戴惠明, 鄭潔敏, 黃宗貴, 李亞萍, 姜武, 陳家棟

(1.永嘉縣林業(yè)技術(shù)推廣中心, 浙江 永嘉 325100; 2.溫州市種子站, 浙江 溫州 325005;3.浙江省亞熱帶作物研究所, 浙江 溫州 325005)

梔子 (Garadeniajasminoides) 是茜草科的一種常綠灌木, 也叫作黃梔子、紅枝子等, 主要產(chǎn)地為浙江、江西、湖南等[1]。梔子是我國(guó)常見(jiàn)的大宗藥材之一, 主要有效成分為梔子苷、西紅花苷、有機(jī)酸等, 具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒、散瘀血等功效, 臨床用于熱病心煩、濕熱黃疸、小便黃短、尿血、腎盂炎、熱毒瘡等癥, 是治療黃疸性肝炎的首選藥物[2]。梔子也是重要的生態(tài)經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種和觀賞樹(shù)種, 不僅具有經(jīng)濟(jì)壽命長(zhǎng)、價(jià)值高的特點(diǎn), 而且四季常綠, 形態(tài)優(yōu)美。梔子也是入選衛(wèi)生部首批藥食兩用中藥材名錄的藥材。

梔子可用種子、扦插和分株繁殖3 種育苗方法。種子繁殖具有管理便捷, 成本低等優(yōu)勢(shì); 扦插繁殖具有苗木數(shù)量大, 成株后生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。因此, 種子繁育和扦插是目前生產(chǎn)上采用的主要方法[3-4]。梔子是小型灌木, 在種子育苗過(guò)程中存在種子萌發(fā)率低, 育苗周期長(zhǎng)等問(wèn)題, 扦插繁殖也有存活率低下, 小苗抗逆性弱等問(wèn)題。近幾年, 梔子的需求與日俱增, 市場(chǎng)對(duì)梔子種苗的需求也逐漸增大。

土壤中的菌根真菌能與植物根系共生, 形成菌根共生體, 是植物適應(yīng)環(huán)境的重要機(jī)制之一。研究表明, 地球上絕大部分的陸生植物都可以形成叢枝菌根。菌根形成后, 植物能夠通過(guò)菌根真菌的根外菌絲吸收非根際區(qū)土壤中的養(yǎng)分, 尤其是對(duì)磷、氮、鉀等養(yǎng)分的吸收, 從而提高對(duì)土壤中養(yǎng)分的利用, 以促進(jìn)植物的生長(zhǎng), 減少植物對(duì)肥料的依賴[5-6]。菌根共生可以通過(guò)調(diào)劑植物次生代謝產(chǎn)物的變化, 提高宿主適應(yīng)環(huán)境脅迫的能力[7]。

激素是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的調(diào)節(jié)劑, 同時(shí)也能夠調(diào)控菌根共生系統(tǒng)的形成[8]。研究[9]發(fā)現(xiàn),接種菌根真菌會(huì)促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)素的累積。接種菌根真菌玉米根系中檢測(cè)到細(xì)胞分裂素的含量大幅提高, 植物激素也對(duì)種子的萌發(fā)起到關(guān)鍵作用[10]。過(guò)氧化物酶 (POD)、過(guò)氧化氫酶 (CAT)、超氧化物歧化酶 (SOD) 能在梔子種子萌發(fā)階段發(fā)揮作用, 清除種子的活性氧, 減少種子產(chǎn)生的丙二醛等有害代謝物對(duì)種子的傷害[11]。

菌根化栽培技術(shù)已在農(nóng)、林業(yè)生產(chǎn)中被廣泛使用, 具有促進(jìn)作物生長(zhǎng)、提高作物抗逆性、減少肥料施用、改善土壤理化結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)。目前, 菌根化栽培在梔子生產(chǎn)應(yīng)用中較少, 因此, 利用菌根化技術(shù)提高梔子種子萌發(fā)率及促進(jìn)扦插苗的生長(zhǎng), 縮短育種周期, 對(duì)梔子產(chǎn)業(yè)具有積極的意義, 也為梔子的菌根化栽培推廣提供了數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用種子和扦插苗均為梔子玉香, 在永嘉縣金溪鎮(zhèn)六龍村基地采收, 經(jīng)浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶作物研究所陶正明研究員鑒定。

本實(shí)驗(yàn)用到的菌根真菌為Rhizophagus irregularis(R.irregularis), 購(gòu)于北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與資源研究所。菌種由浙江省亞熱帶作物研究所陳家棟博士擴(kuò)繁, 使用煙草和三葉草為宿主植物, 基質(zhì)為體積比3 ∶1 的黃沙和石英砂, 菌根共生3 個(gè)月后, 停止?jié)菜? 讓植物自然死亡。經(jīng)擴(kuò)繁后, 菌劑主要成分為菌絲體、孢子果、孢子。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 梔子種子萌發(fā)處理

將梔子種子與濕潤(rùn)的營(yíng)養(yǎng)土混合, 充分濕潤(rùn)種子, 同時(shí)加入菌劑, 對(duì)照加入121 ℃滅活的菌劑,在溫度為28 和24 ℃, 光照14 h、黑暗10 h 的環(huán)境下培養(yǎng)。

