戴 文,卞蘇舒,,張聚民,宋厚輝,周瑩珊,劉 萍*,王曉杜*

(1.浙江農(nóng)林大學動物科技學院·動物醫(yī)學院 浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖應(yīng)用技術(shù)研究重點實驗室 動物健康互聯(lián)網(wǎng)檢測技術(shù)浙江省工程研究中心 浙江省動物醫(yī)學與健康管理國際科技合作基地 中澳動物健康大數(shù)據(jù)分析聯(lián)合實驗室,杭州 311300;2.杭州市臨安區(qū)畜牧農(nóng)機發(fā)展中心,杭州 311300)

腸缺氧(intestinal hypoxia)是由不同因素(如失血、感染、炎癥或腫瘤等)導致的腸組織氧氣需求量高于供應(yīng)量的病理現(xiàn)象[1]。缺氧是造成細胞損傷的主要原因之一[2-3],會誘發(fā)腸道組織代謝、功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變,是動物感染性腹瀉、腸梗阻、腸扭轉(zhuǎn)、炎性腸病以及腸腫瘤等疾病中主要的誘發(fā)因素、預警信號和關(guān)鍵病理特征[4-6]。生理狀態(tài)下,腸黏膜上皮位于厭氧腸腔和血液循環(huán)豐富、氧氣供應(yīng)較充足的腸黏膜層之間,形成了腸黏膜上皮中陡峭變化的氧梯度[1,7]。腸腔內(nèi)的腸道菌群通過短鏈脂肪酸等代謝產(chǎn)物介導氧敏感性靶點和腸道上皮屏障功能的調(diào)控,保證了腸黏膜組織氧含量的相對平衡[8]。隨著禽畜養(yǎng)殖規(guī)?；图s化程度的提高,飼料污染、抗生素濫用、腸道傳染病、代謝、應(yīng)激和畜舍環(huán)境不佳等因素會直接或間接造成動物腸組織氧穩(wěn)態(tài)的破壞,引起不同程度的腸缺氧[9-12],輕則影響動物腸道消化吸收,重則導致動物死亡,嚴重影響了動物福利以及養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟效益。因此,建立真實可靠的腸缺氧狀態(tài)的動物模型或者能模擬腸缺氧的細胞模型,對動物腸缺氧疾病的病理及臨床研究至關(guān)重要。目前,國內(nèi)尚無動物腸缺氧模型的系統(tǒng)報道,本文就近年來腸缺氧模型的構(gòu)建方法作一綜述,為腸缺氧研究提供參考。

1 腸缺氧動物模型

腸缺氧動物模型能比較全面的反映腸缺氧動物機體的系統(tǒng)性變化。目前,腸缺氧動物模型主要有循環(huán)性腸缺氧、化學性腸缺氧和環(huán)境性腸缺氧三類(表1)。在腸缺氧動物模型的建立過程中,可通過對實驗動物的腸道疾病活動指數(shù)、腸黏膜通透性、腸組織微觀形態(tài)病理變化等指標進行評估,以及檢測低氧誘導因子(hypoxia-inducible factor,HIF)等氧穩(wěn)態(tài)核心調(diào)控因子含量[13],從多個層面評估該模型是否建立成功[11,14-15]。

