楊志梅,梁成成,張殿琦,李雪峰,昝林森,2*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院,楊凌 712100;2.國家肉牛改良中心,楊凌 712100)

非編碼RNA(long non-coding RNA、micro-RNA、circRNA)作為轉(zhuǎn)錄后重要的調(diào)控因子,參與多種生物代謝過程。1976年環(huán)狀RNA首次作為類病毒被報道,并于1979年首次用電子顯微鏡在人類HeLa細胞中觀察到[1-2]。CircRNA由pre-RNA通過反向剪接使5′尾端和3′polyA端通過共價結(jié)合的形式形成環(huán)狀RNA,通常由100到4 000個核苷酸組成的,包含2到5個的外顯子,它們主要存在于真核生物的細胞質(zhì)中[3-4]。在非編碼RNA研究早期,由于circRNA在細胞中的表達量少,被人們認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄“噪音”而忽視。現(xiàn)隨著circRNA各方面技術(shù)的成熟,大量的circRNA作為真核生物蛋白編碼基因的產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)。此外,circRNAs可以作為信使,在不同的組織、發(fā)育階段和細胞條件下攜帶不同類型的時空生物信息。circRNA具有序列保守性、時序表達特異性和組織表達特異性,相較于mRNA有更強的穩(wěn)定性,不易被RNase降解[3]。

早在1970年,m6A就已被報道。同DNA和組蛋白的甲基化一樣,細胞中的m6A修飾是一個動態(tài)可逆過程,受到多種蛋白的調(diào)節(jié),包括甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物(writers)、m6A去甲基酶(erasers)和m6A閱讀蛋白(readers)[5]。m6A修飾的發(fā)生是RNA的腺嘌呤核苷第6位氮原子發(fā)生甲基化。m6A作為主要的表觀遺傳修飾,其在真核生物中廣泛存在,并且參與機體生物各個生物學(xué)過程[6]。近幾年報道m(xù)6A也影響circRNA的穩(wěn)定性、翻譯、出核以及circRNA的免疫反應(yīng)等過程,同時circRNA也可以通過影響甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基酶以及閱讀蛋白進而調(diào)控m6A修飾[7-9]。本文闡述了circRNA的生物學(xué)合成、作用機制及m6A修飾對circRNA的調(diào)控作用,以期為研究circRNA提供新的思路。

1 circRNA的生物合成機制

在真核生物中,pre-mRNA會經(jīng)歷一個去除內(nèi)含子并將外顯子連接成mRNA 的“規(guī)范剪接”過程。circRNA的形成與mRNA形成類似,pre-mRNA通過“反向剪接”形成共價環(huán)狀RNA[10]。環(huán)狀RNA的形成可與pre-mRNA的“規(guī)范剪接”在先后順序上相互競爭,且這種競爭存在組織特異性和物種保守性[11]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有3種機制可以驅(qū)動環(huán)狀RNA的形成,即套索驅(qū)動環(huán)化、內(nèi)含子驅(qū)動環(huán)化和RNA結(jié)合蛋白(RNA-bindings proteins, RBPs)驅(qū)動環(huán)化。CircRNA可由外顯子和內(nèi)含子產(chǎn)生,即外顯子產(chǎn)生的稱為外顯子RNA(ecRNA),內(nèi)含子產(chǎn)生的為內(nèi)含子RNA(ciRNA),外顯子和內(nèi)含子共同產(chǎn)生的為外顯子-內(nèi)含子RNA(ElciRNA),ecRNA和ciRNA主要存在于細胞質(zhì)中而 ElciRNA 主要存在于細胞核中[12-13]。

1.1 套索驅(qū)動環(huán)化

外顯子套索環(huán)化形成的機制有兩種。一是在RNA轉(zhuǎn)錄過程中,部分RNA發(fā)生折疊,相鄰的外顯子5′供體和3′受體結(jié)合形成套索結(jié)構(gòu),套索結(jié)構(gòu)形成后將內(nèi)含子剪切,最終形成包含2或3個外顯子的環(huán)狀RNA[14]。二是pre-mRNA相鄰的兩個內(nèi)含子互補配對,進而拉近相應(yīng)外顯子的距離,使得外顯子5′供體和3′受體結(jié)合形成套索結(jié)構(gòu),再剪切內(nèi)含子,最終形成circRNA。這些被剪切后的內(nèi)含子會被外切酶降解。然而,當(dāng)pre-mRNA的一個外顯子附近有富含7 nt鳥嘌呤(G)和尿嘧啶(U)的序列、另一個外顯子附近富含11 nt胞嘧啶(C)的序列時,在套索驅(qū)動的環(huán)化反應(yīng)中,內(nèi)含子可以避免被降解并環(huán)化形成環(huán)狀RNA[15]。酵母基因組很少有重復(fù)序列,因此套索驅(qū)動環(huán)化是酵母基因組環(huán)狀RNA形成的主要機制。在酵母基因Mrsp1中,已經(jīng)證明環(huán)狀RNA是由套索驅(qū)動形成的[16]。

