孫中文 王慧智 徐青雨 時(shí)樂祥 張一楠 馬宇鵬 吳俊 馬志

膿毒血癥（Sepsis）是感染導(dǎo)致全身炎癥過度反應(yīng)性綜合征，進(jìn)而引起多功能臟器衰竭，是兒童和成人危重癥的常見病因之一[1，2]。其中腎臟是最常受影響的靶器官，大數(shù)據(jù)分析顯示，在兒童膿毒血癥相關(guān)調(diào)查中約40%的患兒存在急性腎損傷（AKI）。目前腎臟替代治療是主要的治療方式，有研究表明，有效抑制炎癥反應(yīng)是治療膿毒血癥急性腎損傷的關(guān)鍵，因化療及免疫治療價(jià)格昂貴，且有效的早期治療藥物效果并不理想，故研究早期有效的治療藥物尤為重要[3，4]。

NF-κB 信號傳導(dǎo)通路是一條經(jīng)典炎癥通路，是膿毒血癥的重要通路之一[5]。NLRP3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體屬于NOD 樣受體，是NF-κB 經(jīng)典炎癥信號傳導(dǎo)通路的下游因子[2]。Gong 等[6]總結(jié)相關(guān)文獻(xiàn)后指出NLRP3 可以改善脂多糖誘導(dǎo)的膿毒癥休克。

姜黃素（Curcumin，Cur）是從植物姜黃的根莖中提取出來的天然藥物，大量研究表明，姜黃素有抗炎、抗氧化、抗纖維化、抗腫瘤等作用，具有很大的臨床藥用價(jià)值[7]。但姜黃素是否能成為有效預(yù)防及治療膿毒血癥急性腎損傷的藥物目前有待研究。本實(shí)驗(yàn)通過腎功能及腎損傷檢測、病理HE 染色、蛋白免疫印跡法等方法，驗(yàn)證姜黃素在膿毒血癥急性腎損傷中的炎癥調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 儀器全自動生化分析儀BS200（中國mindray公司）；離心機(jī)Sorvall ST40（賽默飛公司）；酶標(biāo)儀SMP500-18335-ELRO（Molecular Devices 公司）；組織切片機(jī)（LEICA RM2235）；超低溫離心機(jī)（Centrifuge 5804R）；洗板機(jī)（深圳雷杜洗板機(jī)RT-3000）。

1.2 藥物和試劑姜黃素（Solarbio 公司，貨號：C7090）；戊巴比妥鈉（北京化學(xué)試劑，貨號：061222）；ELISA 檢測試劑盒（合肥萊爾生物科技公司提供）：SD 鼠白細(xì)胞介素1β（IL-1β）（貨號：LE-B1145）；SD 鼠白細(xì)胞介素18（IL-18）（貨號：LE-B0380）；SD 鼠（Rat）中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（NGAL）（貨號：LE-B1019）；蛋白抗體（Affinity Bioscience 公司提供）；NF-κB p65 抗體（貨號：AF5006）；NLRP3 抗體（貨號：AF5006）；Caspase-1 抗體（貨號：AF5418）；內(nèi)參GAPDH（貨號：AF7021）；辣根過氧化物酶山羊抗兔（貨號：S0001）。

1.3 動物SPF 級SD 雄性幼鼠40 只，體質(zhì)量（80±20）g，遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號SYXK（遼）2020-0001，飼養(yǎng)于牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心動物房，溫度控制在22℃～25℃，相對濕度50%，晝夜12h 自動切換，自由飲水飲食。本動物實(shí)驗(yàn)方法符合牡丹江醫(yī)學(xué)院動物福利和倫理管理委員會要求。

