胡紫平,王立剛,宗文成,侯任達(dá),蘇艷芳,牛乃琪,王立賢,王 源,張龍超*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193;2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,青島 266109)

中國(guó)是世界上地方豬品種遺傳資源最豐富的國(guó)家之一[1]。許多中國(guó)地方豬種有著自己獨(dú)特的特點(diǎn),如產(chǎn)仔數(shù)高[2]、抗病力強(qiáng)[3]及抗逆性強(qiáng)[4]等。但是由于商品豬種的引入,導(dǎo)致本土豬品種的生存空間減少,許多本土豬品種的數(shù)量和群體規(guī)模都急劇下降,遺傳資源瀕臨滅絕[5]。因此,評(píng)估本土豬種的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)勢(shì)在必行,以開發(fā)基于基因的選擇工具和品種保護(hù)。隨著單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)芯片和重測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,可以分析個(gè)體的基因型信息[6],構(gòu)建個(gè)體或群體間的遺傳關(guān)系,這極大的幫助了中國(guó)本土豬種選育和保種工作。近年來,基于SNP芯片和重測(cè)序數(shù)據(jù)分析,對(duì)金華豬[7]、寧鄉(xiāng)豬[8]、江曲海豬[9]、安慶六白豬[10]和萊蕪豬[11]等一些品種進(jìn)行了遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)的研究,有助于推動(dòng)遺傳資源的研究和保護(hù)。Wang等[12]對(duì)江西省3個(gè)地方品種東鄉(xiāng)斑點(diǎn)豬、萍鄉(xiāng)兩頭烏、玉山黑豬的研究發(fā)現(xiàn),東鄉(xiāng)斑點(diǎn)豬和玉山黑豬最近經(jīng)歷了嚴(yán)重的近親繁殖。這兩個(gè)品種顯示出較大的純合度值,連鎖不平衡的長(zhǎng)程范圍和觀察到的雜合度降低。相比之下,萍鄉(xiāng)兩頭烏遺傳多樣性豐富,近交個(gè)體少。Meng等[13]利用全基因組SNP芯片數(shù)據(jù)分析閩豬保守種群的遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),閩豬保護(hù)種群的遺傳多樣性水平不足,近5代中,保守種群近親繁殖程度顯著提高,有效種群含量大幅下降。由于歐洲商品豬種的滲入,以及育種過程的不科學(xué),有必要構(gòu)建閩豬核心保護(hù)種群的分子譜系。

劍白香豬是我國(guó)珍貴的豬品種遺傳資源,原產(chǎn)于貴州省黔東南苗族侗族自治州劍河縣,是小型豬的代表豬種[14]。劍白香豬頭部、尾部為黑色,中間白色,稱之為兩頭烏;耳尖下垂、腹部微凹,四肢短小,總體體型矮小,故而當(dāng)?shù)赜址Q之為蘿卜豬[14]。劍白香豬具有肉質(zhì)細(xì)嫩,肉香味美的特點(diǎn)[15],是我國(guó)重要的遺傳資源之一。受非洲豬瘟影響,劍白香豬能繁母豬的規(guī)模從2018年以前的500頭以上迅速銳減至如今的150頭以下,種業(yè)安全受到極大威脅。并且,對(duì)于劍白香豬當(dāng)前群體結(jié)構(gòu)的研究尚未見報(bào)道。因此,本研究利用SNP芯片信息,對(duì)劍白香豬當(dāng)前群體的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析,以便掌握劍白香豬群體的遺傳現(xiàn)狀,為劍白香豬種質(zhì)資源保護(hù)提供理論依據(jù),也為劍白香豬的種業(yè)安全和群體復(fù)壯提供重要的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以貴州省黔東南苗族侗族自治縣南寨鎮(zhèn)、柳川鎮(zhèn)、岑松鎮(zhèn)和磻溪鎮(zhèn)養(yǎng)殖戶養(yǎng)殖的138頭劍白香豬(母豬119頭,公豬19頭)為研究對(duì)象,采集耳組織樣本并放入冷凍保存管中,后迅速放入-20 ℃冰箱中保存,用“苯酚-氯仿法”提取樣品DNA。

1.2 基因分型和質(zhì)量控制

利用Porcine SNP50 BeadChip(Illumina, United States)芯片對(duì)138個(gè)劍白香豬DNA樣品進(jìn)行全基因組SNPs檢測(cè),累計(jì)得到50 697個(gè)SNPs用于后續(xù)分析。使用plink(v1.90)進(jìn)行SNP數(shù)據(jù)質(zhì)量控制,質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)如下:剔除個(gè)體缺失率>10%的個(gè)體;剔除SNP缺失率>10%的個(gè)體;剔除最小等位基因頻率<5%的個(gè)體;剔除性染色體上的SNPs。質(zhì)控后共獲得了137個(gè)劍白香豬個(gè)體的基因型數(shù)據(jù),得到19 518個(gè)SNPs用于后續(xù)分析。