1.2.2 梔子種子萌發(fā)率和出苗率測(cè)定

在上述條件下處理?xiàng)d子種子25 d, 在實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率, 以梔子胚根突破種皮確定為種子萌發(fā);接著在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)60 d, 然后統(tǒng)計(jì)梔子地上部分的出苗情況。

1.2.3 梔子扦插苗接菌處理

剪取樹(shù)齡為5 a 的成年梔子枝條, 去葉, 傷口用高錳酸鉀消毒后插入土壤, 外源施加含有菌根孢子的菌劑作為處理, 對(duì)照組施用經(jīng)121 ℃滅活的菌劑。扦插5 個(gè)月后統(tǒng)計(jì)扦插成活率及根系生長(zhǎng)狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2021 年3 月, 環(huán)境溫度為15～30 ℃。

1.2.4 梔子激素提取及測(cè)定

取1 g 梔子樣品加入10 倍體積的乙腈提取過(guò)夜, 低溫離心機(jī)12 000 r·min-1離心10 min, 獲得上清液, 然后加入C-18 固相萃取體, 劇烈振蕩30 s 后, 10 000g離心5 min, 將上清液轉(zhuǎn)移到新的 離 心 管, 氮 氣 吹 干。用 200 μL 甲 醇 復(fù) 溶,0.22 μm 有機(jī)相膜過(guò)濾。使用HPLC-MS/MS (美國(guó)安捷1260) 測(cè)定植物激素。流動(dòng)相分別為: 甲醇/0.1%甲酸和水/0.1%甲酸。

1.2.5 梔子酶活性測(cè)定

取一定部位的植物葉片 (視需要定, 去葉脈)0.5 g 于預(yù)冷的研缽中, 1 mL 預(yù)冷的磷酸緩沖液在冰浴上研磨成漿, 加緩沖液至終體積為5 mL。取1.5～2.0 mL 于1 000 r·min-1下離心20 min, 上清液即為酶活測(cè)定粗提液。POD 活性測(cè)定參考李鑫[12], SOD 活性測(cè)定參考趙春旭等[13], CAT 活性測(cè)定參照張?zhí)m等[11]方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌根真菌共生對(duì)梔子種子萌發(fā)及生長(zhǎng)的影響

2.1.1 菌根共生對(duì)梔子種子的萌發(fā)率和出苗率的影響

梔子種子播種后, 在保證濕度和環(huán)境溫度適宜的條件下, 大約需要20 d 發(fā)芽。在本研究中, 播種處理25 d 后統(tǒng)計(jì)梔子種子的萌發(fā)率, 再過(guò)60 d后統(tǒng)計(jì)出苗率。根據(jù)圖1 可知, 接種菌根真菌的種子萌發(fā)率為88.35%, 對(duì)照僅為70.22%。接種菌根真菌梔子出苗率為68.33%, 對(duì)照為58.77%。

圖1 菌根共生對(duì)梔子萌發(fā)率和出苗率的影響

2.1.2 菌根共生對(duì)梔子小苗生長(zhǎng)的影響

處理60 d 后, 觀察梔子小苗生長(zhǎng)狀態(tài), 圖2中B 可以看出接種菌根真菌小苗生長(zhǎng)狀況顯著優(yōu)于對(duì)照組。經(jīng)測(cè)定, 接種菌根真菌和對(duì)照梔子幼苗的地上部長(zhǎng)度分別為3.47 和2.56 cm, 根長(zhǎng)分別為2.91 和1.96 cm。結(jié)果表明, 接種菌根真菌能有效促進(jìn)梔子地上部和根系生長(zhǎng)。取接種菌根真菌的根系, 經(jīng)曲利本藍(lán)染色后, 在顯微鏡下觀察, 如圖2 中C 顯示, 接種菌根真菌梔子根部已經(jīng)形成從枝結(jié)構(gòu) (紅色箭頭標(biāo)注), 說(shuō)明梔子幼苗根部菌根共生良好。

圖2 菌根共生對(duì)梔子幼苗生長(zhǎng)的影響

2.1.3 菌根共生對(duì)梔子激素含量的影響

相關(guān)研究表明, 菌根共生能夠調(diào)節(jié)植物激素水平, 調(diào)控植物的表型變化。植物激素是植物發(fā)育的中樞調(diào)節(jié)劑, 在種子萌發(fā)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此, 在接菌60 d 后, 我們測(cè)定了2 個(gè)處理的梔子中激素含量。由表1 可知, 菌根共生實(shí)驗(yàn)組中吲哚乙酸 (IAA)、細(xì)胞分裂素、赤霉素的含量分別為1.533、0.342、1.423 ng ·g-1, 均 顯 著 高 于 對(duì)照組。