1.4 方法

1.4.1 膿毒血癥模型建立 采用盲腸結(jié)扎穿刺法（Cecal ligation and puncture，CLP）建立膿毒血癥模型[8]。幼鼠術(shù)前12h 禁食、不禁水，采用濃度1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，劑量為3mL/kg；待麻醉成功后，將其固定于操作臺上，術(shù)區(qū)備皮，碘伏消毒術(shù)區(qū)2～3 次，鋪無菌洞巾，取正中線做一長約1.5cm縱行切口，逐層切開皮膚層、肌層，探查腹腔找到幼鼠末端盲腸，將其夾出腹腔，操作時(shí)動作輕柔，避免損傷血管，回盲段至遠(yuǎn)端1/2 處采用2-0 絲線結(jié)扎，保證結(jié)扎準(zhǔn)確，用7 號針頭在回盲段至遠(yuǎn)端1/2 處貫穿2 次并擠壓出約0.1cm 糞便點(diǎn)，沿腸管走形輕柔還納回腹腔，縫合切口，縫合完畢后碘伏消毒術(shù)區(qū)，術(shù)后分別給予皮下注射生理鹽水30mL/kg 體液復(fù)蘇，并放置于37.0℃水墊上，防止低體溫，手術(shù)總時(shí)間控制在15min 內(nèi)，術(shù)后每6h 給予肌肉注射丁丙諾菲0.05mg/kg 鎮(zhèn)痛[8～10]。

術(shù)后幼鼠精神萎靡，活動減少，毛發(fā)聳立，食欲低下，6h 內(nèi)未出現(xiàn)死亡，解剖可見腸管充血水腫，腹腔滲液明顯增多伴惡臭，腸粘連，即CLP 模型建立成功，根據(jù)組織病理學(xué)表現(xiàn)及生化指標(biāo)來判斷有無急性腎損傷[8]。見圖1。

圖1 幼鼠膿毒血癥模型建立

1.4.2 分組和處理 隨機(jī)選取10 只幼鼠，分為假手術(shù)組（Sham 組）、模型組（CLP 組）、Cur 高 劑量組（CLP+Cur100mg/kg）、Cur 低劑量組（CLP+Cur 50mg/kg）[11]。其中Sham 組：切開腹部，尋找末端盲腸并夾出，不行盲腸結(jié)扎及穿刺，術(shù)前1 周每天給予生理鹽水2mL，每天灌胃一次。CLP 組：按照盲腸結(jié)扎穿刺法建立膿毒血癥模型，術(shù)前1 周生理鹽水2mL 灌胃。Cur 高劑量組、Cur 低劑量組分別術(shù)前1 周給予2mL 不同劑量的姜黃素懸濁液灌胃，每天一次，手術(shù)操作與CLP 組相同。

1.4.3 樣本采集 造模成功24h 后，腹腔注射麻醉，做腹部正中切口，2.5mL 注射器取下腔靜脈血1.5mL，靜置1h 后，常規(guī)離心機(jī)3 000 轉(zhuǎn)速，離心15min，取上層血清存于-20℃冰箱備用；取幼鼠左、右腎的上半部分組織浸泡于4%多聚甲醛中用于組織病理學(xué)檢查，左、右腎下半部分組織存于-80℃冰箱備用。

1.4.4 腎臟組織病理檢查（HE 染色）腎臟組織標(biāo)本浸泡于4%多聚甲醛24h 后，進(jìn)行組織修剪，常規(guī)行脫水、透明、透蠟、石蠟包埋，制作病理切片（切片厚度選擇4～6μm）。將切片常規(guī)脫蠟、復(fù)水、蘇木素染色、分化、返藍(lán)、伊紅染色、洗滌、脫水透明后封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病變情況，并拍攝圖片。

1.4.5 腎臟功能、炎癥因子指標(biāo)測定 取適量上層血清，采用生化分析儀檢測肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）的水平；取適量上層血清采用ELISA 法測NGAL、IL-1β、IL-18 的表達(dá)水平，操作嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒說明書進(jìn)行，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算濃度值。