1.3 方法

1.3.1 主成分回歸分析 PCA(principal component analysis,PCA)又稱主成分回歸分析或主分量分析, 在統(tǒng)計(jì)學(xué)中采用降維思想, 將多變量轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個(gè)綜合變量, 能夠簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)集, 在多元統(tǒng)計(jì)分析中是一種重要的統(tǒng)計(jì)方法, 選出主成分以有效利用大量數(shù)據(jù)并降低工作量[16]。所謂主成分就是通過原始變量的線性組合形成的數(shù)個(gè)綜合指標(biāo)。目前,PCA已廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè),已成為研究畜禽品種分類、來源和進(jìn)化、選育以及各種生產(chǎn)性能的重要工具。使用GCTA(v1.93)來計(jì)算劍白香豬的前10個(gè)主成分,然后使用前兩個(gè)主成分用R(v4.2)腳本來構(gòu)建散點(diǎn)圖。

1.3.2 遺傳距離分析 遺傳距離是一個(gè)物種之間或種群之間的遺傳差異的程度,它是由不同個(gè)體從共同祖先分化的時(shí)間和程度決定的。IBS全稱Identity By State, 又叫做狀態(tài)一致,指兩個(gè)或兩個(gè)以上的個(gè)體具有相同的等位基因序列,IBS遺傳距離可以衡量群體內(nèi)個(gè)體間的相似性,評(píng)價(jià)彼此的親緣關(guān)系[17]。IBS只考慮個(gè)體之間遺傳標(biāo)記或等位基因的相似性,而不管他們是否來自同一祖先。因此,不需要親本基因分型?；贗BS的遺傳距離仍然可以在沒有譜系或祖先樣本信息的情況下分析群體的遺傳關(guān)系。使用plink(v1.90)來計(jì)算IBS距離,并使用R(v4.2)腳本來構(gòu)建熱圖。

1.3.3 親緣關(guān)系分析 親緣關(guān)系是指兩特定材料的遺傳相似度與任意材料之間的遺傳相似度的相對(duì)值。其不僅是評(píng)價(jià)種群遺傳結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵參數(shù),也是育種中選擇和品種保護(hù)的依據(jù)。本研究基于SNPs芯片數(shù)據(jù),利用plink(v1.90)、GCTA(v1.93)構(gòu)建親緣關(guān)系矩陣(G矩陣)。結(jié)果利用R(v4.2)可視化。

1.3.4 系統(tǒng)發(fā)育分析 雄性個(gè)體是保護(hù)種群譜系構(gòu)建的主要載體。因此,對(duì)雄性個(gè)體進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,并確定它們之間的親屬關(guān)系。按照選育原則,在種群遺傳育種過程中三代不相關(guān),按個(gè)體間的親緣系數(shù)小于0.062 5的標(biāo)準(zhǔn)劃分家系。使用plink(v1.90)計(jì)算IBD值,基于鄰接法,使用MEGA(v11.0)軟件對(duì)公豬個(gè)體進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.3.5 ROH分析 通過plink(v 1. 90)軟件檢測(cè)基因組上出現(xiàn)的一定數(shù)量和密度SNPs表現(xiàn)為純合的區(qū)域,即為連續(xù)性純合片段(ROH)。主要參數(shù)如下:20個(gè)SNPs的滑動(dòng)窗口沿染色體滑動(dòng)、每個(gè)滑動(dòng)窗口的雜合子個(gè)數(shù)不超過1個(gè)、最小長(zhǎng)度>500 kb、兩個(gè)SNPs最大間隔1 000 kb、SNP個(gè)數(shù)/ROH>30、最小SNP密度>100 kb/SNP[18]。然后用R(v4.2)基于ROH計(jì)算近交系數(shù)(FROH),基于ROH從基因組數(shù)據(jù)測(cè)量純合度定義為ROH覆蓋的基因組總長(zhǎng)度除以SNP或序列覆蓋的基因組總長(zhǎng)度,如下所示[19]:

式中,∑LROH為一個(gè)個(gè)體中檢測(cè)到的所有ROH的總長(zhǎng)度之和,LAUTO為常染色體基因組總長(zhǎng)度。

2 結(jié) 果

2.1 主成分分析

劍白香豬群體的主成分分析是利用GCTA計(jì)算,PCA圖(圖1)則用計(jì)算結(jié)果的第一個(gè)主成分和第二個(gè)主成分繪制。從圖中可以看出,劍白香豬群體的個(gè)體有較好的分散,大致可以劃分為3個(gè)部分,主要原因是由于樣本采自幾個(gè)不同的場(chǎng)區(qū);分析中PC1和PC2主成分可以解釋的遺傳變異分別為11.90%和7.95%。19頭種公豬未見明顯聚集,這表明劍白香豬群體結(jié)構(gòu)無(wú)明顯分層。

