李茹冰 ，李偉達(dá) ，劉文婷 ，李宇璐 ，谷小紅 ，于麗娟 ，萬(wàn)華印 （.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院藥學(xué)部，廣東深圳 5807；.佛山市婦幼保健院藥劑科，廣東 佛山 58000；.廣州市眾為生物科技股份有限公司，廣州 5000）

纖維蛋白類(lèi)止血敷料主要含有纖維蛋白原和凝血酶成分，可模擬人體凝血過(guò)程的最后一步，其相關(guān)止血生物制劑可通過(guò)形成不溶性纖維蛋白而實(shí)現(xiàn)傷口的快速封閉[1—2]。臨床現(xiàn)有止血制劑多以纖維蛋白類(lèi)止血輔料為黏合劑，在使用時(shí)須提前將纖維蛋白原和凝血酶分別溶解，再利用雙針筒混合裝置噴灑至創(chuàng)面而成膠止血[3]。然而，這種須提前溶解且須配合使用特殊裝置的制劑可能會(huì)導(dǎo)致危急手術(shù)患者錯(cuò)失最佳的止血時(shí)機(jī)；同時(shí)，由于黏合劑自身的機(jī)械強(qiáng)度不足[4]，若醫(yī)護(hù)人員在噴灑后立即使用紗布吸取傷口周邊滲血，則可能會(huì)因紗布擦拭掉未成膠的止血物而導(dǎo)致制劑失效。為此，本課題組自主研制了豬源纖維蛋白貼（porcine fibrin patch，簡(jiǎn)稱(chēng)“DBT”），即以從豬血漿中提取的纖維蛋白原和凝血酶，以及從豬跟腱中提取的膠原蛋白為原料，通過(guò)特殊工藝處理并凍干而制得的海綿片劑[5]。該DBT具有海綿樣蛋白骨架結(jié)構(gòu)，無(wú)須預(yù)配，遇血即可形成纖維蛋白；加之其外層為膠原蛋白，能有效防止制劑與紗布或周?chē)Y(jié)締組織粘連，故可通過(guò)生化止血和機(jī)械按壓止血相結(jié)合的方式實(shí)現(xiàn)快速止血[6]。目前上市的蛋白貼劑僅有人源性TachoComb?（奧地利Nycomed公司）、TachoSil?（日本Takeda公司）、Evarrest?（美國(guó)Johnson & Johnson公司）等品種[7—8]，尚無(wú)豬源性同類(lèi)制劑。

根據(jù)本課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和國(guó)內(nèi)外臨床應(yīng)用研究，纖維蛋白類(lèi)止血制劑的用量需根據(jù)創(chuàng)面大小和止血情況疊加使用，且止血物需在體內(nèi)降解，故其量效關(guān)系主要體現(xiàn)于制劑的成分組成及含量[9—10]。為更直觀地顯示DBT的內(nèi)在量效關(guān)系，本文運(yùn)用了Box-Behnken-響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法，以DBT的黏合強(qiáng)度、持黏力和吸水力3個(gè)與止血性能密切相關(guān)的力學(xué)參數(shù)為檢測(cè)指標(biāo)[11—12]，以其總評(píng)歸一化（overall desirability，OD）值為響應(yīng)值，對(duì)凍干前纖維蛋白原、凝血酶和膠原蛋白3個(gè)主要有效成分的含量進(jìn)行優(yōu)化，以保障DBT止血效果的充分發(fā)揮，也為同類(lèi)產(chǎn)品的研究開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括BLD-1028型剝離強(qiáng)度試驗(yàn)機(jī)、BLD-1008A型保持力測(cè)試儀（東莞博萊德儀器設(shè)備有限公司），GLZY-1型凍干機(jī)（上海浦東冷凍干燥設(shè)備有限公司），KD-DTC-210型電子天平（上海亞津電子科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

纖維蛋白原備用液（批號(hào)為20140423，質(zhì)量濃度為50 mg/mL）、凝血酶?jìng)溆靡海ㄅ?hào)為20140704，效價(jià)為500 IU/mL）、膠原蛋白中間體（批號(hào)為20140603，膠原蛋白含量為0.204 g/g）均購(gòu)自廣州市眾為生物科技股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 DBT的制備