表1 腸缺氧動物模型

1.1 循環(huán)性腸缺氧動物模型

循環(huán)性腸缺氧動物模型建立的原理是將實驗動物的腸系膜上動脈(superior mesenteric artery,SMA)暫時性或永久性閉塞,以減少腸道局部血流量,可造成小腸、結(jié)腸和盲腸缺氧。目前,此法是最常用的誘導腸道缺血損傷的方法[15]。其構(gòu)建方法是對實驗動物進行開腹手術(shù),暴露右腹腔和主要負責回腸、盲腸和近端結(jié)腸供血的SMA,根據(jù)試驗目的對SMA進行暫時性閉塞(用非創(chuàng)傷性微血管鉗)或者永久性閉塞(結(jié)扎)一定時間,待腸系膜搏動停止、腸道變白后即可認定SMA閉塞,即成功建立了循環(huán)性腸缺氧動物模型,其具體缺血時間可通過預試驗和損傷評分確定。有些循環(huán)性腸缺氧動物模型還會涉及到對缺氧動物SMA暫時性閉塞后再灌注,可在模型建立之前對試驗動物靜脈注射肝素,以防止SMA內(nèi)血栓形成,確保在拆除非創(chuàng)傷性微血管鉗進行再灌注時可重新建立循環(huán)。Murthy等[21]研究發(fā)現(xiàn),當SMA阻斷60 min,缺氧大鼠的結(jié)腸血管通透性上調(diào)了3倍,腸黏膜通透性上調(diào)16倍。在Ji等[22]的研究中,大鼠SMA阻斷60 min后,小腸絨毛損傷嚴重,而泛素特異性蛋白酶22與腸缺氧損傷后細胞增殖和組織再生密切相關(guān)。Yin等[35]對腸缺血再灌注小鼠(SMA缺血45 min;再灌注90 min)進行了單細胞RNA測序,鑒定了4萬多個細胞中的9個主要細胞群,新發(fā)現(xiàn)了多個亞群細胞,為腸缺氧疾病中細胞異質(zhì)性和細胞通訊等研究提供了數(shù)據(jù)支持。Deng等[18]的研究表明,SMA缺血再灌注的小鼠結(jié)腸微生物群組成發(fā)生變化,擬桿菌門和厚壁菌門相對豐度增加,而疣狀分枝桿菌豐度降低。Deng等[19]通過代謝組學研究發(fā)現(xiàn),SMA缺血再灌注(SMA缺血60 min;再灌注2 h)小鼠的次生代謝產(chǎn)物以及多糖生物合成和代謝途徑的基因組豐度都顯著降低。Dai等[36]對腸缺血再灌注大鼠模型(SMA閉塞120 min;再灌注6/72 h)進行了系統(tǒng)性多組學研究,發(fā)現(xiàn)腸缺氧大鼠腸道屏障受損,腸道內(nèi)容物泄漏進入外周血和遠端器官,引起全身性炎癥反應(yīng),且伴隨著腸道代謝物和腸道微生物群組成的明顯改變。此法能較好模擬腸缺氧狀態(tài),可靠性較高,但對操作者的技術(shù)要求較高,且造模時間過長容易誘發(fā)全身性病變。一旦SMA結(jié)扎時間過長,其對腸道的損傷不可修復,甚至可能誘發(fā)肺部實質(zhì)性損傷和呼吸衰竭,必要時需切除閉塞腸段[37]。腸道過度缺氧會引起毛細血管通透性增加和間質(zhì)水腫,在移除止血鉗時,缺氧時產(chǎn)生的黃嘌呤氧化酶會促使大量活性氧生成,誘導炎性因子產(chǎn)生和細胞凋亡,加重腸黏膜損傷[12,24]?？紤]到腸道血流恢復后會造成進一步的實質(zhì)性損傷,研究者應(yīng)當在止血鉗移除前完成組織樣品采集。動物臨床中,循環(huán)性腸缺氧發(fā)生在多種腸道疾病和腸外疾病中,如壞死性小腸或結(jié)腸炎、腸疝、腸扭轉(zhuǎn)、腸套疊、機械性腸梗阻、嚴重腸脹氣、急性腸系膜缺血、失血性休克以及心肺疾病導致的血栓阻塞等[15]。因此,在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域,循環(huán)性腸缺氧動物模型普遍適用于由腸道供血不足導致的動物急性腸缺氧疾病及其防治策略研究。如Gao等[23]的研究發(fā)現(xiàn),L-半胱氨酸能有效改善腸缺血再灌注(SMA閉塞45 min;再灌注4 h)導致的C57BL6/J小鼠回腸腸肌層神經(jīng)元損傷。Parlar和Arslan[25]研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇有效改善了腸缺血再灌注(SMA閉塞30 min;再灌注150 min和24 h)誘導的大鼠腸道功能障礙,逆轉(zhuǎn)了腸平滑肌收縮能力受損,降低了MPO、IL-1β和TNF-α等炎性因子的表達。

