吳雨來, 徐甄, 費(fèi)思瑜, 盧媛, 田可欣, 楊梓豪, 劉赟霄, 劉兵, 李加友

(1.嘉興學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院, 浙江 嘉興 314001; 2.海東市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局, 青海 海東 810600)

靈芝(Ganodermalucidum), 又稱莎草, 是真菌門擔(dān)子菌亞門多孔菌目靈芝菌科靈芝屬藥食兩用真菌[1]。研究表明, 靈芝中含有多糖、三萜、生物堿、氨基酸及有機(jī)鍺等多種活性成分, 具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、保肝護(hù)肝等生物學(xué)功效[2-5]。但是, 靈芝子實(shí)體結(jié)構(gòu)致密, 外層菌絲中充滿樹脂,導(dǎo)致活性物質(zhì)釋放困難[6]。因此, 靈芝活性成分的提取方法成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。溶劑浸煮法[7-8]只能使細(xì)胞胞質(zhì)皺縮, 細(xì)胞壁沒有破損, 活性成分難以釋放, 提取率低; 超聲波輔助提取法[9-10]和微波輔助提取法[11-12], 使細(xì)胞壁出現(xiàn)微小孔洞, 提取率較溶劑浸提法略有提高, 但設(shè)備要求高、不利于生產(chǎn); 超微粉碎技術(shù)輔助提取法[13-15]對提取率的提升作用最為顯著, 但超微粉碎技術(shù)需要專用設(shè)備、處理成本高, 不適合大規(guī)模生產(chǎn)。

微生物發(fā)酵提取法[16-20]是利用微生物在生長過程中代謝產(chǎn)生具有破壁功能的復(fù)合生物酶系分解植物細(xì)胞壁, 從而使活性成分高效釋出, 提高活性成分提取率。本論文選用特定微生物發(fā)酵對靈芝進(jìn)行發(fā)酵前處理, 然后再通過溶劑浸煮法提取靈芝中多糖和三萜, 并對提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化, 得到微生物發(fā)酵靈芝總多糖及三萜最佳提取工藝。用該最佳工藝條件提取同批次、同產(chǎn)地未經(jīng)微生物發(fā)酵前處理的靈芝, 比較微生物發(fā)酵前處理對靈芝活性成分提取率的影響。

1 材料與儀器

1.1 材料

靈芝由青海雪芝隆生物科技有限公司提供, 試劑: 無水葡萄糖和齊墩果酸對照品購于阿拉丁試劑公司, 其余試劑均為市售分析純或化學(xué)純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

高壓蒸汽滅菌鍋 (上海申安醫(yī)療器械廠,LDZH-150KBS), 恒溫水浴鍋 (常州邁科諾儀器有限公司, WB-6), 恒溫培養(yǎng)箱 (寧國沙鷹科學(xué)儀器有限公司, LRH-150), 鼓風(fēng)干燥箱 (上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司, DGG-9150G), 紫外-可見分光光度計(jì) (上海美譜達(dá)儀器有限公司, UV-1100 型),移液槍 (大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器 (北京) 股份公司,YE209AT0043015), 粉碎機(jī) (帶篩網(wǎng)) (北京中興偉業(yè)儀器有限公司, FE220), 循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司, SHZ-DⅢ)。

1.3 培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基: 土豆汁20 g (鮮土豆), 葡萄糖2 g, pH 值自然, 水100 mL。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 靈芝生物發(fā)酵

將康寧木霉LZ51 (Trichodermakoningii) 接種于液體PDA 培養(yǎng)基中, 于搖床中30 ℃振蕩培養(yǎng)48 h。取靈芝粉末加水至含水量為50%, 于126 ℃高壓蒸汽滅菌鍋滅菌2 h, 取出放涼后加入10%上述菌液, 于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃恒溫培養(yǎng)108 h。發(fā)酵結(jié)束后, 平攤于不銹鋼盤上, 烘箱60 ℃干燥24 h, 得到發(fā)酵靈芝。