1.2 內(nèi)含子驅(qū)動環(huán)化

內(nèi)含子含有反向互補的順式作用元件,如ALU序列,通過堿基互補直接配對,使pre-mRNA的剪接位點在空間上相互靠近,形成不去內(nèi)含子的ElciRNA或去內(nèi)含子的ecRNA。Jeck等[12]首次發(fā)現(xiàn),哺乳動物circRNA中有重復(fù)片段ALU,特別是在反方向上富集,因此推測內(nèi)含子重復(fù)片段ALU促進RNA環(huán)化。其后Kramer等[17]發(fā)現(xiàn)果蠅laccase2 基因的環(huán)化受內(nèi)含子重復(fù)序列ALU和反式剪接因子調(diào)控。進一步為內(nèi)含子重復(fù)片段促進RNA環(huán)化提供證據(jù)。后研究又證實circRNA的形成主要由側(cè)翼內(nèi)含子ALU序列決定,破壞ALU序列的堿基配對可抑制環(huán)狀RNA的生成[18]。內(nèi)含子包含多個重復(fù)序列,存在堿基配對競爭性,因此內(nèi)含子重復(fù)序列不總驅(qū)動環(huán)化[19]。其次只有不同內(nèi)含子的重復(fù)序列發(fā)生堿基配對才能產(chǎn)生環(huán)狀RNA,單個內(nèi)含子內(nèi)部發(fā)生堿基配對時會發(fā)生“規(guī)范剪接”產(chǎn)生線性RNA[19]。

1.3 RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding proteins, RBPs)驅(qū)動環(huán)化

RBPs可以識別并錨定內(nèi)含子中的特定基因序列,并通過蛋白質(zhì)相互作用或形成二聚體,在附近的外顯子兩端形成剪接位點,使剪接受體和剪接供體之間共價連接[20]。Quaking (QKI)屬于含有KH結(jié)構(gòu)域的RNA結(jié)合蛋白STAR家族,能夠結(jié)合單個RNA分子的兩個區(qū)域,因此QKI可以使pre-mRNA外顯子靠近形成環(huán)狀RNA[21]。在上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition ,EMT)過程中,Conn等[20]發(fā)現(xiàn)許多環(huán)狀RNA的形成主要由 QKI調(diào)控,QKI與位于pre-mRNA剪接位點附近的識別元件結(jié)合形成二聚體,從而誘導(dǎo)環(huán)狀RNA的形成。與QKI類似的是Drosophila Muscleblind (MBL)蛋白,MBL蛋白同樣與自身pre-mRNA中的內(nèi)含子識別元件特異性結(jié)合,拉近剪接位點的距離,以促進環(huán)狀RNA的產(chǎn)生,從而內(nèi)源性調(diào)節(jié)宿主基因的表達[11]。除RBPs驅(qū)動環(huán)化的作用外,RBPs還可作用于內(nèi)含子重復(fù)序列,抑制環(huán)狀RNA的生成。NF90/NF110和 RNA解旋酶(DHX9)作用于內(nèi)含子并且以 “中間體”的形式招募RNA腺苷脫氨酶(ADAR),ADAR使腺苷轉(zhuǎn)化為肌苷,從而影響環(huán)狀RNA的形成[22]。