1.2 化學性腸缺氧動物模型

化學性腸缺氧動物模型建立的原理是:使血液中的低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白,引起高鐵血紅蛋白癥,進而降低腸道局部氧供應(yīng)。其構(gòu)建方法是給實驗動物口服強氧化劑亞硝酸鈉,待亞硝酸鈉進入消化系統(tǒng)并吸收入血引起高鐵血紅蛋白癥,導致腸道氧供應(yīng)不足,即可建立化學性腸缺氧動物模型。Ansari等[29]的研究發(fā)現(xiàn),給實驗動物口服60 mg·kg-1BW的亞硝酸鈉24 h后,大鼠十二指腸損傷明顯,主要表現(xiàn)為腸黏膜局灶性壞死和充血,伴隨固有層淋巴細胞浸潤,而抗氧化劑肌肽和N-乙酰半胱氨酸可以保護腸道免受亞硝酸鈉誘導的損傷。在Khatun等[30]的研究中,使用光譜漫反射法以非接觸性方式監(jiān)測了不同劑量亞硝酸鈉誘導的體內(nèi)高鐵血紅蛋白濃度和氧飽和度水平,用以評估高鐵血紅蛋白期間的低氧血癥。此法的優(yōu)點在于監(jiān)測方便,且對動物創(chuàng)傷較小,但對監(jiān)測設(shè)備要求較高,而且亞硝酸鈉對人體有毒性,操作者在使用過程中要注意安全防護。同時,低劑量的亞硝酸鈉在酸性環(huán)境下會被還原生成一氧化氮,因此要充分考慮動物敏感性和使用劑量。在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域,由于農(nóng)業(yè)中氮肥的過度使用、工業(yè)廢物的不當處理以及大氣氮污染,極大增加了養(yǎng)殖過程中動物對亞硝酸鹽的接觸和攝入,導致不同程度的生理和神經(jīng)功能障礙[29]。因此,化學性腸缺氧動物模型適用于(環(huán)境或飼料中)亞硝酸鹽不當攝入或其他因素誘發(fā)的高鐵血紅蛋白癥導致的動物腸缺氧疾病及其防治策略研究,應(yīng)用范圍相對局限。

1.3 環(huán)境性腸缺氧動物模型

環(huán)境性腸缺氧動物模型的建立原理是通過降低動物飼養(yǎng)環(huán)境的氣壓和氧氣含量,減少腸組織氧氣供應(yīng)以誘發(fā)腸缺氧。其構(gòu)建方法有兩種,一是高原實地造模;二是采用低壓氧艙設(shè)備模擬高海拔高原環(huán)境。造模過程中,當實驗動物出現(xiàn)焦躁不安、鼻唇和四肢末梢輕微發(fā)紺以及呼吸急促等缺氧表現(xiàn)時,則判斷環(huán)境性缺氧動物模型構(gòu)建成功[38]。在Cheng等[39]的研究中,將C57BL/6J小鼠放置在海拔4 010 m的高原(青海玉樹)進行實地造模,發(fā)現(xiàn)高海拔環(huán)境能引起小鼠結(jié)腸組織顯著缺氧,出現(xiàn)結(jié)腸隱窩間距增大、黏膜上皮脫落以及緊密連接蛋白表達降低等一系列腸屏障破壞的表現(xiàn),并伴隨HIF-1α表達的增加。因此,高原實地造模能較好模擬低氧低壓環(huán)境誘導的腸缺氧,但其不足之處在于耗時耗力、成本較高,且容易誘發(fā)腸外的肺水腫、腦水腫或心血管疾病。因此,低壓氧艙造模法對于非高原地區(qū)的研究者來說可操作性更強,重復性較好,且造模效果比較接近自然條件下缺血缺氧的病理性過程。羅涵[32]研究發(fā)現(xiàn),低壓艙模擬海拔7 000 m低壓性缺氧環(huán)境即有良好的腸缺氧造模效果,能有效誘導SD大鼠腸損傷及細菌移位,其主要表現(xiàn)為腸道微絨毛損傷、上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞間緊密連接破壞以及細胞內(nèi)各細胞器損傷。赫玉寶[34]在模擬急進高原缺氧研究中發(fā)現(xiàn),隨著海拔升高(3 000、4 500和6 000 m)和缺氧造模時間延長(24、48和72 h),缺氧大鼠的腸損傷情況逐漸加重。在環(huán)境性腸缺氧動物模型建立過程中,需注意造模時間的控制,以免造模時間過長導致腦損傷。大腦是機體中耗氧量最高的器官,對長期缺氧的耐受性較低[40-42],但在急進入高原環(huán)境后,機體會經(jīng)歷一定的高原習服狀態(tài)(如心臟供血能力上升),短暫的缺氧暴露(1 d內(nèi))不會造成顯著的腦水腫和認知功能障礙[34]。造模結(jié)束后應(yīng)在操作者能夠適應(yīng)的最大海拔高度進行現(xiàn)場取材,以盡可能減少降壓后采樣對檢測指標的影響。在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域,環(huán)境性腸缺氧動物模型適用于低壓低氧環(huán)境下(如高原氣候)動物的腸缺氧疾病,或因跨地域運輸引起的養(yǎng)殖環(huán)境所處海拔、氣壓和氧濃度變化而誘發(fā)的動物急性腸缺氧疾病及其防治策略研究,亦可應(yīng)用于心肺疾病和休克等多器官功能障礙導致的腸缺氧損傷機制研究。如李龍等[43]研究了益生菌對高原缺氧環(huán)境下肉雞生產(chǎn)性能、腸道消化酶活性和腸道形態(tài)的影響,證明益生菌(LactobacillusplantarumJM113菌株)可以提高缺氧肉雞腸道中的消化酶活性,并改善腸道形態(tài),為益生菌作為抗高海拔低氧環(huán)境日糧添加的研究提供了理論基礎(chǔ)。