2.2 發(fā)酵靈芝總多糖提取工藝考察

取2.1 節(jié)中所得發(fā)酵靈芝, 以水為提取劑, 以靈芝總多糖提取率為指標(biāo), 采用L9(34) 正交表進(jìn)行試驗(yàn), 考察提取時(shí)間、提取溫度、提取劑用量對靈芝總多糖提取率的影響。各因素水平設(shè)計(jì)如表1。

表1 發(fā)酵靈芝總多糖提取工藝正交試驗(yàn)因素與水平

2.3 發(fā)酵靈芝三萜提取工藝考察

取2.1 節(jié)中所得發(fā)酵靈芝, 以無水乙醇為提取劑, 以靈芝三萜提取率為指標(biāo), 采用L9(34) 正交表進(jìn)行試驗(yàn), 考察提取時(shí)間、提取溫度、提取劑用量對靈芝三萜提取率的影響。各因素水平設(shè)計(jì)如表2。

表2 發(fā)酵靈芝三萜提取工藝正交試驗(yàn)因素與水平

2.4 總多糖含量測定

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取無水葡萄糖對照品加水制成1 mL 含0.12 mg 的溶液, 為對照品溶液。分別取對照品溶液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL 置于10 mL 具塞試管中, 加水至2.00 mL, 迅速精密加入硫酸蒽酮溶液 (精密稱定蒽酮0.10 g, 加濃硫酸100 mL, 使溶解, 搖勻) 6.00 mL, 立即搖勻, 放置15 min 后, 立即置于冰水浴中冷卻15 min, 依次得濃度為0.003、0.006、0.009、0.012、0.015、0.018 mg·mL-1的對照品待測液。取2.00 mL 水加入6.00 mL 硫酸蒽酮溶液為空白溶液, 用紫外-可見分光光度計(jì)在625 nm 波長處測定吸光度, 以吸光度為縱坐標(biāo) (Y), 濃度為橫坐標(biāo) (X) 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算回歸方程為Y= 0.681X+0.051,R2=0.999, 線性范圍0.003～0.018 mg·mL-1, 線性關(guān)系良好。

2.4.2 樣品總多糖提取

從圖2來看，沙灣特色旅游小鎮(zhèn)的自我就業(yè)者的收入與經(jīng)營情況可觀，收入挺好維持現(xiàn)狀的商家高達(dá)79.17%，另外還有6.25%的商家還打算擴(kuò)大經(jīng)營，由此可見特色小鎮(zhèn)的發(fā)展給了自我就業(yè)者就業(yè)的機(jī)會和較大的收益。但由6.25%的另謀職業(yè)的與8.33%的放棄回家去別的地方尋機(jī)會的自我就業(yè)者可知，獲益群體僅僅針對本地的自我就業(yè)者。究其一個(gè)原因是62.5%的商家是擁有相關(guān)的技術(shù)自我就業(yè)的，如自家制作當(dāng)?shù)孛朗场敖衲獭?、?dāng)?shù)厝酥谱鞯氖止に嚻?，相反，?dāng)?shù)胤羌夹g(shù)類型商家收入并不多甚至想另謀機(jī)會。

取2.1 節(jié)中發(fā)酵靈芝, 置于帶溫度計(jì)及回流冷凝管的三頸瓶中, 在一定溫度下, 加入一定量水,提取一段時(shí)間, 冷卻至室溫, 過濾, 得到發(fā)酵靈芝總多糖提取液。

2.4.3 樣品總多糖提取率計(jì)算

取上述提取液2.00 mL, 按2.4.1 節(jié)中對照品溶液的測定方法在625 nm 波長處測定吸光度, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到該提取液中總多糖濃度X1(mg·mL-1)。