2 circRNA的作用機制

2.1 circRNA海綿miRNA

circRNA的功能之一是海綿miRNA,形成circRNA-miRNA-mRNA的競爭性內(nèi)源RNA網(wǎng)絡(luò)(competing endogenous RNA, ceRNA),直接或間接調(diào)控靶基因[23]。成熟的miRNA通常在細胞質(zhì)中形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC),與靶標(biāo)mRNA的3′UTR堿基配對,影響mRNA的穩(wěn)定性,抑制其翻譯。CircRNA 可作為miRNA的“海綿”吸附miRNA從而間接調(diào)控靶基因的表達[24]。circRNA-miRNA-mRNA形成的ceRNA網(wǎng)絡(luò)廣泛存在各種真核生物中。研究表明擬南芥中檢測到5%的circRNA具有海綿miRNA的能力[25]。水稻中約25%的circRNA海綿miRNA[26],玉米中約20%的circRNA海綿miRNA[27]。同樣地,circRNA在動物生長發(fā)育中也多發(fā)揮海綿作用(表1)。前體脂肪細胞的分化是影響動物脂肪沉積的主要因素,Wang等[28]利用高通量測序技術(shù)在前體脂肪細胞分化0和3 d篩選出141個表達差異的circRNAs,并且發(fā)現(xiàn)circ-PLXNA1通過海綿miR-214調(diào)控動物脂肪細胞的分化。肌肉組織是機體最豐富的組織,約占總體重的50%。肌細胞的增殖、分化是影響肌肉組織生長發(fā)育的主要因素。Yan等[29]發(fā)現(xiàn),bta-circ-03789-1以及 bta-circ-05453-1通過海綿miRNA調(diào)控肉牛背長肌的發(fā)育。

表1 circRNA的功能:海綿miRNA

2.2 與RNA結(jié)合蛋白相互作用

RBPs在基因表達中發(fā)揮關(guān)鍵作用,參與組織發(fā)育和紊亂。RBPs組裝核糖核蛋白(RNP)復(fù)合物,與特定的順式調(diào)控元件相互作用,從而結(jié)合RNA序列并影響RNA的表達和功能[43]。RBPs可以與circRNA相互作用,并在circRNA剪接、加工、折疊、穩(wěn)定和定位中發(fā)揮作用[44]。MBL可以觸發(fā)補體激活和抗原調(diào)理。circMBL側(cè)翼內(nèi)含子中含有保守的MBL結(jié)合位點。因此MBL結(jié)合蛋白可以和circMBL結(jié)合,影響circMBL外顯子的環(huán)化率。反過來,circMBL的表達異常會影響 MBL的靶mRNA的形成,并調(diào)節(jié)親本基因的轉(zhuǎn)錄[11]。含有雙鏈RNA結(jié)合域的免疫因子NF90/NF110結(jié)合域是circRNA生物發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。NF90/NF110通過與內(nèi)含子RNA相互作用促進細胞核中環(huán)狀RNA的產(chǎn)生,同時NF90/NF110也與細胞質(zhì)中的成熟環(huán)狀RNA相互作用動態(tài)調(diào)控circRNA的穩(wěn)定[22]。Li等[22]研究表明,病毒感染細胞后,環(huán)狀RNA表達降低,部分原因是NF90/NF110核輸出到細胞質(zhì)從而影響到circRNA的生成。circRNA可以競爭性地與RBPs結(jié)合,通過充當(dāng)RBPs的海綿、RBPs組裝平臺和超級轉(zhuǎn)運體連接的特定成分而調(diào)節(jié)RBPs功能[45]。在細胞周期進程中,CDK2與周期蛋白A(Cyclin A)和周期蛋白E(Cyclin E)相互作用以促進細胞周期的進入,p21則抑制CDK2和Cyclin A、Cyclin E的相互作用并阻止細胞周期進程。circ-Foxo3的異常表達可以結(jié)合 CDK2和p21形成circ-Foxo3-p21-CDK2三元復(fù)合物,因此阻礙了CDK2的功能并抑制細胞周期進程[46]。丙酮酸激酶作為糖酵解的三大限速酶之一包括了4種同工酶,其中m2型丙酮酸激酶 (PKM2)主要表達于快速增殖的細胞。賴氨酸去甲基化酶8 (lysine demethylase 8, KDM8)可直接與PKM2相互作用,誘導(dǎo)PKM2二聚體調(diào)控糖代謝[47-48]。Song等[49]發(fā)現(xiàn),過表達ZCRB1促進ALU介導(dǎo)的circHEATR5B的形成。此外,circHEATR5B編碼的新蛋白HEATR5B-881aa可以直接和賴氨酸去甲基化酶8的同源物 JMJD5相互作用。敲除JMJD5可增加PKM2的活性,抑制糖酵解和GBM細胞的增殖。