1.4.6 蛋白免疫印跡法檢測幼鼠腎臟NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 蛋白表達(dá)水平 取出適量腎臟組織，加入適量RIPA 裂解液，嚴(yán)格按照蛋白提取步驟提取總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度后，常規(guī)制備蛋白樣品，按照SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒說明書制膠，加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉、TBST 洗膜，然后分別對應(yīng)加入稀釋后的一抗孵育盒4℃過夜孵育（NF-κB p65，1:1 000 稀釋；NLRP3，1:1 000稀釋；Caspase-1，1:1 000 稀釋；GAPDH，1:1 000），TBST 洗膜、選擇對應(yīng)二抗常溫孵育1h（HRP-二抗IgG，1:10 000）、TBST 洗膜、ECL 發(fā)光法顯色并保存數(shù)據(jù)，Image J 軟件進(jìn)行混度分析計(jì)算相應(yīng)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布則采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組以上比較采用方差分析，若方差不齊，則采用Welch 分析結(jié)果，兩兩多重比較采用最小顯著差值法（Least-significant Difference，LSD），P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素干預(yù)后幼鼠腎臟病理變化Sham 組腎臟細(xì)胞無充血、水腫，無炎性細(xì)胞浸潤，腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)完整，無明顯細(xì)胞損傷。CLP 組腎小管上皮細(xì)胞水腫、變性、脫落，呈“毛刷”樣改變，腎小管細(xì)胞不完整，管腔可見腎小管上皮脫落物和致密物沉著，腎小球管腔增大明顯，周圍散在出血點(diǎn)，姜黃素干預(yù)組與CLP 組相比，腎小管上皮細(xì)胞水腫及管腔擴(kuò)張程度均有所減輕，細(xì)胞完整度更高，炎細(xì)胞浸潤減少，姜黃素高劑量組減輕更為明顯。見圖2。

圖2 姜黃素干預(yù)后幼鼠腎臟病理變化

2.2 各組幼鼠腎功能變化從Scr、BUN、NGAL 濃度結(jié)果可以看出，與Sham 組相比，CLP 組Scr、BUN顯著增加（P＜0.01）；與CLP 組相比，姜黃素干預(yù)組降低明顯，并且隨著姜黃素濃度增加，降低更加顯著，姜黃素干預(yù)組與CLP 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），姜黃素高濃度組與低濃度組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 不同組別幼鼠腎功能變化（，n=10）

表1 不同組別幼鼠腎功能變化（，n=10）

注：與Sham 組比較，aP＜0.01；與CLP 組比較，bP＜0.01；兩組姜黃素干預(yù)組比較，cP＜0.01

2.3 各組幼鼠腎臟炎癥因子水平變化從血清中IL-1β、IL-18 濃度結(jié)果可知，與Sham 組相比，CLP組IL-1β、IL-18 濃度顯著增加（P＜0.01）；與CLP組相比，姜黃素干預(yù)組降低明顯，并且隨著姜黃素濃度增加，降低更加顯著，姜黃素干預(yù)組與CLP 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），姜黃素高濃度組與低濃度組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表2 不同組別幼鼠腎臟炎癥因子變化（，n=10，pg/mL）

表2 不同組別幼鼠腎臟炎癥因子變化（，n=10，pg/mL）

注：與Sham 組比較，aP＜0.01；與CLP 組比較，bP＜0.01；兩組姜黃素干預(yù)組比較，cP＜0.01

2.4 NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 在各組幼鼠腎臟組織中的表達(dá)相對Sham 組，CLP 組中NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 表達(dá)水平顯著增高（P＜0.01）；與CLP 組相比，姜黃素干預(yù)組NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 表達(dá)水平降低較為明顯，并且隨著姜黃素濃度增加，降低更加顯著，姜黃素干預(yù)組NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 表達(dá)水平與CLP 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），姜黃素高濃度組的Caspase-1 表達(dá)水平與低濃度組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。姜黃素高濃度組的NF-κB p65、NLRP3 表達(dá)水平與低濃度組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖3。

