孫中文 王慧智 徐青雨 時樂祥 張一楠 馬宇鵬 吳俊 馬志

膿毒血癥（Sepsis）是感染導致全身炎癥過度反應性綜合征，進而引起多功能臟器衰竭，是兒童和成人危重癥的常見病因之一[1，2]。其中腎臟是最常受影響的靶器官，大數(shù)據(jù)分析顯示，在兒童膿毒血癥相關調(diào)查中約40%的患兒存在急性腎損傷（AKI）。目前腎臟替代治療是主要的治療方式，有研究表明，有效抑制炎癥反應是治療膿毒血癥急性腎損傷的關鍵，因化療及免疫治療價格昂貴，且有效的早期治療藥物效果并不理想，故研究早期有效的治療藥物尤為重要[3，4]。

NF-κB 信號傳導通路是一條經(jīng)典炎癥通路，是膿毒血癥的重要通路之一[5]。NLRP3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體屬于NOD 樣受體，是NF-κB 經(jīng)典炎癥信號傳導通路的下游因子[2]。Gong 等[6]總結相關文獻后指出NLRP3 可以改善脂多糖誘導的膿毒癥休克。

姜黃素（Curcumin，Cur）是從植物姜黃的根莖中提取出來的天然藥物，大量研究表明，姜黃素有抗炎、抗氧化、抗纖維化、抗腫瘤等作用，具有很大的臨床藥用價值[7]。但姜黃素是否能成為有效預防及治療膿毒血癥急性腎損傷的藥物目前有待研究。本實驗通過腎功能及腎損傷檢測、病理HE 染色、蛋白免疫印跡法等方法，驗證姜黃素在膿毒血癥急性腎損傷中的炎癥調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 儀器全自動生化分析儀BS200（中國mindray公司）；離心機Sorvall ST40（賽默飛公司）；酶標儀SMP500-18335-ELRO（Molecular Devices 公司）；組織切片機（LEICA RM2235）；超低溫離心機（Centrifuge 5804R）；洗板機（深圳雷杜洗板機RT-3000）。

1.2 藥物和試劑姜黃素（Solarbio 公司，貨號：C7090）；戊巴比妥鈉（北京化學試劑，貨號：061222）；ELISA 檢測試劑盒（合肥萊爾生物科技公司提供）：SD 鼠白細胞介素1β（IL-1β）（貨號：LE-B1145）；SD 鼠白細胞介素18（IL-18）（貨號：LE-B0380）；SD 鼠（Rat）中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白（NGAL）（貨號：LE-B1019）；蛋白抗體（Affinity Bioscience 公司提供）；NF-κB p65 抗體（貨號：AF5006）；NLRP3 抗體（貨號：AF5006）；Caspase-1 抗體（貨號：AF5418）；內(nèi)參GAPDH（貨號：AF7021）；辣根過氧化物酶山羊抗兔（貨號：S0001）。

1.3 動物SPF 級SD 雄性幼鼠40 只，體質(zhì)量（80±20）g，遼寧長生生物技術有限公司提供，生產(chǎn)許可證號SYXK（遼）2020-0001，飼養(yǎng)于牡丹江醫(yī)學院醫(yī)藥研究中心動物房，溫度控制在22℃～25℃，相對濕度50%，晝夜12h 自動切換，自由飲水飲食。本動物實驗方法符合牡丹江醫(yī)學院動物福利和倫理管理委員會要求。

1.4 方法

1.4.1 膿毒血癥模型建立 采用盲腸結扎穿刺法（Cecal ligation and puncture，CLP）建立膿毒血癥模型[8]。幼鼠術前12h 禁食、不禁水，采用濃度1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，劑量為3mL/kg；待麻醉成功后，將其固定于操作臺上，術區(qū)備皮，碘伏消毒術區(qū)2～3 次，鋪無菌洞巾，取正中線做一長約1.5cm縱行切口，逐層切開皮膚層、肌層，探查腹腔找到幼鼠末端盲腸，將其夾出腹腔，操作時動作輕柔，避免損傷血管，回盲段至遠端1/2 處采用2-0 絲線結扎，保證結扎準確，用7 號針頭在回盲段至遠端1/2 處貫穿2 次并擠壓出約0.1cm 糞便點，沿腸管走形輕柔還納回腹腔，縫合切口，縫合完畢后碘伏消毒術區(qū)，術后分別給予皮下注射生理鹽水30mL/kg 體液復蘇，并放置于37.0℃水墊上，防止低體溫，手術總時間控制在15min 內(nèi)，術后每6h 給予肌肉注射丁丙諾菲0.05mg/kg 鎮(zhèn)痛[8～10]。

