孔慧梅 張春霆 鄭志彬

1.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江金華 321017；2.浙江省金華市人民醫(yī)院泌尿外科，浙江金華 321000；3.浙江省金華市金磐開發(fā)區(qū)醫(yī)院中醫(yī)科，浙江金華 321000

前列腺癌（prostate cancer，PCa）已經(jīng)成為威脅老年男性的常見疾病，目前我國(guó)PCa 發(fā)病率逐年增高，由于我國(guó)早期PCa 發(fā)現(xiàn)率低，臨床中局部晚期和晚期的患者比例較高。PCa 細(xì)胞增殖、侵襲在臨床中表現(xiàn)為前列腺癌患者的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[1]，PCa 的發(fā)生與遺傳密切有關(guān)[2]。因此，基因在PCa 的發(fā)生進(jìn)展中有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，密封蛋白-4 與卵巢癌、胰腺癌和腎癌發(fā)生進(jìn)展有關(guān)[3-5]，也有對(duì)密封蛋白-4 與PCa 臨床病理關(guān)系的部分研究顯示，密封蛋白與PCa 分化程度和臨床分期有關(guān)，但確切的機(jī)制并未清晰[6]。PCa 侵襲轉(zhuǎn)移與細(xì)胞脫離原發(fā)腫瘤部位，侵入局部和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，密封蛋白-4 和血管上皮鈣黏素都與細(xì)胞的黏附功能改變及新生血管形成有關(guān)[9]，血管上皮鈣黏素是與細(xì)胞黏附密切相關(guān)的基因，其異常變化有助于腫瘤血管形成和轉(zhuǎn)移[10]。TCGA 腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，密封蛋白-4 和血管上皮鈣黏素有相關(guān)性，但在PCa 的研究中鮮見報(bào)道。本研究采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)PCa 中密封蛋白-4 和血管上皮鈣黏素的表達(dá)情況，對(duì)其與PCa 臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取浙江省金華市人民醫(yī)院泌尿外科2015 年1 月至2017 年12 月收治的82 例PCa 患者的癌及癌旁組織作為研究對(duì)象，患者年齡49～76 歲；Gleason 評(píng)分[7]≥7 分37 例，≤6 分45 例；國(guó)際抗癌聯(lián)盟TNM 分期[11]：Ⅰ～Ⅱ期48 例，Ⅲ～Ⅳ期34 例（來自PCa 穿刺標(biāo)本，臨床分期參考CT、MRI、ECT 綜合檢查結(jié)果進(jìn)行分期）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理學(xué)確定PCa；②Ⅲ～Ⅳ期有CT、MRI、ECT 任何一個(gè)提示異常的客觀證據(jù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他腫瘤；②化療、放療和內(nèi)分泌治療。本研究經(jīng)金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核。

1.2 研究方法

免疫組織化學(xué)染色按照試劑盒說明書操作（北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：SP-0023-3 ml），研究標(biāo)本組織石蠟包埋后，4 μm 石蠟標(biāo)本連續(xù)切片、36℃烤片，脫蠟后抗原修復(fù)，0.3%H2O2-甲醇封閉內(nèi)源性過氧化物10 min，滴加一抗（1∶100），4℃冰箱過夜。兔抗人密封蛋白-4 蛋白多克隆抗體免疫組織化學(xué)染色（武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品，工作濃度：1∶150，規(guī)格：50 μl，貨號(hào)：YB-2597R），以PBS 代替一抗作陰性對(duì)照，次日滴加生物素標(biāo)記的二抗（兔）及鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶，室溫孵育12 min。各步驟間均以0.1%PBS 洗5 min，共3 次，最后DAB 顯色（北京中杉金橋生物技術(shù)公司產(chǎn)品，貨號(hào)：D405772-1Set），常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。兔抗人血管上皮鈣黏素多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品，工作濃度：1∶100，規(guī)格：50 μg，貨號(hào)：abs13089），與上述實(shí)驗(yàn)步驟相同。

1.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定

染色結(jié)果由兩位病理醫(yī)師進(jìn)行評(píng)估，判斷標(biāo)準(zhǔn)參照國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)[12]其表達(dá)情況評(píng)價(jià)陽性細(xì)胞比例。每張切片隨機(jī)選取10 個(gè)視野（200×），計(jì)算每個(gè)視野中陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分率，最后計(jì)算10 個(gè)視野陽性細(xì)胞百分率平均值。陽性細(xì)胞百分率＜5%為（-），5%～25%為（+），＞25%～50%為（++），＞50%為（+++），評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：（+）及以下為陰性，（++）及以上為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)和百分率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson 相關(guān)系數(shù)分析相關(guān)性。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 密封蛋白-4 和血管上皮鈣黏素在PCa 組織中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，密封蛋白-4 主要表達(dá)定位于細(xì)胞膜，呈褐色顆粒，血管上皮鈣黏素主要表達(dá)定位于細(xì)胞膜/胞漿，棕褐色顆粒。見圖1。

2.2 PCa 患者癌組織及癌旁組織中密封蛋白-4 和血管上皮鈣黏素表達(dá)情況比較

PCa 患者癌組織密封蛋白-4、血管上皮鈣黏素陽性表達(dá)率均高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 PCa 患者癌組織及癌旁正常組織中密封蛋白-4 和血管上皮鈣黏素表達(dá)情況比較[例（%）]

