitro in different generations of Suhuai pig

3 討 論

3.1 關(guān)于豬FAPs細(xì)胞的分離與純化

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn),骨骼肌由肌管細(xì)胞、肌衛(wèi)星細(xì)胞、FAPs細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞類群組成,每類細(xì)胞群在調(diào)節(jié)肌肉的動態(tài)平衡與肌肉再生方面發(fā)揮著不同的作用。在健康的肌肉中,FAPs細(xì)胞并不具有肌肉再生潛力,但其可通過與肌衛(wèi)星細(xì)胞互作來維持肌肉組織穩(wěn)態(tài)并協(xié)助肌衛(wèi)星細(xì)胞應(yīng)對肌肉損傷[14]。

FAPs細(xì)胞位于肌纖維間隙,具有雙重分化潛能,既可以分化為儲存脂肪的脂肪細(xì)胞,又可以分化為表達(dá)I型膠原蛋白的纖維細(xì)胞,研究表明FAPs細(xì)胞在IMF的沉積過程中發(fā)揮重要作用[15]。為在體外研究FAPs細(xì)胞的成脂分化能力,需要分離純度較高的細(xì)胞。目前在人和小鼠上主要使用流式細(xì)胞分選技術(shù)結(jié)合熒光標(biāo)記的特異性抗體來分離鑒定FAPs細(xì)胞[16-18],然而這些流式抗體在豬上的特異性差,難以用于高純度豬FAPs細(xì)胞的分離,因此需要探究其他分離方法。

早期研究利用差速貼壁法在體外成功分離培養(yǎng)了小型豬的脂肪間質(zhì)干細(xì)胞[19]。目前,豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離也采用差速貼壁2 h的方法進(jìn)行純化,有關(guān)FAPs細(xì)胞的分離技術(shù)大部分是基于流式的,是否可通過差速貼壁分離出FAPs細(xì)胞有待研究?？紤]到大部分脂肪細(xì)胞在0.5～3 h內(nèi)即可完成貼壁過程,且30 min內(nèi)貼壁的細(xì)胞數(shù)少,為了盡可能區(qū)分肌衛(wèi)星細(xì)胞,本研究選擇了30 min、1 h、90 min和2 h四個不同的差速貼壁時間,利用FAPs的表面特異抗原PDGFRα對分離的細(xì)胞純度進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示,30 min貼壁的細(xì)胞中PDGFRα陽性率極顯著高于其他3組,后續(xù)成脂分化能力的評價試驗也表明差速貼壁30 min的細(xì)胞符合FAPs的特征,表現(xiàn)出較強的成脂分化能力。因此,采用差速貼壁30 min可獲得純度較高的豬FAPs細(xì)胞,本試驗提供了一種在豬上分離較高純度FAPs的簡便方法。

3.2 關(guān)于體外不同代數(shù)FAPs細(xì)胞基因表達(dá)模式變化的分析

在試驗過程中發(fā)現(xiàn),豬FAPs在體外傳代過程中其增殖速度減慢、成脂分化能力降低,且表型變化主要發(fā)生在P1到P3階段,為研究其原因,利用RNA-Seq比較了不同代數(shù)FAPs細(xì)胞的基因表達(dá)模式變化。

P3與P1代差異基因KEGG分析表明,差異上調(diào)基因主要富集到PI3K-AKT、HIF-1、GnRH、FoxO、cGMP-PKG和cAMP等信號通路,其中PI3K-AKT、HIF-1、FoxO和cGMP-PKG信號通路在P5階段也表達(dá)上調(diào),說明在FAPs細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中,這些通路被激活,其中IRS1、FOXO3、CCNG2、EGFR、FGF1等差異基因在以上通路中富集。研究發(fā)現(xiàn),IRS1絲氨酸殘基的磷酸化可通過激活Ras-MAPK和PI3K-AKT信號級聯(lián)反應(yīng)來抑制AKT的磷酸化激活[20],導(dǎo)致受AKT負(fù)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子FOXO的表達(dá)增加[21]。FOXO可以通過激活細(xì)胞周期抑制因子p27和p21,以及失活細(xì)胞周期

蛋白c-Myc和Cyclin D1來抑制細(xì)胞增殖[22]。CCNG2在非肥胖人群脂肪組織中表達(dá)更高,能誘使生長抑制因子p53高表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯,因此其可作為細(xì)胞周期的抑制因子,負(fù)調(diào)控脂肪細(xì)胞增殖和脂肪細(xì)胞功能[23]。Zhong等[23]首次證明,EGFR-PI3K-AKT-mTOR通路的激活可以在蛋白水平上正向調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)。Regazzetti等[24]研究發(fā)現(xiàn),高水平的HIF-1抑制胰島素受體酪氨酸的磷酸化,從而抑制人脂肪細(xì)胞和3T3-L1脂肪細(xì)胞中的胰島素信號通路,并最終抑制脂肪細(xì)胞分化。Wang等[25]利用吳茱萸胺刺激3T3-L1脂肪細(xì)胞中EGFR的酪氨酸磷酸化,從而激活EGFR-PKCa-ERK信號通路,并發(fā)現(xiàn)脂肪生成受到抑制,因此EGFR能夠通過調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)來抑制脂肪細(xì)胞分化。高濃度的FGF1能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖[26],同時顯著降低組織中脂肪細(xì)胞的數(shù)量[27],并通過激活BMP信號通路來抑制脂肪細(xì)胞的成脂分化[28]。