圖3 不同組別幼鼠NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 蛋白水平變化

3 討論

CLP 模型是建立幼鼠膿毒血癥模型的“金標(biāo)準(zhǔn)”，該模型模仿兒童壞疽穿孔闌尾炎膿毒癥[8]。Scr 與BUN 是檢測腎臟功能及損傷的常用指標(biāo)，也是評價(jià)膿毒血癥是否有急性腎損傷的參考標(biāo)準(zhǔn)[12]。NGAL 是一種新型腎損傷標(biāo)志物，最早由Kjeldsen等研究中首先發(fā)現(xiàn)，來源于中性粒細(xì)胞，是一種分泌型糖蛋白，主要由遠(yuǎn)曲小管和集合管分泌，最近研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)早期腎小管損傷后，血清和尿液中NGAL 水平明顯上升，且與腎損傷顯著相關(guān)[13]。Jahaj 等[13]認(rèn)為相對于Scr、BUN，NGAL 可能更適合早期診斷，并且指出NGAL 與感染的嚴(yán)重程度成正比，NGAL 作為膿毒血癥急性腎損傷早期指標(biāo)有較大意義。但NGAL 也存在弊端，其特異性并不理想，如對腫瘤、高血壓等疾病，研究發(fā)現(xiàn)NGAL區(qū)分AKI 和慢性腎?。–KD）的敏感性和特異性有限[13，14]。在急性腎損傷的診斷上應(yīng)用NGAL 是可行的，其也被用作是否進(jìn)行連續(xù)腎替代治療的指標(biāo)之一[15]。

目前NF-κB 經(jīng)典炎癥信號傳導(dǎo)通路，膿毒癥急性腎損傷相關(guān)的NF-κB 激活最終依賴于其抑制劑IκBα 的磷酸化和蛋白酶體降解，利于NF-κB核易位，NF-κB 傳導(dǎo)通路的激活和NLRP3 有密切關(guān)系[16，17]。對于NLRP3 及炎癥小體，當(dāng)機(jī)體受外源性或內(nèi)源性刺激物刺激，NLRP3 炎癥小體被激活后，通過與熱蛋白結(jié)構(gòu)域（Pyrindomain，PYD）相結(jié)合形成結(jié)構(gòu)域復(fù)合物，并驅(qū)動Caspase-1 的激活，從而誘導(dǎo)IL-1β 和IL-18 等炎性因子的分泌和成熟[2，18]。IL-1β 和IL-18 又是標(biāo)志性炎癥介質(zhì)，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞浸潤，最終導(dǎo)致腎損傷，Liu 等[19]在百草枯誘導(dǎo)急性腎損傷模型中表示IL-1β 和IL-18在缺血再灌注、纖維化起關(guān)鍵作用，并和NLRP3-Caspase-1 的激活密切相關(guān)。由此可知，NLRP3 主要起到連接蛋白并促進(jìn)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵作用[16，18]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)CLP 組幼鼠IL-1β 和IL-18 炎癥水平明顯增加，NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65 蛋白相對表達(dá)量明顯增高，姜黃素干預(yù)后這些炎癥指標(biāo)及蛋白含量有了不同程度的減少，并且腎組織形態(tài)有了明顯改善，可知，姜黃素可能通過下調(diào)機(jī)體內(nèi)的IL-1β、IL-18/NLRP3-（Caspase-1）-NF-κB 水平，進(jìn)一步達(dá)到抗炎、抗腎損傷的作用。

綜上所述，姜黃素可以抑制機(jī)體內(nèi)NLRP3 的激活，減少Caspase-1 聚集，進(jìn)一步抑制IL-1β 和IL-18 等炎癥因子的釋放，降低炎性因子對腎臟的破壞和侵襲作用，改善Scr、BUN、NGAL 的水平，從而緩解幼鼠膿毒血癥急性腎損傷的進(jìn)程，起到保護(hù)作用。本研究闡述了姜黃素對腎臟的保護(hù)機(jī)制，為膿毒血癥急性腎損傷的干預(yù)提供了新的方法。