2.3 circRNA翻譯作用

核糖體掃描機制假說認(rèn)為mRNA的翻譯是由eIF4F復(fù)合物啟動的帽依賴翻譯。CircRNA呈環(huán)狀,無3′polyA和5′帽端,因此被認(rèn)為不參與RNA的翻譯。之后隨著翻譯需要內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)及circRNA存在IRES位點的發(fā)現(xiàn),說明circRNA可以被翻譯。circRNA上的IRES位點可以直接被eIF4G蛋白識別從而啟動翻譯。在此基礎(chǔ)上,許多研究表明,當(dāng)5′帽依賴的起始機制被阻斷時,IRESs也可以翻譯特定類型的mRNA[50]。IRES依賴機制在翻譯過程中發(fā)揮作用的同時也受到IRES反式作用因子(ITAF)和特定蛋白質(zhì)的調(diào)控[51],Yang等[52]發(fā)現(xiàn)P27的TP53調(diào)節(jié)器TRMP(TP53-regulated modulator of p27, TRMP)通過競爭p27 mRNA與多聚嘧啶區(qū)結(jié)合蛋白1 (PTBP1)的結(jié)合來抑制依賴IRES p27的翻譯。不存在IRES的circRNA有一個相同的序列“RACH”(R=G、A;H=A、C、U),RACH中含有m6A修飾結(jié)構(gòu),YTHDF3可以識別m6A修飾位點并能招募eIF4G2到m6A從而起始circRNA翻譯[53]。同線性RNA一樣,circRNA能編碼出有獨立功能的蛋白質(zhì)[54]。circZNF609在人和小鼠肌肉發(fā)育中差異性表達,并且具有物種保守性。circZNF609含有從起始密碼子開始到終止密碼子結(jié)束的753 nt開放閱讀框,可以通過IRES起始翻譯,編碼蛋白質(zhì)[55-56]。circ-AKT3可以編碼一個由174個氨基酸組成的蛋白質(zhì)AKT3-1744aa,該蛋白質(zhì)在BMC細胞中可發(fā)揮作用,當(dāng)過表達AKT3-174aa時,抑制BMC細胞的增殖,輻射抗性等[54]。circPPP1R12A同樣含有216 nt開放閱讀框,可以編碼出一個由74個氨基酸組成的蛋白質(zhì)circPPP1R12A-73aa,該蛋白質(zhì)可促進結(jié)腸癌細胞的增殖和代謝[56]。

2.4 circRNA轉(zhuǎn)錄作用

非編碼RNA的一個中心作用是調(diào)控基因表達。EciRNA位于細胞核中能與U1 snRNP相互作用形成RNA-RNA復(fù)合物,該復(fù)合物能與親本基因啟動子上的Pol II轉(zhuǎn)錄復(fù)合物相互作用而調(diào)控親本基因的轉(zhuǎn)錄[57]。其次在細胞核中,circRNA可以與親本基因形成RNA-DNA雜交鏈或R-loop環(huán)進而調(diào)控宿主基因的表達。Conn等[58]報道擬南芥中來源于SEPALLATA3 第6個外顯子的環(huán)狀RNA可與同源的DNA位點形成R-loop環(huán)導(dǎo)致親本基因轉(zhuǎn)錄終止。而線性RNA與同源DNA的結(jié)合力很弱。Xu等[59]發(fā)現(xiàn),circSMARCA5在乳腺癌細胞系和乳腺癌樣本中表達明顯降低,且circSMARCA5是直接與宿主基因形成R-loop環(huán)導(dǎo)致宿主基因第15個外顯子的轉(zhuǎn)錄終止,而非其他研究所述是作為miRNA的海綿發(fā)揮作用的。Feng等[60]發(fā)現(xiàn),circ0005276和靶基因XIAP在前列腺癌樣中表達上調(diào),circ0005276可以正向調(diào)控XIAP的表達并且circ0005276和XIAP能以協(xié)同作用促進前列腺癌細胞的增殖、遷移等。其次在機制上,Feng等[60]研究認(rèn)為circ0005276與FUS結(jié)合蛋白相互作用,從而激活XIAP的轉(zhuǎn)錄。Chen 等[61]在肝癌組織中發(fā)現(xiàn)一種功能性的circRNA(cia-MAF)可以結(jié)合到MAFF啟動子上從而招募TIP60復(fù)合物到MAFF,促進MAFF表達。