2 離體腸細胞缺氧模型

傳統(tǒng)的腸缺氧動物模型研究能較好模擬動物體內(nèi)腸缺氧的系統(tǒng)性變化,但其受影響因素較多、成本較高,且操作更復雜和耗時。研究人員逐漸將目光轉(zhuǎn)移到離體腸細胞缺氧模型,通過物理法或化學法改變細胞培養(yǎng)環(huán)境中氧氣含量或者降低細胞對氧氣的利用率,以穩(wěn)定誘導離體腸細胞缺氧模型(表2)。建立離體腸細胞缺氧模型過程中,可通過細胞形態(tài)學觀察,檢測細胞活力、無氧酵解過程中產(chǎn)生的乳酸脫氫酶(LDH)活性和HIF等指標,衡量離體腸細胞缺氧模型建立的情況[8,44-45]。

表2 離體腸細胞缺氧模型

2.1 物理法誘導腸細胞缺氧模型

三氣培養(yǎng)箱法:此法的構(gòu)建方法是將腸組織細胞置于密閉缺氧環(huán)境(如1% O2、94% N2和5% CO2)的三氣培養(yǎng)箱中,模擬不同程度的缺氧環(huán)境,以制造離體腸細胞缺氧模型。此法能較好地模擬體內(nèi)腸缺氧環(huán)境,操作簡便,是目前最常用的物理法誘導細胞缺氧的方法。將腸上皮細胞置于三氣培養(yǎng)箱低氧環(huán)境(O2含量1%或者5%)中培養(yǎng)6 h即可造成細胞缺氧性反應(yīng)[46-47]。如Gao等[48]采用腸上皮細胞IEC-6誘導腸上皮細胞缺氧損傷模型(5% CO2,95% N2環(huán)境中培養(yǎng)12 h/24 h),探究了耗牛乳源性外泌體miRNA緩解腸屏障應(yīng)激的機制。張秀楊等[49]采用結(jié)腸腺癌細胞系Caco-2誘導腸上皮細胞缺氧模型(1% O2,5% CO2,94% N2環(huán)境中培養(yǎng)12 h;復氧2 h),研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α蛋白誘導腸上皮細胞單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白1的表達,介導了短鏈脂肪酸對腸屏障的保護。如今,隨著培養(yǎng)箱制造工藝的不斷進步,可做到實時監(jiān)控三氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)液溶解氧濃度變化,并及時反饋和調(diào)節(jié)特定試驗條件下培養(yǎng)箱的氧氣供給,以維持培養(yǎng)液溶解氧的恒定濃度,能更好地模擬體內(nèi)腸缺氧狀態(tài)。但此改進方案成本較高,且不能保證脫離培養(yǎng)箱后的試驗環(huán)境保持在持續(xù)的低氧/無氧狀態(tài),細胞培養(yǎng)瓶一旦離開培養(yǎng)箱后細胞容易造成復氧,導致造模失敗。目前還有一種選擇是使用更大的配備手套箱的缺氧培養(yǎng)箱,可在持續(xù)的缺氧環(huán)境中完成細胞缺氧誘導,然而相應(yīng)設(shè)備購置和維護費用也更加高昂。如果研究涉及對氧依賴性蛋白HIF-1的檢測,需嚴格做到檢測流程的快速和高效。