術后幼鼠精神萎靡，活動減少，毛發(fā)聳立，食欲低下，6h 內(nèi)未出現(xiàn)死亡，解剖可見腸管充血水腫，腹腔滲液明顯增多伴惡臭，腸粘連，即CLP 模型建立成功，根據(jù)組織病理學表現(xiàn)及生化指標來判斷有無急性腎損傷[8]。見圖1。

圖1 幼鼠膿毒血癥模型建立

1.4.2 分組和處理 隨機選取10 只幼鼠，分為假手術組（Sham 組）、模型組（CLP 組）、Cur 高 劑量組（CLP+Cur100mg/kg）、Cur 低劑量組（CLP+Cur 50mg/kg）[11]。其中Sham 組：切開腹部，尋找末端盲腸并夾出，不行盲腸結扎及穿刺，術前1 周每天給予生理鹽水2mL，每天灌胃一次。CLP 組：按照盲腸結扎穿刺法建立膿毒血癥模型，術前1 周生理鹽水2mL 灌胃。Cur 高劑量組、Cur 低劑量組分別術前1 周給予2mL 不同劑量的姜黃素懸濁液灌胃，每天一次，手術操作與CLP 組相同。

1.4.3 樣本采集 造模成功24h 后，腹腔注射麻醉，做腹部正中切口，2.5mL 注射器取下腔靜脈血1.5mL，靜置1h 后，常規(guī)離心機3 000 轉速，離心15min，取上層血清存于-20℃冰箱備用；取幼鼠左、右腎的上半部分組織浸泡于4%多聚甲醛中用于組織病理學檢查，左、右腎下半部分組織存于-80℃冰箱備用。

1.4.4 腎臟組織病理檢查（HE 染色）腎臟組織標本浸泡于4%多聚甲醛24h 后，進行組織修剪，常規(guī)行脫水、透明、透蠟、石蠟包埋，制作病理切片（切片厚度選擇4～6μm）。將切片常規(guī)脫蠟、復水、蘇木素染色、分化、返藍、伊紅染色、洗滌、脫水透明后封片。在光學顯微鏡下觀察組織病變情況，并拍攝圖片。

1.4.5 腎臟功能、炎癥因子指標測定 取適量上層血清，采用生化分析儀檢測肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）的水平；取適量上層血清采用ELISA 法測NGAL、IL-1β、IL-18 的表達水平，操作嚴格按照酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒說明書進行，繪制標準曲線，計算濃度值。

1.4.6 蛋白免疫印跡法檢測幼鼠腎臟NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 蛋白表達水平 取出適量腎臟組織，加入適量RIPA 裂解液，嚴格按照蛋白提取步驟提取總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度后，常規(guī)制備蛋白樣品，按照SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒說明書制膠，加樣、電泳、轉膜、5%脫脂奶粉封閉、TBST 洗膜，然后分別對應加入稀釋后的一抗孵育盒4℃過夜孵育（NF-κB p65，1:1 000 稀釋；NLRP3，1:1 000稀釋；Caspase-1，1:1 000 稀釋；GAPDH，1:1 000），TBST 洗膜、選擇對應二抗常溫孵育1h（HRP-二抗IgG，1:10 000）、TBST 洗膜、ECL 發(fā)光法顯色并保存數(shù)據(jù)，Image J 軟件進行混度分析計算相應表達量。

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 25.0 軟件進行分析，符合正態(tài)分布則采用均數(shù)±標準差（）表示，兩組以上比較采用方差分析，若方差不齊，則采用Welch 分析結果，兩兩多重比較采用最小顯著差值法（Least-significant Difference，LSD），P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 姜黃素干預后幼鼠腎臟病理變化Sham 組腎臟細胞無充血、水腫，無炎性細胞浸潤，腎小球、腎小管結構完整，無明顯細胞損傷。CLP 組腎小管上皮細胞水腫、變性、脫落，呈“毛刷”樣改變，腎小管細胞不完整，管腔可見腎小管上皮脫落物和致密物沉著，腎小球管腔增大明顯，周圍散在出血點，姜黃素干預組與CLP 組相比，腎小管上皮細胞水腫及管腔擴張程度均有所減輕，細胞完整度更高，炎細胞浸潤減少，姜黃素高劑量組減輕更為明顯。見圖2。

圖2 姜黃素干預后幼鼠腎臟病理變化

2.2 各組幼鼠腎功能變化從Scr、BUN、NGAL 濃度結果可以看出，與Sham 組相比，CLP 組Scr、BUN顯著增加（P＜0.01）；與CLP 組相比，姜黃素干預組降低明顯，并且隨著姜黃素濃度增加，降低更加顯著，姜黃素干預組與CLP 組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），姜黃素高濃度組與低濃度組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 不同組別幼鼠腎功能變化（，n=10）