表1 菌根共生對(duì)梔子激素含量的影響

2.1.4 菌根共生對(duì)梔子酶活性的影響

POD 廣泛存在于植物體內(nèi), 屬于活性較高的酶種類, 相關(guān)研究[12]表明, POD 與植物呼吸作用、光合作用及生長(zhǎng)素的氧化均有著密切關(guān)系。CAT 主要存在于植物細(xì)胞的葉綠體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中, 與植物抗氧化防御能力相關(guān)[11], SOD 主要起到清除超氧陰離子自由基的作用, 也是植物抗氧化酶系統(tǒng)的第一道防線, 具有反映植物抵抗逆境傷害的能力[13]。在本研究中, 測(cè)定2 個(gè)處理60 d后梔子體內(nèi)POD、CAT、SOD 活性。由表2 可知,菌根共生梔子POD、CAT、SOD 活性均顯著高于對(duì)照組。

表2 菌根共生對(duì)梔子POD、CAT、SOD活性的影響

2.2 菌根真菌共生對(duì)梔子扦插苗的影響

2.2.1 菌根共生對(duì)梔子扦插苗成活率及根系生長(zhǎng)的影響

梔子扦插的成活率是制約梔子種苗行業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素, 在本研究中, 比較接種菌根真菌對(duì)梔子扦插的影響。接種菌根真菌處理5 個(gè)月后, 統(tǒng)計(jì)梔子扦插成活率。結(jié)果顯示, 未接種菌根真菌梔子苗存活率為60.25%, 接種菌根真菌梔子苗存活率為85.70% (圖3)。接種菌根真菌扦插苗根長(zhǎng)為10.98 cm, 每個(gè)枝條生根15.43 條, 質(zhì)量為4.91 g, 均顯著大于對(duì)照組 (表3)。

表3 菌根共生對(duì)梔子扦插苗根系的影響

圖3 菌根真菌對(duì)梔子扦插苗的影響

2.2.2 菌根共生對(duì)梔子扦插根系激素的影響

激素是植物生根過(guò)程中重要的影響因素, 在本研究中, 我們測(cè)定了2 個(gè)扦插處理的梔子根系中激素含量。由表4 可知, 菌根共生實(shí)驗(yàn)組中IAA、赤霉素的含量分別為0.754、0.521 ng·g-1, 顯著高于對(duì)照組; 脫落酸含量的趨勢(shì)與IAA 和赤霉素含量相反, 接菌組脫落酸含量為0.612 ng·g-1, 顯著低于對(duì)照。

表4 菌根共生對(duì)梔子扦插苗激素含量的影響

2.2.3 菌根共生對(duì)梔子扦插苗酶活性的影響

在本研究中, 在菌根共生以及對(duì)照組扦插苗生長(zhǎng)5 個(gè)月后, 檢測(cè)扦插苗梔子根系POD、CAT、SOD 活性。由表5 可知, 菌根共生梔子苗中POD、CAT、SOD 活性均顯著高于對(duì)照組 (表5)。

表5 菌根共生對(duì)梔子扦插苗POD、CAT、SOD 活性的影響

3 討論

地球上絕大多數(shù)的植物都能和菌根真菌形成共生, 菌根共生能夠促進(jìn)植物的生長(zhǎng), 增強(qiáng)宿主植物應(yīng)對(duì)各種環(huán)境脅迫的耐受性, 菌根的形成是植物適應(yīng)外界環(huán)境變化的一種響應(yīng)機(jī)制[14]。目前, 菌根化栽培已經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)、林業(yè)的生產(chǎn)實(shí)踐。相關(guān)研究[15]表明, 接種菌根真菌能夠有效提高玉米根系活力。在干旱脅迫下, 菌根共生能夠通過(guò)促進(jìn)宿主植物根長(zhǎng)增加、側(cè)根形成、根毛密度增大、根表面積擴(kuò)大等方式提高水分的吸收能力, 以緩解干旱對(duì)植物造成的危害[16]。菌根共生可以影響宿主植物對(duì)重金屬的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)響應(yīng), 改善宿主植物的環(huán)境適應(yīng)能力, 提高其對(duì)重金屬的耐受性[17]。

本研究通過(guò)比較接種和不接種菌根真菌對(duì)梔子種子萌發(fā)率、幼苗生長(zhǎng)的影響, 觀察菌根共生對(duì)梔子扦插苗成活率、根系長(zhǎng)度的影響, 發(fā)現(xiàn)接種菌根真菌可以有效提高梔子種子的萌發(fā)率, 促進(jìn)梔子幼苗生長(zhǎng), 提高梔子扦插苗成活率, 促進(jìn)扦插苗生長(zhǎng)。通過(guò)測(cè)定接種菌根共生的梔子中激素的含量,發(fā)現(xiàn)梔子菌根共生提高IAA、赤霉素含量從而調(diào)控梔子種子萌發(fā)和生長(zhǎng); 測(cè)定接菌梔子POD、CAT、SOD 活性, 發(fā)現(xiàn)菌根共生促進(jìn)POD、CAT、SOD活性, 可以推測(cè), 菌根共生在梔子內(nèi)部經(jīng)過(guò)各種生理生化反應(yīng)積累了一定量的活性氧, 需要高活性的抗氧化酶來(lái)清除。本研究為菌根梔子的菌根化育苗工作提供了研究基礎(chǔ)和理論依據(jù)。