安寧包法:通過安寧包缺氧系統(tǒng)實現(xiàn)物理誘導細胞缺氧,該系統(tǒng)由安寧包和密閉培養(yǎng)盒組成,通過安寧包氧化降解吸收O2生成CO2,達到降低密閉環(huán)境中O2含量的目的。Fachi等[52]采用分離的腸先天淋巴樣細胞(ILC3)誘導細胞缺氧模型(安寧包缺氧環(huán)境中培養(yǎng)3 h),發(fā)現(xiàn)缺氧環(huán)境促進了ILC3的增殖和激活。此法較三氣培養(yǎng)箱法的設(shè)備要求低,操作簡便,但其不足之處在于無法精確監(jiān)測氧氣含量?？梢愿鶕?jù)不同試驗需求,選擇不同厭氧規(guī)格的安寧包。安寧包在使用1 h后可將密閉培養(yǎng)罐中的氧氣含量降低至0.1%,且不改變培養(yǎng)基pH[65]。通過密閉培養(yǎng)盒內(nèi)氧氣指示劑的顏色變化,來判斷培養(yǎng)環(huán)境缺氧程度。

2.2 化學法誘導腸細胞缺氧模型

氯化鈷法:此法目前公認的作用原理是氯化鈷(CoCl2)中氧親和力較低的Co2+可以取代脯氨酸羥化酶(PHDs)中的Fe2+,導致常氧狀態(tài)下HIF降解被抑制,并激活了下游一系列缺氧相關(guān)信號通路[66]。在細胞培養(yǎng)液中添加一定濃度的氯化鈷,就可以導致細胞缺氧。此法作用機制與氧濃度無關(guān),造模效果較物理法更穩(wěn)定,且操作簡便,成本低廉,重復性良好,常用于腸細胞缺氧模型的構(gòu)建。但需要注意的是,CoCl2對人體或細胞有潛在危害,在操作過程中需注意安全防護。羅紅敏[54]的研究采用Caco-2細胞系構(gòu)建體外腸上皮細胞缺氧模型(1 mmol·L-1CoCl2作用24 h),檢測到細胞HIF-1α蛋白表達顯著升高,并證實了丙戊酸鈉通過抑制HIF-1表達以及下調(diào)下游靶蛋白肌球蛋白輕鏈激酶和血管內(nèi)皮生長因子表達,延長失血、燒傷及膿毒性休克動物生存時間。Xie和Collins[53]采用大鼠腸上皮細胞IEC-6誘導了細胞缺氧模型(200 μmol·L-1CoCl2作用60 h),揭示了缺氧條件下腸上皮細胞銅轉(zhuǎn)運atp酶(Atp7a)的調(diào)控機制。