圖1 劍白香豬PCA分析結(jié)果Fig.1 PCA analysis results of Jianbai Xiang pig

2.2 遺傳距離和親緣關(guān)系分析

基于IBS值計(jì)算劍白香豬個(gè)體間的遺傳距離(1-Dst)和親緣系數(shù),構(gòu)建遺傳距離矩陣和親緣關(guān)系(G)矩陣,并可視化(圖2和圖3)。結(jié)果顯示,群體內(nèi)個(gè)體間的遺傳距離范圍為0.000 02～0.355 37,平均值為0.273 0±0.015 8,證明該群體大部分個(gè)體間的遺傳距離較大(圖2中偏紅及深紅的方格),少數(shù)個(gè)體的遺傳距離較近(圖2中偏白的方格)。大部分的劍白香豬個(gè)體間的親緣關(guān)系程度中等(圖3中偏藍(lán)的方格),小部分個(gè)體間的親緣關(guān)系較近(圖3中偏白及偏黃的部分)。IBS距離矩陣和G矩陣的結(jié)果表明部分個(gè)體存在近交風(fēng)險(xiǎn),配種時(shí)需注意近交情況的出現(xiàn)。

圖中每一個(gè)小方格代表第一個(gè)到最后一個(gè)個(gè)體兩兩之間的遺傳距離,該值越大(即兩個(gè)個(gè)體的遺傳距離越大)小方格越接近紅色,反之越接近黃色 Each small square in the figure represents the genetic distance between two individuals from the first to the last one. The larger the value (the greater the genetic distance between the two individuals), the closer the squares are to red, and the closer the genetic distance between the two individuals is to yellow圖2 遺傳距離矩陣可視化結(jié)果Fig.2 Visualization results of genetic distance matrix

圖中每一個(gè)方格代表第一個(gè)到最后一個(gè)個(gè)體兩兩之間的親緣關(guān)系值,該值越大越接近橙色,反之越接近藍(lán)色Each square in the figure represents the value of the relationship between the two individuals from the first to the last one. The larger the value, the closer it is to orange, and vice versa圖3 親緣關(guān)系G矩陣可視化結(jié)果Fig.3 Visualization results of genetic relationship G matrix

2.3 基于劍白香豬公豬的進(jìn)化樹分析

基于19頭劍白香豬公豬的遺傳距離用plink(v1.90)及MEGA(v11.0)軟件進(jìn)行聚類分析,并采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,分析劍白香豬群體中公豬的家系結(jié)構(gòu)。以親緣系數(shù)為0.062 5作為劃分家系的閾值。閾值的設(shè)置是基于不同的公豬血統(tǒng)其3代內(nèi)沒有親緣關(guān)系,若3代內(nèi)有親緣關(guān)系即為近交個(gè)體,其近交系數(shù)為0.031 25;若個(gè)體間沒有近交,其近交系數(shù)至少應(yīng)為0.031 25,那么親緣系數(shù)應(yīng)小于0.062 5[20]。結(jié)果如圖4所示,19頭公豬共劃分為4個(gè)家系,每個(gè)家系內(nèi)的公豬數(shù)量不等,從左至右分別為2、5、3、9個(gè)。

圖中數(shù)字代表公豬樣品編號(hào),紅線代表親緣系數(shù)值為0.062 5The numbers in the figure represent the number of the boar sample, the red line represents a coefficient of affinity value of 0.062 5圖4 19頭公豬遺傳距離聚類圖Fig.4 Clustering diagram of genetic distance of 19 boars

2.4 ROH分析

ROH長(zhǎng)度和頻率可反映群體歷史。ROH越長(zhǎng)表示親緣關(guān)系越近,長(zhǎng)的ROH片段越多表明家系內(nèi)存在近交的可能性越高。從全基因組水平對(duì)劍白香豬群體進(jìn)行ROH分析,137頭劍白香豬共檢測(cè)到了2 893個(gè)ROHs,個(gè)體ROH的平均長(zhǎng)度約為7.18 Mb;所有ROHs的范圍在0.92～86.86 Mb之間,主要集中在0.9～5.0 Mb之間(占58.17%)(圖5A);從染色體上分析,ROH集中分布較為平均,其中14號(hào)染色體的ROH數(shù)量最多,為268個(gè),占9.26%,此外,未在18號(hào)染色體上檢測(cè)到ROH(圖5B)。對(duì)劍白香豬個(gè)體分析,個(gè)體ROH數(shù)量在5～38個(gè)之間(圖5C),劍白香豬個(gè)體ROH的總長(zhǎng)度分布在11.79～458.75 Mb之間,平均ROH總長(zhǎng)度約為151.63 Mb(圖5D)?；贔ROH的結(jié)果表明,劍白香豬群體平均近交系數(shù)為0.27%。