2.3 不同特征PCa 患者癌組織中密封蛋白-4 和血管上皮鈣黏素陽性表達(dá)比較

不同Gleason 評(píng)分、TNM 分期、術(shù)前前列腺特異性抗原及精囊浸潤(rùn)的密封蛋白-4 陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同Gleason 評(píng)分、TNM 分期、術(shù)前前列腺特異性抗原、精囊浸潤(rùn)及切緣狀況PCa 患者的血管上皮鈣黏素的陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 不同特征PCa 患者癌組織中密封蛋白-4 和血管上皮鈣黏素陽性表達(dá)比較[例（%）]

2.4 在PCa 中的密封蛋白-4 和血管上皮鈣黏素表達(dá)的相關(guān)分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，PCa 中密封蛋白-4 和血管上皮鈣黏素表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.794，P＜0.001）。

3 討論

PCa 是危害男性健康的惡性腫瘤之一[13-14]，前列腺特異抗原作為PCa 普遍篩查指標(biāo)廣泛應(yīng)用后，我國(guó)早期PCa 發(fā)現(xiàn)率明顯提高，但部分地方未重視PCa篩查，早期發(fā)現(xiàn)率受到限制[15]。由于臨床中出現(xiàn)進(jìn)展的患者中有32%血清前列腺特異抗原檢測(cè)結(jié)果正常，致使進(jìn)展后局部癥狀加重和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，患者生活質(zhì)量下降[16]，因此，聯(lián)合有效指標(biāo)檢測(cè)可提高PCa 的早期發(fā)現(xiàn)和進(jìn)展預(yù)測(cè)。

PCa 表現(xiàn)復(fù)雜，單一基因并未能完全闡述發(fā)病機(jī)制[17]。研究發(fā)現(xiàn)，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在PCa 的發(fā)病中有重要作用[18-19]，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中血管鈣黏素發(fā)揮重要作用，本課題組前期通過研究全人類基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)密封蛋白-4 和血管上皮鈣黏素在PCa 中存在異常增高，對(duì)TCGA 腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)查詢，發(fā)現(xiàn)密封蛋白-4 和血管上皮鈣黏素在PCa 中有相關(guān)性[20]?；诖耍狙芯繉?duì)密封蛋白-4 和血管上皮鈣黏素在PCa 中的表達(dá)與PCa 的臨床和病理關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)密封蛋白-4 在PCa 中增高表達(dá)，密封蛋白-4 增高表達(dá)與PCa 臨床病理相關(guān)。不同Gleason 評(píng)分、TNM 分期、術(shù)前前列腺特異性抗原及精囊浸潤(rùn)PCa 患者癌組織的密封蛋白-4 陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但密封蛋白-4 在PCa 中作用機(jī)制有待進(jìn)一步探索。有研究對(duì)密封蛋白-4 通過脂氧素A4 對(duì)急性肺損傷肺泡上皮通透性的影響進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)脂氧素A4 影響密封蛋白-4 蛋白表達(dá)在肺泡上皮通透性中發(fā)揮作用[21]。對(duì)密封蛋白-4 與腫瘤預(yù)后相關(guān)性研究中，發(fā)現(xiàn)密封蛋白-4 高表達(dá)與胃癌、膀胱尿路上皮癌和乳腺癌臨床分期及預(yù)后相關(guān)[22-25]。

血管上皮鈣黏素作為黏附分子家族的重要成員，在多種腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移中起重要作用[26]。本研究對(duì)血管上皮鈣黏素在PCa 中的表達(dá)與PCa 臨床病理相關(guān)性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，不同Gleason 評(píng)分、TNM分期、術(shù)前前列腺特異抗原、精囊浸潤(rùn)及切緣狀況PCa 患者癌組織的血管上皮鈣黏素的陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示血管上皮鈣黏素表達(dá)增加了PCa 惡性增殖和異常分化。國(guó)內(nèi)一項(xiàng)KLF17 基因?qū)θ私Y(jié)直腸癌血管上皮鈣黏素表達(dá)及體外侵襲能力影響的研究采用靶向轉(zhuǎn)染KLF17 表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480 細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞，然后進(jìn)行熒光定量PCR 和Western blot 檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后KLF17 和血管上皮鈣黏素基因蛋白表達(dá)水平。另外采用Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染KLF17 后SW480 細(xì)胞侵襲能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后SW480 細(xì)胞KLF17 基因和蛋白表達(dá)水平均顯著高于正常細(xì)胞，過表達(dá)KLF17 后SW480 細(xì)胞中血管上皮鈣黏素水平下降，細(xì)胞侵襲能力降低，說明血管上皮鈣黏素的表達(dá)降低可抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲能力[27]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)血管上皮鈣黏素增高表達(dá)與PCa臨床病理特征有關(guān)，相關(guān)性分析結(jié)果顯示，密封蛋白-4 和血管上皮鈣黏素表達(dá)呈正相關(guān)，提示在PCa 中兩者存在相互促進(jìn)作用。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)PCa 不同病理特征與密封蛋白-4及血管上皮鈣黏素有關(guān)，但其在PCa 發(fā)生進(jìn)展中所扮演的角色復(fù)雜，為進(jìn)一步了解其在PCa 中的作用機(jī)制，仍需在體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行深入研究。