連二亞硫酸鈉法:連二亞硫酸鈉是一種氧清除劑,能迅速清除培養(yǎng)液中的溶解氧[45,67]。2 mmol·L-1連二亞硫酸鈉培養(yǎng)液可維持培養(yǎng)液的無氧狀態(tài)1 h左右[67]。其主要機制與激活興奮性氨基酸N-甲基-D-天冬氨酸受體有關(guān),促使氧自由基大量蓄積,使細胞存活率、酶性自由基清除劑超氧化物歧化酶活性下降,引起細胞氧化功能障礙導致缺氧[3]。此法有著操作簡便、成本低廉的優(yōu)點,但連二亞硫酸鈉對人體或細胞有潛在危害,在試驗操作過程中需注意安全防護。Dong等[59]研發(fā)了一種可靠的活細胞內(nèi)實時連二亞硫酸鈉可視化熒光成像技術(shù),可用于細胞內(nèi)缺氧情況的實時監(jiān)測。同時,Tian等[60]設(shè)計并合成了針對二亞硫酸鈉造成的缺氧具有高靈敏度和選擇性的熒光探針,并采用連二亞硫酸鈉誘導人結(jié)直腸癌細胞HCT116缺氧模型,熒光成像監(jiān)測細胞缺氧情況,為“腸-肝軸”相關(guān)疾病病理機制及其治療研究提供支持。

HIF調(diào)節(jié)劑法:HIF是介導細胞缺氧的核心轉(zhuǎn)錄因子,其蛋白表達和基因轉(zhuǎn)錄水平的上升是細胞缺氧模型構(gòu)建成功與否的核心指標。HIF的化學調(diào)節(jié)劑如二甲基草酰甘氨酸(DMOG)或去鐵胺可通過抑制以HIF為靶點的脯氨酰羥化酶(PHDs)降解,穩(wěn)定HIF并促進其在胞漿中不斷蓄積,向細胞核轉(zhuǎn)移并激活下游基因的轉(zhuǎn)錄,模擬細胞缺氧過程中的一系列信號通路激活[66,68-69]。如在Muenchau等[50]的研究中,采用DMOG作用6 h誘導了人結(jié)腸腺癌肺轉(zhuǎn)移細胞T84缺氧模型,細胞能穩(wěn)定表達HIF-1α/2α。Zeitouni等[64]采用腸上皮細胞Caco-2誘導腸細胞缺氧模型(450 μmol·L-1DMOG作用7 h),研究了缺氧對小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌侵襲腸上皮細胞的影響,發(fā)現(xiàn)DMOG處理與缺氧環(huán)境(1% O2)對耶爾森氏菌侵襲的影響類似,都減少了耶爾森氏菌侵襲并降低了β整合素蛋白表達。此法操作簡單,但在試驗設(shè)計時需要充分考慮HIF調(diào)節(jié)劑對細胞有無毒性作用,是否會存在非氧依賴性途徑參與細胞調(diào)控,影響造模效果。

3 離體腸道類器官缺氧模型

腸道類器官作為新興實驗模型,是干細胞或含有干細胞的隱窩在體外不斷增殖分化形成的三維細胞復合體[70],能高度模擬腸上皮組織,較好地保留了與腸上皮組織相似的形態(tài)表型、組織細胞功能和生物學行為[71-72]。近年來,腸道類器官在腸道營養(yǎng)學、病理生理學、毒理學和藥理學等領(lǐng)域顯示出巨大的應(yīng)用前景,其引入可以極大地減少實驗動物的使用,具有積極的倫理意義[70-71,73]。近年來,研究者在腸缺氧研究領(lǐng)域也有采用腸道類器官的嘗試(表3)。建立離體腸道類器官缺氧模型過程中,可通過腸道類器官形態(tài)學觀察、活力檢測、LDH活性、E-cadherin(上皮細胞標記物)、富含亮氨酸重復序列G蛋白偶聯(lián)受體5(LGR5,干細胞標記物)、嗜鉻粒蛋白A(CGA,神經(jīng)內(nèi)分泌細胞標記物)、溶菌酶(LYZ,潘氏細胞標記物)和黏蛋白(MUC,杯狀細胞標記物)、緊密連接蛋白(如Occludin、ZO-l)、Ki67(增殖標記物)以及HIF-1等指標,來衡量離體腸道類器官缺氧模型建立的情況[71,74]。如Hill等[75]建立人類多能干細胞來源的人腸道類器官缺氧模型(1% O2環(huán)境中培養(yǎng)24 h),研究了人腸道類器官與人類腸道的相似性。在Deng等[16]的研究中,以小腸類器官和Ⅱ型先天淋巴樣細胞(ILC2)共培養(yǎng)模型為材料,建立腸道類器官缺氧/復氧模型(缺氧12 h;復氧4 h),證實了腸道微生物代謝產(chǎn)物普伐他汀介導IL-33/ST2信號通路促進ILC2釋放IL-13從而減輕腸道缺血再灌注損傷的機制。Kip等[76-77]建立人腸道類器官缺氧模型(小于1% O2環(huán)境中培養(yǎng)12 h;復氧30/120 min),基于蛋白質(zhì)組學技術(shù)研究了缺氧對人腸道類器官的影響,及未折疊蛋白反應(yīng)在其中發(fā)揮的作用。De Lange等[78]建立人腸道類器官缺氧模型(1% O2環(huán)境中培養(yǎng)24/48 h),研究了缺氧驅(qū)動的腸道類器官模型變化及水解乳清的保護作用。Koike等[79]建立小鼠腸道類器官缺氧損傷模型(5% O2環(huán)境中培養(yǎng)48 h),研究了羊水干細胞對腸道缺血再灌注損傷的作用機制。Walaas等[80]建立人結(jié)腸類器官缺氧模型(2% O2環(huán)境中培養(yǎng)14 d),研究了生理性缺氧對人腸道上皮類器官的生長和功能分化的影響。結(jié)合腸道類器官技術(shù),基于離體腸細胞缺氧模型的多種建立方法,可以穩(wěn)定誘導離體腸道類器官缺氧模型。