表1 不同組別幼鼠腎功能變化（，n=10）

注：與Sham 組比較，aP＜0.01；與CLP 組比較，bP＜0.01；兩組姜黃素干預組比較，cP＜0.01

2.3 各組幼鼠腎臟炎癥因子水平變化從血清中IL-1β、IL-18 濃度結果可知，與Sham 組相比，CLP組IL-1β、IL-18 濃度顯著增加（P＜0.01）；與CLP組相比，姜黃素干預組降低明顯，并且隨著姜黃素濃度增加，降低更加顯著，姜黃素干預組與CLP 組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），姜黃素高濃度組與低濃度組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2 不同組別幼鼠腎臟炎癥因子變化（，n=10，pg/mL）

表2 不同組別幼鼠腎臟炎癥因子變化（，n=10，pg/mL）

注：與Sham 組比較，aP＜0.01；與CLP 組比較，bP＜0.01；兩組姜黃素干預組比較，cP＜0.01

2.4 NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 在各組幼鼠腎臟組織中的表達相對Sham 組，CLP 組中NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 表達水平顯著增高（P＜0.01）；與CLP 組相比，姜黃素干預組NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 表達水平降低較為明顯，并且隨著姜黃素濃度增加，降低更加顯著，姜黃素干預組NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 表達水平與CLP 組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），姜黃素高濃度組的Caspase-1 表達水平與低濃度組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。姜黃素高濃度組的NF-κB p65、NLRP3 表達水平與低濃度組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖3。

圖3 不同組別幼鼠NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 蛋白水平變化

3 討論

CLP 模型是建立幼鼠膿毒血癥模型的“金標準”，該模型模仿兒童壞疽穿孔闌尾炎膿毒癥[8]。Scr 與BUN 是檢測腎臟功能及損傷的常用指標，也是評價膿毒血癥是否有急性腎損傷的參考標準[12]。NGAL 是一種新型腎損傷標志物，最早由Kjeldsen等研究中首先發(fā)現(xiàn)，來源于中性粒細胞，是一種分泌型糖蛋白，主要由遠曲小管和集合管分泌，最近研究發(fā)現(xiàn)，當早期腎小管損傷后，血清和尿液中NGAL 水平明顯上升，且與腎損傷顯著相關[13]。Jahaj 等[13]認為相對于Scr、BUN，NGAL 可能更適合早期診斷，并且指出NGAL 與感染的嚴重程度成正比，NGAL 作為膿毒血癥急性腎損傷早期指標有較大意義。但NGAL 也存在弊端，其特異性并不理想，如對腫瘤、高血壓等疾病，研究發(fā)現(xiàn)NGAL區(qū)分AKI 和慢性腎?。–KD）的敏感性和特異性有限[13，14]。在急性腎損傷的診斷上應用NGAL 是可行的，其也被用作是否進行連續(xù)腎替代治療的指標之一[15]。

目前NF-κB 經(jīng)典炎癥信號傳導通路，膿毒癥急性腎損傷相關的NF-κB 激活最終依賴于其抑制劑IκBα 的磷酸化和蛋白酶體降解，利于NF-κB核易位，NF-κB 傳導通路的激活和NLRP3 有密切關系[16，17]。對于NLRP3 及炎癥小體，當機體受外源性或內(nèi)源性刺激物刺激，NLRP3 炎癥小體被激活后，通過與熱蛋白結構域（Pyrindomain，PYD）相結合形成結構域復合物，并驅(qū)動Caspase-1 的激活，從而誘導IL-1β 和IL-18 等炎性因子的分泌和成熟[2，18]。IL-1β 和IL-18 又是標志性炎癥介質(zhì)，誘導炎性細胞浸潤，最終導致腎損傷，Liu 等[19]在百草枯誘導急性腎損傷模型中表示IL-1β 和IL-18在缺血再灌注、纖維化起關鍵作用，并和NLRP3-Caspase-1 的激活密切相關。由此可知，NLRP3 主要起到連接蛋白并促進炎癥反應的關鍵作用[16，18]。實驗結果中發(fā)現(xiàn)CLP 組幼鼠IL-1β 和IL-18 炎癥水平明顯增加，NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65 蛋白相對表達量明顯增高，姜黃素干預后這些炎癥指標及蛋白含量有了不同程度的減少，并且腎組織形態(tài)有了明顯改善，可知，姜黃素可能通過下調(diào)機體內(nèi)的IL-1β、IL-18/NLRP3-（Caspase-1）-NF-κB 水平，進一步達到抗炎、抗腎損傷的作用。

綜上所述，姜黃素可以抑制機體內(nèi)NLRP3 的激活，減少Caspase-1 聚集，進一步抑制IL-1β 和IL-18 等炎癥因子的釋放，降低炎性因子對腎臟的破壞和侵襲作用，改善Scr、BUN、NGAL 的水平，從而緩解幼鼠膿毒血癥急性腎損傷的進程，起到保護作用。本研究闡述了姜黃素對腎臟的保護機制，為膿毒血癥急性腎損傷的干預提供了新的方法。