分別將適量纖維蛋白原備用液、凝血酶?jìng)溆靡汉湍z原蛋白中間體溶液（由其中間體經(jīng)鹽析、甲酸等處理所得的溶液）注入凍干模具，采用特殊凍干工藝技術(shù)將三者凍干在一起，即得DBT（規(guī)格5 cm×10 cm）。本制備工藝已申請(qǐng)專(zhuān)利，申請(qǐng)公布號(hào)為CN104491917B。

2.2 DBT的力學(xué)性能測(cè)定

2.2.1 黏合強(qiáng)度測(cè)定

參照2020年版《中國(guó)藥典》（四部）通則“0952黏附力測(cè)定法”第三法進(jìn)行測(cè)定[13]：取DBT（5 cm×10 cm），分離其黃色纖維蛋白原層和白色膠原蛋白層，取黃色纖維蛋白原層，用雙面膠將其剝離面朝上固定于不銹鋼板上，再用膠帶將該層上下兩端加以固定，使其平整貼合在鋼板上；隨后，吸取生理鹽水1 mL，均勻噴灑在該黃色層上；取棉布與該黃色層小心黏合并按壓撫平，用重壓輥來(lái)回滾壓5次，靜置30 min[溫度（25±3）oC，相對(duì)濕度（55±10）%]；將棉布自由端180度對(duì)折，并將棉布自由端和鋼板分別垂直夾于試驗(yàn)機(jī)上，同時(shí)使黃色纖維蛋白原層的剝離面與剝離強(qiáng)度試驗(yàn)機(jī)（已進(jìn)行校準(zhǔn)）線保持一致，確認(rèn)安裝無(wú)誤后，開(kāi)始測(cè)試。試驗(yàn)機(jī)以（300±10）mm/min的速度上升剝離，以剛剝離的最大強(qiáng)度為黏合強(qiáng)度。上述測(cè)試需取3片同規(guī)格的DBT，結(jié)果以平均值表示。

2.2.2 持黏力測(cè)定

參照2020年版《中國(guó)藥典》（四部）通則“0952黏附力測(cè)定法”第二法進(jìn)行測(cè)定[13]：將保持力測(cè)試儀的試驗(yàn)板和加載板緊挨并對(duì)齊，在距離兩板10～15 cm高處均勻噴灑生理鹽水0.5 mL；取DBT（2.5 cm×5 cm，剪裁所得），黏于試驗(yàn)板和加載板的中部，并用滾輪來(lái)回滾壓5次使其黏合緊密；噴水2 min后，將試驗(yàn)板固定在保持力測(cè)試儀上，在加載板下端掛上200 g的砝碼，記錄脫落時(shí)間（脫落時(shí)間須超過(guò)10 min方能符合實(shí)驗(yàn)要求）。上述測(cè)試需取3片同規(guī)格的DBT，結(jié)果以平均值表示。

2.2.3 吸水力測(cè)試

取DBT（5 cm×10 cm），精密稱(chēng)定其質(zhì)量（W1）；于室溫（25±2）oC下在生理鹽水中浸泡20 min，待其充分吸水后，取出，靜置3 min，待其無(wú)明顯水滴后再次精密稱(chēng)定其質(zhì)量（W2），按下式計(jì)算吸水力：吸水力＝W2/W1。上述測(cè)試需取3片同規(guī)格的DBT，結(jié)果以平均值表示。

2.3 DBT配方優(yōu)化的單因素實(shí)驗(yàn)

DBT的止血性能與其3個(gè)主要成分（纖維蛋白原、凝血酶和膠原蛋白）的含量密切相關(guān)，故本研究以“2.2.1”項(xiàng)下黏合強(qiáng)度為檢測(cè)指標(biāo)，以凍干前上述成分的含量（其中膠原蛋白含量以膠原蛋白中間體溶液質(zhì)量濃度計(jì)，下同）為考察因素，在固定其中2個(gè)因素的條件下進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

（1）固定凝血酶含量為6 IU/cm2、膠原蛋白含量為3 mg/cm2，考察不同纖維蛋白原含量（1.2、2.1、2.9、4.2、5.0、7.5、8.8、11 mg/cm2）對(duì)所制DBT黏合強(qiáng)度的影響。結(jié)果顯示，隨著纖維蛋白原含量的升高，黏合強(qiáng)度逐漸增大；當(dāng)纖維蛋白原含量為7.5～11 mg/cm2時(shí)，黏合強(qiáng)度的增幅明顯不如含量1.2～4.2 mg/cm2時(shí)。綜合考慮，本研究選擇纖維蛋白原含量3～9 mg/cm2進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)圖1A。