式中:V—總多糖提取液總體積;m—提取總多糖時(shí)靈芝粉末用量。

2.5 三萜含量測定

三萜含量依照藥典[1]采用齊墩果酸對照法測定。

2.5.1 對照品溶液的制備

精密稱取齊墩果酸對照品加甲醇制成每1 mL含0.2 mg 的溶液, 為對照品溶液。精密量取對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL, 分別置于15 mL 具塞試管中, 揮干, 放冷, 精密加入新配制的香草醛冰醋酸溶液0.2 mL (精密稱取香草醛0.5 g, 加冰醋酸溶解成10 mL, 即得)、高氯酸0.8 mL, 搖勻, 在70 ℃水浴中加熱15 min, 立即置于冰浴中冷卻5 min, 取出, 精密加入乙酸乙酯4.0 mL, 搖 勻, 依 次 得 濃 度 為 0.004、0.008、0.012、0.016、0.020 mg·mL-1的待測對照品溶液。以相應(yīng)試劑為空白, 用紫外-可見分光光度計(jì)在546 nm 波長處測定吸光度, 以吸光度為縱坐標(biāo)(Y′), 濃度為橫坐標(biāo) (X′) 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算回歸方程為Y′= 2.415 1X′-0.011 3,R2= 0.997,線性范圍0.004～0.020 mg·mL-1, 線性關(guān)系良好。

2.5.2 樣品三萜提取

取2.1 節(jié)中發(fā)酵靈芝, 置于帶溫度計(jì)及回流冷凝管的三頸瓶中, 在一定溫度下, 加入一定量無水乙醇, 提取一段時(shí)間, 冷卻至室溫, 過濾, 得發(fā)酵靈芝三萜提取液。

2.5.3 樣品三萜提取率計(jì)算

取上述提取液0.2 mL, 置于15 mL 具塞試管中, 照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法, 自揮干起, 同法操作, 在546 nm 波長處測定吸光度, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到該提取液中三萜濃度X′1(mg·mL-1)。

式中:V′—三萜提取液總體積;m′—提取三萜時(shí)靈芝粉末用量。

3 結(jié)果與討論

3.1 發(fā)酵靈芝總多糖提取工藝考察結(jié)果

以水為提取劑, 以靈芝總多糖提取率為指標(biāo),采用L9(34) 正交表進(jìn)行試驗(yàn), 考察提取時(shí)間、提取溫度、提取劑用量對靈芝總多糖提取率的影響, 結(jié)果見表3。

表3 發(fā)酵靈芝總多糖提取正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3 可以看出, 最優(yōu)總多糖提取工藝為A1B3C3, 且C3>B3>A1。溶劑用量對總多糖提取率影響不大,R=0.47, 溶劑用量為10 mL·g-1或50 mL·g-1, 多糖提取率相差不大, 結(jié)合靈芝粉末完全浸沒所需溶劑用量及操作便利性, 確定最佳溶劑用量為10 mL·g-1。影響最大的是溫度,R=18.17, 溫度越高提取率越高, 但溶劑水的沸點(diǎn)為100 ℃, 已達(dá)極限。時(shí)間影響其次,R=13.24, 隨時(shí)間增長, 提取率增加。該正交試驗(yàn)表未能得到最佳提取時(shí)間, 需進(jìn)一步進(jìn)行單因素試驗(yàn)考察。

3.2 發(fā)酵靈芝總多糖提取單因素試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果, 選取溶劑用量10 mL·g-1, 提取溫度為100 ℃, 考察提取時(shí)間對總多糖提取率的影響, 結(jié)果見表4。結(jié)果表明, 隨著提取時(shí)間的增加提取率也升高, 當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到3.5 h,提取率趨于穩(wěn)定, 不再隨著提取時(shí)間的增加而增加, 綜合考慮能耗、效率等因素, 確定3.5 h 是發(fā)酵靈芝總多糖最佳提取時(shí)間。

表4 提取時(shí)間對發(fā)酵靈芝總多糖提取率的影響

3.3 發(fā)酵靈芝三萜提取工藝優(yōu)化

以無水乙醇為提取劑, 以靈芝三萜提取率為指標(biāo), 采用L9(34) 正交表進(jìn)行試驗(yàn), 考察提取時(shí)間、提取溫度、提取劑用量對靈芝三萜提取率的影響, 結(jié)果見表5。