表3 動物腸道類器官缺氧模型

4 展 望

目前,國內(nèi)外對于腸缺氧模型的研究較少,此模型仍有研究和發(fā)展的空間。當下對具體缺氧程度的評定還沒有一個公認的“金標準”,臨床上往往僅區(qū)分開輕度和中度缺氧[81],這對結(jié)構(gòu)和功能都相對復雜的腸道來說,無疑增加了一定的造模難度和評價標準。而且腸缺氧不是一個單獨的病理現(xiàn)象,現(xiàn)有的腸缺氧模型構(gòu)建條件大多比較單一,不足以充分反映真實的腸缺氧病理特征。理想并可靠的實驗模型應(yīng)具備重復性好、可操作性強,以及病變發(fā)展盡可能與動物疾病過程相似等特點。研究人員需要根據(jù)自己的研究目的擇優(yōu)選擇,采用適當?shù)脑囼炛笜藖泶_定缺氧模型是否構(gòu)建成功。動物缺氧模型中,除了文中提及的三種模型,常壓缺氧模型也較為常用。與低壓缺氧模型相比,實驗動物對常壓缺氧的耐受時間更長,但這類模型往往以腦缺氧和心肌缺氧為關(guān)鍵觀察指標,缺少腸缺氧相關(guān)試驗數(shù)據(jù)支撐[82-83]。同時,創(chuàng)傷(如燒傷)亦可使全身血流重新分配,導致腸道缺血缺氧。有研究發(fā)現(xiàn),用酒精灌胃小鼠4 h后并誘導Ⅲ級燒傷,能觀察到小鼠缺氧誘導因子表達的增加和腸屏障功能的損傷[84-85],但此類方法有著較大的動物福利相關(guān)爭議。此外,利用造血系統(tǒng)尚未成熟的新生小鼠多次采血也能間接誘導腸道屏障破壞和腸缺氧,此法對幼齡小鼠的多次放血亦不符合動物福利的要求[86-87],故皆不多做討論。試驗方案的可選擇性往往比研究者想象的大,研究者應(yīng)該利用這種多樣性,并充分考慮試驗的人道性和可行性,選擇合適的試驗方案[88]。在過去十年中,畜禽腸道類器官的培養(yǎng)方法已在豬、牛、兔、馬、羊和雞中開發(fā)出來[89],但目前關(guān)于畜禽動物腸道類器官缺氧模型領(lǐng)域的研究相對空白,未來可基于高度還原腸道功能的畜禽動物腸道類器官構(gòu)建腸缺氧模型。相信隨著相關(guān)領(lǐng)域的進一步發(fā)展,腸缺氧模型會突破當前研究所面臨的困難和限制,在動物腸道病生理機制研究和動物腸道健康保障中發(fā)揮重要作用。