P3與P1代差異基因KEGG分析表明,差異下調(diào)基因主要富集到DNA復(fù)制、錯配修復(fù)、堿基切除修復(fù)和核苷酸切除修復(fù)等信號通路,這些信號通路在P5階段也表達(dá)下調(diào),其中CSF1R和SIPA1L2基因在以上通路中富集。研究發(fā)現(xiàn),在缺失CSF1R表達(dá)的小鼠中,脂肪細(xì)胞的凋亡速度加快并且增殖受到抑制,在注射CSF1R后脂肪組織的退化得到緩解[29],表明CSF1R對脂肪細(xì)胞的生存和增殖起重要作用。Chen等[30]發(fā)現(xiàn),使用鳶尾素能夠激活Rap1-PI3K-AKT信號通路,其處理組的SIPA1L2表達(dá)水平降低,促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞成骨分化,其后在高脂肪組心臟組織中檢測到SIPA1L2高表達(dá)[31],提示SIPA1L2與脂肪含量存在一定的正相關(guān)性。

此外,P5與P3代相比,在差異上調(diào)基因富集的通路中額外鑒定到NOD-like、MAPK和非典型Wnt信號通路,其中包括TNFAIP3、AREG、FGF1、FGF9差異基因;在差異下調(diào)基因富集的通路中鑒定到VEGF、PPAR、Notch以及IL-17信號通路,其中包括PPARγ、C/EBPα、LCN2差異基因。TNFAIP3在肥胖人群的脂肪細(xì)胞中高表達(dá)[32],體外試驗表明,TNFAIP3可抑制脂肪生成的關(guān)鍵標(biāo)志物AP2的表達(dá),導(dǎo)致分化的3T3-L1細(xì)胞中脂質(zhì)積累減少[33],表明TNFAIP3是一種脂肪生成抑制劑。分離哺乳動物皮下高表達(dá)AREG基因的前體脂肪細(xì)胞群,發(fā)現(xiàn)無論在體外還是在體內(nèi),前體脂肪細(xì)胞都表現(xiàn)出抗脂肪生成功能,后續(xù)的多組學(xué)和功能研究證明AREG通過抑制視黃酸信號通路對PPAR的正向調(diào)控,從而抑制脂肪生成[34]。FGF-FGFR信號傳導(dǎo)可以調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化基因的表達(dá)[35],Huang等[36]研究表明,FGF9與FGFR2相互作用,通過調(diào)節(jié)PPARγ和前脂肪細(xì)胞因子1(Pref1)來抑制山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化。PPARγ是人和小鼠等動物脂肪生成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,能夠直接調(diào)控脂肪細(xì)胞分化和脂類代謝相關(guān)基因的表達(dá)[37]。過表達(dá)PPARγ可使胚胎成纖維細(xì)胞和成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為脂肪細(xì)胞[38]。C/EBPα和PPARγ均是成脂標(biāo)志基因,C/EBPα參與誘導(dǎo)PPARγ的表達(dá),并且C/EBPα和PPARγ都能夠通過正反饋循環(huán)誘導(dǎo)彼此的表達(dá),從而促進(jìn)和維持脂肪細(xì)胞分化狀態(tài)[39]。缺乏C/EBPα?xí)?dǎo)致小鼠體外成脂分化中的胰島素抵抗并阻礙體內(nèi)白色脂肪組織的形成[40]。LCN2是一種在脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)中起作用的細(xì)胞因子,Guo等[41]發(fā)現(xiàn)LCN2的缺乏降低了從小鼠SVFs中分離的脂肪細(xì)胞的分化能力,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)LCN2的降低導(dǎo)致脂肪組織中TGF-β的上升,TGF-β抑制脂肪細(xì)胞成脂的作用增強,說明LCN2在脂肪細(xì)胞分化過程中發(fā)揮正向調(diào)控作用。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn),差速貼壁30 min可從豬背最長肌消化的混合細(xì)胞中獲得純度較高的FAPs細(xì)胞。在體外傳代過程中,豬FAPs細(xì)胞的體外增殖和成脂分化能力均下降。RNA-Seq結(jié)果表明,IRS1、FOXO3、CCNG2、EGFR、FGF1基因的表達(dá)隨著FAPs細(xì)胞傳代次數(shù)增加持續(xù)上調(diào),這些基因可抑制細(xì)胞的增殖和成脂分化能力,并使細(xì)胞表現(xiàn)出向成纖維細(xì)胞分化的趨勢;再者,CSF1R和SIPA1L2基因的表達(dá)隨著FAPs細(xì)胞傳代次數(shù)增加持續(xù)下降,潛在的抑制了FAPs細(xì)胞的增殖。通過比較FAPs細(xì)胞P3到P5代的轉(zhuǎn)錄模式,發(fā)現(xiàn)可抑制成脂分化的TNFAIP3、AREG、FGF1、FGF9基因表達(dá)上調(diào),而可促進(jìn)成脂分化的LCN2以及成脂標(biāo)記基因PPARγ和C/EBPα基因表達(dá)下調(diào),提示這一階段成脂分化能力進(jìn)一步降低。綜上所述,FAPs細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中發(fā)生了較大的基因表達(dá)模式的改變,研究結(jié)果有望為開發(fā)能維持豬FAPs細(xì)胞體外成脂能力的培養(yǎng)基配方提供參考。