3 m6A修飾

DNA的甲基化已被證明可發(fā)揮多種作用。隨著2011年RNA表觀遺傳學(xué)的提出,RNA的甲基化逐漸進入大眾視野。目前發(fā)現(xiàn)RNA的修飾接近170種,這也被認(rèn)為是“外延組學(xué)”[62]。其中m6A是真核生物RNA中最豐富的修飾之一,約占所有修飾的60%。m6A修飾在mRNA、tRNA、rRNA、miRNA 等不同類型的RNA中被證實是轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控標(biāo)記物[63]。m6A是一種存在于許多真核生物中的可逆轉(zhuǎn)錄組修飾。在RNA的翻譯、剪接、染色體易位、染色體高度螺旋中起重要作用[64],其次越來越多的研究表明m6A在基因表達、細胞增殖、免疫反應(yīng)等過程起調(diào)控作用[65-67]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展,2012年第一次在轉(zhuǎn)錄組中檢測到m6A。Dominissini等[68]利用m6A-seq技術(shù)在超過7 000個基因轉(zhuǎn)錄本種檢測出超過12 000個m6A修飾位點。m6A修飾位點通常在終止密碼子和3′ UTR附近富集,與mRNA 的3′ UTR位點有關(guān)聯(lián)[69]。現(xiàn)有的m6A位點檢測技術(shù)有RNA甲基化免疫共沉淀(MeRIP)、MAZTER-seq、DART-seq、PA-m6A-seq、miCLIP等。MAZTER-seq和DART-seq技術(shù)可以量化單個位點的m6A[70-71]。這些m6A檢測技術(shù)的發(fā)展為m6A修飾提供了重要的技術(shù)支撐,同時也為m6A修飾非編碼RNA提供重要技術(shù)支撐。

3.1 甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物(writers)

甲基化修飾一般情況下在細胞核中發(fā)生,但在一些特殊的情況下也可以在細胞質(zhì)中發(fā)生[72]。甲基化實現(xiàn)的過程是腺苷甲硫氨酸作甲基供體,在甲基復(fù)合酶復(fù)合物(MTC)的作用下完成。甲基酶復(fù)合物的組分有METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429、RBM15/RBM15B、含CCH結(jié)構(gòu)的鋅指蛋白(ZC3H13)等。METTL3及METTL14形成一個穩(wěn)定的二聚體,在哺乳動物體內(nèi)高度保守[73]。WTAP蛋白作為載體,在KIAA1429、RBM15/RBM15B等蛋白的作用下完成甲基化[74]。METTL3在胚胎發(fā)育、精子發(fā)生及減數(shù)分裂等起重要作用[75-76]。敲除METTL3、METTL1和WATP均可以降低m6A修飾。單個組分對m6A修飾的作用不顯著。但這些組分可協(xié)同發(fā)揮作用。R-loop是核苷酸的三級結(jié)構(gòu),在DNA復(fù)制、染色體分離、免疫球蛋白轉(zhuǎn)化等過程發(fā)揮作用。在細胞核中,R-loop是Pol II的重要調(diào)節(jié)因子[77]。Yang等[78]發(fā)現(xiàn),R-loop存在m6A位點,m6A修飾可影響R-loop的形成和降解。當(dāng)敲低單個組分YTHDC1時,對R-loop的形成影響很小,然而協(xié)同敲除METTL3、METTL14、WTAP等組分時,可以抑制R-loop形成。

3.2 m6A去甲基酶(erasers)