3 討 論

本研究基于SNP芯片基因型數(shù)據(jù),依次通過PCA、遺傳距離矩陣、G矩陣、NJ聚類,對(duì)該劍白香豬群體進(jìn)行了群體結(jié)構(gòu)分析。本試驗(yàn)從4個(gè)方面分析了劍白香豬的群體結(jié)構(gòu),從主成分分析中可以看出劍白香豬群體是一個(gè)沒有明顯分層的群體。群體內(nèi)個(gè)體間的遺傳距離范圍在0.000 02～0.355 37之間。劍白香豬遺傳距離的平均值約為0.273 0±0.015 8,高于丫杈豬和青峪豬,低于藍(lán)塘豬和馬身豬,分別是0.259 5±0.028 8、0.260 4±0.025 2、0.284 2±0.046 5和0.332 6±0.033 9[21-24],這表明劍白香豬群體具有中等的遺傳距離,但部分個(gè)體具有較近的親緣關(guān)系。公豬對(duì)于一個(gè)群體的繁衍十分重要,家系的劃分都是以公豬為主,若某個(gè)群體的公豬只有一個(gè)家系,隨著世代的增加和閉鎖繁育,會(huì)導(dǎo)致近交系數(shù)增大,種群的多樣性下降[17],進(jìn)而導(dǎo)致種群出現(xiàn)衰退嚴(yán)重甚至面臨滅絕。本試驗(yàn)結(jié)合遺傳距離將19頭劍白香豬公豬分為4個(gè)家系,以親緣系數(shù)0.062 5作為劃分家系的閾值,劃分的標(biāo)準(zhǔn)是三代以內(nèi)無(wú)近交,即近交系數(shù)小于0.031 25,親緣關(guān)系大于0.062 5。

目前,ROH已經(jīng)成為評(píng)估種群近親繁殖的常用方法[25-26],不同長(zhǎng)度ROH片段可以分別區(qū)分古代和近代的近親繁殖歷史[27]。ROH普遍存在于受選擇強(qiáng)度密集的基因組區(qū)域內(nèi),一般來說,選擇強(qiáng)度大的品種具有更長(zhǎng)、更多的ROH[28]。中國(guó)豬的平均ROH長(zhǎng)度差異很大,從金華豬的最低值4.11 Mb到滇南小耳豬的最大值168 Mb[12,29]。本研究中,劍白香豬的ROH平均值為7.18 Mb。與其他品種相比,閩豬的ROH平均值為9.31 Mb[13]、通城豬為23.71 Mb[20],劍白香豬的ROH處于較低水平,可能存在較遠(yuǎn)世代的近親交配。

本研究所得的近交系數(shù)是基于ROH片段計(jì)算出的近交系數(shù),相對(duì)基于其他類型的基因組或系譜信息所得出的近交系數(shù)更為可靠[30]。此次研究中劍白香豬群體的平均近交系數(shù)值為0.27%。Wang等[31]在研究里岔黑豬的遺傳多樣性時(shí),計(jì)算其群體平均近交系數(shù)為0.11[31];Yuan等[32]研究通城豬的遺傳多樣性時(shí),排除了兄弟姐妹對(duì)FROH的影響并計(jì)算出對(duì)于41個(gè)沒有同胞個(gè)體的FROH為0.04%[32];Liu等[33]分析梁山豬的種群遺傳結(jié)構(gòu),基于ROH計(jì)算的近交系數(shù)顯示,全種群的平均值為0.026;戴麗荷等[34]在利用SNP標(biāo)記研究淳安花豬群體時(shí)平均近交系數(shù)值為0.199。本研究中劍白香豬的近交系數(shù)處于中等偏低的水平,表明該劍白香豬群體的遺傳多樣性較高。

4 結(jié) 論

本研究使用Porcine SNP50 BeadChip(Illumina, United States)芯片對(duì)138個(gè)劍白香豬樣本進(jìn)行基因分型,首先利用PCA分析大致了解該群體的遺傳結(jié)構(gòu),分析結(jié)果表明群體內(nèi)的個(gè)體有較好的分散,公豬未見明顯的聚集;IBS遺傳距離分析以及基于G矩陣的親緣關(guān)系分析結(jié)果顯示劍白香豬群體的遺傳距離和親緣關(guān)系中等;NJ聚類分析將19頭公畜劃分為4個(gè)家系,家系之間不存在重復(fù)出現(xiàn)的個(gè)體?；赗OH分析,該劍白香豬群體的平均ROH長(zhǎng)度和FROH處于較低水平,表明群體內(nèi)最近較少出現(xiàn)近親交配的現(xiàn)象;FROH處于較低水平,表明該劍白香豬群體的遺傳多樣性較豐富。