表5 發(fā)酵靈芝三萜提取正交試驗(yàn)結(jié)果

由表5 可以看出, 最優(yōu)三萜提取工藝為A1B2C2, 且A1>B2>C2。其中溶劑用量對三萜提取率影響最大,R=4.28, 隨著溶劑用量增加, 三萜提取率明顯下降, 但若繼續(xù)減少溶劑用量, 樣品便無法完全浸沒于溶劑中, 也不利于后續(xù)的過濾等操作, 故確定最佳提取劑用量為10 mL·g-1。提取時(shí)間影響其次,R=3.99, 隨著提取時(shí)間增加, 三萜提取率先增加后降低, 最優(yōu)提取時(shí)間為2 h。溫度對提取率影響最小,R= 2.18, 隨著溫度升高,提取率先上升后下降, 最優(yōu)提取溫度為50 ℃。

3.4 靈芝發(fā)酵前后總多糖和三萜提取率對比

為考察微生物發(fā)酵前處理對靈芝總多糖提取率的影響, 取同批次未經(jīng)過微生物發(fā)酵前處理的靈芝, 以水為提取劑, 提取劑用量為10 mL·g-1, 在100 ℃下提取3.5 h, 冷卻至室溫, 過濾, 得未發(fā)酵靈芝總多糖提取液。取該提取液2.00 mL 按2.4.2 節(jié)的操作測定總多糖提取率為34.02 mg·g-1, 明顯低于同批次、同條件下微生物發(fā)酵前處理靈芝總多糖提取率50.92 mg·g-1, 結(jié)果見圖1。由此可見, 微生物發(fā)酵前處理可顯著提高靈芝總多糖提取率。

圖1 發(fā)酵靈芝和未發(fā)酵靈芝總多糖提取率比較

為考察微生物發(fā)酵前處理對靈芝三萜提取率的影響, 取同批次未經(jīng)過微生物發(fā)酵前處理的靈芝,以無水乙醇為提取劑, 提取劑用量為10 mL·g-1,在50 ℃下提取2 h, 冷卻至室溫得未發(fā)酵靈芝三萜提取液。取該提取液0.2 mL 按2.5.2 節(jié)的操作測定三萜提取率為10.67 mg·g-1, 明顯低于同批次、同條件下微生物發(fā)酵前處理靈芝三萜提取率13.06 mg·g-1, 結(jié)果見圖2。由此可見, 微生物發(fā)酵前處理可顯著提高靈芝三萜提取率。

圖2 發(fā)酵靈芝和未發(fā)酵靈芝三萜提取率比較

4 結(jié)論

經(jīng)康寧木霉LZ51 (Trichodermakoningii) 發(fā)酵處理得到的發(fā)酵靈芝, 靈芝總多糖最佳提取工藝為: 以水為提取劑、用量為10 mL·g-1、100 ℃下浸提3.5 h, 在該最佳提取工藝條件下總多糖提取率可達(dá)50.92 mg·g-1; 靈芝三萜最佳提取工藝為:以無水乙醇為提取劑、用量為10 mL·g-1、50 ℃下浸提2 h, 在該最佳提取工藝條件下靈芝三萜提取率可達(dá)13.06 mg·g-1。而同產(chǎn)地、同批次未經(jīng)發(fā)酵前處理的靈芝粉末在相同提取條件下總多糖提取 率 僅 34.02 mg ·g-1, 靈 芝 三 萜 提 取 率 為10.67 mg·g-1, 均 明 顯 低 于 經(jīng) 康 寧 木 霉 LZ51(Trichodermakoningii) 發(fā)酵處理得到的發(fā)酵靈芝。由此可見, 微生物發(fā)酵前處理可顯著提高靈芝總多糖和三萜提取率。