m6A去甲基酶是以亞鐵離子為輔助因子,α-酮戊二酸為輔助底物,通過去除甲基基團解除m6A修飾[79]。目前發(fā)現(xiàn)的去甲基酶有FTO和ALKBH5等[80]。Jia等[81-82]發(fā)現(xiàn)與甲基化脫氧核糖核苷酸相比,FTO對核糖核苷酸具有更高的活性,暗示FTO是RNA中3-甲基尿苷(m3U)的去甲基化酶,隨后的研究顯示,FTO對mRNA中對m6A的去甲基酶活性更高,因此認(rèn)為m6A是FTO的真正底物。緊接著Mauer等[83]發(fā)現(xiàn)m7G帽附近的m6Am在體內(nèi)和體外都能被FTO轉(zhuǎn)化為Am,敲除或過表達FTO能有效控制含有m6Am的mRNA豐度,進一步證明m6Am是FTO的首選底物。snRNA包含一個受調(diào)控的可逆核苷酸修飾,導(dǎo)致它們以兩種不同的甲基異構(gòu)體m1和m2存在。FTO可以選擇性地去甲基m2亞型,調(diào)控m1和m2的相對亞型。當(dāng)FTO被抑制時m2-snRNA水平會升高。高水平m2-snRNA的細胞會發(fā)生可變剪接模式的改變[84]。Wu等[85]發(fā)現(xiàn),沉默F(xiàn)TO 后CCNA2和CDK2的m6A水平顯著上調(diào),YTHDF2識別并衰減CCNA2和CDK2上的m6A水平導(dǎo)致蛋白表達量降低,從而延緩細胞周期進程抑制脂肪生成。ALKBH5定位在細胞核內(nèi),影響mRNA的運輸、RNA代謝及核內(nèi)mRNA的加工因子的組裝。敲除ALKBH5,小鼠體內(nèi)的mRNA 的m6A水平增加[86]。重金屬與腫瘤發(fā)生相關(guān),Li等[87]發(fā)現(xiàn)金屬鉈會通過METLL3/METTL14/ALKBH5-ATP13A3 a軸增加ATP13A3上的異常m6A修飾從而促進結(jié)腸癌的發(fā)生。Sun等[88]發(fā)現(xiàn)在卵巢癌中過表達ALKBH5會逆轉(zhuǎn)ITGB1 mRNA的m6A修飾,導(dǎo)致ITGB1表達增加。

3.3 m6A閱讀蛋白(readers)

m6A讀取蛋白主要由YTH域家族構(gòu)成,在YTH域家族中有兩個亞型,分別是YTHDFs、YTHDCs。YTHDFs包含 YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3成員。YTHDF1可以促進mRNA的翻譯和通過與起始因子結(jié)合促進蛋白的合成[89]。YTHDF2可以通過與mRNA的m6A修飾位點結(jié)合招募到mRNA的衰敗位點從而誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄終止[90]。YTHDF3可以與YTHDF1結(jié)合促進mRNA翻譯,與YTHDF2結(jié)合促進mRNA的降解[91]。YTHDFs包含YTHDC1、YTHDC2成員。YTHDC1主要在細胞運輸和RNA剪接方面發(fā)揮作用[92]。YTHDC2增強mRNA的翻譯效率[92]。除YTH域家族外,m6A讀取蛋白還有eIFs和IGFBPs。在癌癥研究中,IGFBPs可以識別靶基因SOX2編碼序列的m6A修飾位點,抑制SOX2降解。在胰腺癌中,過表達IGFBP2后DNA水平的甲基化修飾減低[93]。eIFs作為重要的起始因子,在基因表達和circRNA翻譯中發(fā)揮重要作用[94]。

4 m6A修飾調(diào)控circRNA

m6A修飾廣泛存在于真核生物中,修飾mRNA的剪接、出核、降解以及功能等。在非編碼RNA中m6A修飾也逐漸被報道,調(diào)控機制依然為“readers、 erasers、writers”。在環(huán)狀RNA中,m6A通過調(diào)控circRNA的出核、翻譯、降解以及響應(yīng)免疫反應(yīng)發(fā)揮作用。

4.1 介導(dǎo)circRNA的出核

CircRNA的剪接發(fā)生在細胞核中,然而細胞質(zhì)中存在大量的circRNA。Zhang等[95]發(fā)現(xiàn),circRNA有和線性RNA相似的核輸出機制,通過分析HepG2細胞的環(huán)狀RNA發(fā)現(xiàn)富集在細胞質(zhì)的環(huán)狀RNA含有可以被核輸出RBPs識別的基序。DDX39家族是進化上保守DExD-box解旋酶的家族成員,參與 pre-mRNA轉(zhuǎn)錄、剪接和核輸出[96]。Huang等[96]和Shen[97]發(fā)現(xiàn),果蠅的Hel25E及其人類同源物UAP56 (DDX39B)或URH49 (DDX39A) 是circRNA定位的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,通過感知成熟circRNA的長度來控制細胞的核輸出效率。在線性RNA中,閱讀蛋白YTHDC1可以和SRSF3相互作用將m6A修飾的mRNA運送到核輸出通道中,調(diào)控mRNA的出核反應(yīng)[92]。此外研究發(fā)現(xiàn),YTHDC1也可促進m6A修飾的環(huán)狀RNA出核[8]。Chen等[8]發(fā)現(xiàn),YTHDC1可識別細胞核中circNSUN2的m6A位點并促進circNSUN2的核輸出。輸送到細胞質(zhì)中的circNSUN2可以和IGF2BP及HMGA2形成circNSUN2-IGF2BP2-HMGA2 的RNA-蛋白三元復(fù)合物,增強circNSUN2的穩(wěn)定性。同樣在肝癌細胞(HCC)中METTL3可介導(dǎo)m6A修飾的circHPS5形成。YTHDC1促進了m6A修飾的circHPS5出核,加快HCC的轉(zhuǎn)移[9]。

4.2 介導(dǎo)circRNA的翻譯

與IRES翻譯機制一樣,當(dāng)m6A存在于5′非翻譯區(qū)域(5′UTR)時,一個單獨的m6A位點被稱為“m6A誘導(dǎo)的內(nèi)部核糖體進入位點(MIRES)”[98]。MIRES和IRES都是RNA5′帽端非獨立翻譯的依賴因子。在circRNA的翻譯中起重要作用。一個單一的m6A位點就足以驅(qū)動翻譯起始。m6A驅(qū)動的翻譯需要起始因子eIF4G2和m6A閱讀蛋白YTHDF3。這種翻譯起始機制會被甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3和METTL14增強、脫甲基酶FTO抑制。m6A也具有一定的翻譯調(diào)節(jié)能力[99]。在熱休克條件下,YTHDF2可從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核中抑制FTO的功能,從而增加m6A翻譯[100]。其次通過多聚體分析技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)分析表明,m6A驅(qū)動翻譯在circRNA中廣泛存在[53]。circ-ZNF609包含一個開放閱讀框(ORF),依賴MIRES機制起始翻譯, YTHDF3和eIF4G2蛋白是介導(dǎo)circ-ZNF609翻譯的重要因素。當(dāng)m6A修飾的兩個位點發(fā)生突變時, circZNF609的翻譯會降低50%[101]。閱讀蛋白IGF2BP1可以識別circMAP3K4的m6A位點,并促進其翻譯為circMAP3K4-455aa, circMAP3K4-455aa通過泛素-蛋白酶E3連接酶(MIB1)途徑降解[102]。

4.3 調(diào)控circRNA的降解

CircRNA 是一類閉環(huán)RNA,較線性RNA更穩(wěn)定,不易降解。部分circRNA可通過吸附miRNA后依賴Ago2-切片方式降解[103]。GW182是P-body和RNAi通路中的重要因子,含有ABD(Ago結(jié)合域),可以在RNAi通路中與Ago相互作用[104]。Jia等[105]發(fā)現(xiàn),GW182的缺失會導(dǎo)致內(nèi)源性circRNA轉(zhuǎn)錄本的積累,表明GW182可以一種依賴于Ago切片的方式調(diào)控circRNA的降解。最近的研究顯示m6A修飾的環(huán)狀RNA可通過YTHDF2-HRSP12-RNase P/MRP 軸被內(nèi)切核糖核酸酶降解。YTHDF2識別circRNA的m6A位點,HRSP12是一個適配器連接YTHDF2和RNase P/MRP,形成一個YTHDF2-HRSP12-RNase P/MRP復(fù)合物[106]。Guo等[107]發(fā)現(xiàn),circ3823上存在m6A修飾位點,閱讀蛋白YTHDF3 和去甲基酶ALKBH5與circ3823的表達在HCT116細胞中呈負(fù)相關(guān), 推測m6A修飾調(diào)控circRNA的降解。Liu等[108]發(fā)現(xiàn),在OA軟骨細胞中circRERE下調(diào),而m6A修飾增加,說明中circRERE易于通過YTHDF2-HRSP12-RNase P/MRP軸降解。

4.4 識別并參與circRNA介導(dǎo)的免疫反應(yīng)

PKR(RNA蛋白酶激活激酶)可以識別小于30bp的短鏈dsRNAs,并起始免疫反應(yīng)[108-109]。在機體內(nèi),自身會產(chǎn)生一類circRNA,該類circRNA會形成一段16-26bp的dsRNAs,其可以作為雙鏈RNA蛋白酶激活激酶(PKR)的抑制劑去響應(yīng)免疫反應(yīng)[110]。有研究顯示circRNA較其它化學(xué)物質(zhì)而言,抑制PKR激活的效果可高達103～106 倍,從而降低細胞的免疫反應(yīng)[110]。研究表明,在自身免疫疾病中,如紅斑狼瘡等,可檢測到環(huán)狀RNA的表達明顯降低、PKR的表達明顯升高[111]。哺乳動物自身免疫依賴模式識別受體(PRRs)識別病毒和細菌,RIG-1以及MD5s是機體感知外源核酸的PRRs,其中MD5s識別長鏈dsRNAs,RIG-1識別短鏈dsRNAs[112]。在環(huán)狀RNA的研究中發(fā)現(xiàn),外源導(dǎo)入circRNA可以直接激活RIG-1。但是當(dāng)這些circRNA被修飾時,激活RIG-1的作用會明顯降低。研究發(fā)現(xiàn)circRNA被m6A修飾時,可以激活RIG-1但會抑制RIG-1的成絲反應(yīng)。閱讀蛋白YTHDF2通過其N端無序結(jié)構(gòu)域?qū)6A修飾的RNA引入RIG-1中,進而抑制RIG-1的成絲反應(yīng)[113-114]。其次YTHDF可以通過N端無序結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)circRNA避免自身免疫反應(yīng)[115]。

①.circRNA的生物合成:pre-RNA通過反向剪接形成circRNA;②.circRNA的生物學(xué)功能:海綿miRNA,調(diào)控親本基因表達,翻譯成蛋白質(zhì);③.circRNA的生物降解: 依賴Ago2-切片方式降解及YTHDF2-HRSP12-RNase P/MRP軸降解①.circRNA biogenesis: CircRNA is formed by pre-RNA via backsplicing;②.Biological function of circRNA: miRNA sponging, transcriptional regulation and translation into proteins;③.Degradation of circRNA: degradation by Ago2-sectioning method and YTHDF2-HRSP12-RNase P/MRP axis 圖1 circRNA的生物合成、功能和降解Fig.1 Biogenesis, function and degradation of circRNA

5 結(jié)論和展望

CircRNA的生物合成、作用機制和降解已被大量報道,其在細胞增殖、分化、凋亡等多種活動發(fā)揮作用。主要作用方式有:作為miRNA的“海綿”;與RBPs相互作用;擁有獨特的翻譯起始位點起始翻譯;參與并調(diào)控親本基因的轉(zhuǎn)錄。m6A修飾是真核生物中最廣泛的表觀修飾之一,其不僅在mRNA中發(fā)揮作用,而且在非編碼RNA中也發(fā)揮功能。在環(huán)狀RNA中,m6A修飾可以調(diào)控circRNA的出核反應(yīng),通過MIRES起始翻譯,在細胞質(zhì)中形成YTHDF2-HRSP12-RNase P/MRP 軸介導(dǎo)circRNA降解以及響應(yīng)機體的免疫反應(yīng)(圖1)。然而關(guān)于m6A修飾在環(huán)狀RNA研究的展開時間較短,m6A修飾在環(huán)狀RNA調(diào)控的具體機制目前并不明確,需要深入探究。且有關(guān)甲基化和circRNA的研究主要集中于m6A修飾調(diào)控circRNA的代謝,而關(guān)于circRNA調(diào)控m6A修飾相關(guān)蛋白的研究仍有待補充。其次關(guān)于circRNA的m6A修飾數(shù)據(jù)庫尚為空缺,需要挖掘補充。

現(xiàn)在最常用的m6A位點檢測技術(shù)是MeRIP,MeRIP可以實現(xiàn)全基因組范圍內(nèi)m6A的檢測,但MeRIP技術(shù)做不到單核苷酸定位分析且對樣品需求量大,不利于珍貴樣品的檢測。MAZTER-seq、DART-seq雖可以實現(xiàn)單核苷酸分析,但MAZTER-seq技術(shù)只能識別ACA位點的甲基化修飾,而ACA只占DRACH的16%[70]。DART-seq只能識別mRNA的m6A位點,不能識別circRNA的m6A修飾[71]。期待隨著測序技術(shù)的進步,circRNA的m6A位點檢測技術(shù)能夠在不依賴抗體的情況下實現(xiàn)全基因組檢測。