（2）固定纖維蛋白原含量為6 mg/cm2、膠原蛋白含量為3 mg/cm2，考察不同凝血酶含量（2、5、8、11、14 IU/cm2）對(duì)所制DBT黏合強(qiáng)度的影響。結(jié)果顯示，黏合強(qiáng)度曲線呈拋物線樣，當(dāng)凝血酶含量為2～11 IU/cm2時(shí)，黏合強(qiáng)度呈升高趨勢(shì)；當(dāng)凝血酶含量為11～14 IU/cm2時(shí)，黏合強(qiáng)度明顯降低（可能與凝固過(guò)快有關(guān)）。綜合考慮，本研究選擇凝血酶含量6～10 IU/cm2進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)圖1B。

（3）固定纖維蛋白原含量為6 mg/cm2、凝血酶含量為6 IU/cm2，考察不同膠原蛋白含量（1、2、3、3.75、4、5 mg/cm2，后續(xù)均以對(duì)應(yīng)的中間體溶液質(zhì)量濃度2、4、6、7.5、8、10 mg/mL表示）對(duì)所制DBT黏合強(qiáng)度的影響。結(jié)果顯示，隨著膠原蛋白含量的增加，黏合強(qiáng)度呈平緩升高的趨勢(shì)。但筆者在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)膠原蛋白質(zhì)量濃度為8、10 mg/mL時(shí)，其中間體呈非流體狀態(tài)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)凍干制劑的批量化操作。綜合考慮，本研究選擇膠原蛋白含量2.5、5、7.5 mg/mL進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)圖1C（略去8、10 mg/mL的膠原蛋白中間體溶液對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)）。

綜合上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，纖維蛋白原和凝血酶的含量對(duì)DBT黏合強(qiáng)度的影響相對(duì)明顯，且在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)；而膠原蛋白的含量對(duì)DBT黏合強(qiáng)度的影響相對(duì)較弱。

2.4 DBT配方優(yōu)化的Box-Behnken-響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.4.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，本研究采用Design-Expert 8.0.6軟件，以凍干前的纖維蛋白原含量（A）、凝血酶含量（B）和膠原蛋白含量（C）為考察因素，以黏合強(qiáng)度（Y1）、持黏力（Y2）和吸水力（Y3）3個(gè)效應(yīng)指標(biāo)的OD值為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平共17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的Box-Behnken方案。3個(gè)效應(yīng)指標(biāo)的OD值按如下步驟計(jì)算：首先，對(duì)Y1、Y2、Y3進(jìn)行歸一化處理，得di＝（Yi-Ymin）/（Ymax-Ymin）（式中，Yi為實(shí)測(cè)值，Ymax和Ymin分別為每個(gè)效應(yīng)指標(biāo)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)安排中的實(shí)測(cè)最大值和最小值）；隨后，計(jì)算OD值，即OD＝（d1+d2+d3）/3[14]。Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)安排與結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 DBT配方優(yōu)化的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

表2 DBT配方優(yōu)化的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)安排與結(jié)果

2.4.2 模型方程建立與方差分析

應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得二次多項(xiàng)回歸方程如下：OD＝0.690+0.170A+0.029B+0.110C+0.011AB-0.064AC-0.046BC-0.230A2-0.100B2-0.120C2。對(duì)該回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，模型的P＜0.01，表示其可信度較高；模型失擬檢驗(yàn)的P＞0.05，表明該模型可用于DBT最優(yōu)配方的預(yù)測(cè)；模型的調(diào)整系數(shù)（R2）為0.932 6，說(shuō)明該模型的擬合程度較好。在一次項(xiàng)中，A、C對(duì)3個(gè)效應(yīng)指標(biāo)OD值的影響顯著（P＜0.01），各因素對(duì)OD值影響的排序?yàn)锳＞C＞B；二次項(xiàng)中，A2、B2、C2對(duì)OD值影響均顯著（P＜0.05）；在交互項(xiàng)中，AB、AC、BC的影響均不顯著（P＞0.05）。

表3 DBT配方優(yōu)化的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)方差分析

應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件繪制各因素交互作用對(duì)OD值影響的二維等高線圖和三維響應(yīng)曲面圖。等高線越密集，表明OD值變化越明顯；響應(yīng)面的曲面傾斜度越大，顏色變化越明顯，表明因素間的交互作用越顯著。結(jié)果顯示，3個(gè)因素的兩兩交互之中，因素A與C的交互作用最強(qiáng)，因素A與B的交互作用次之，因素B與C的交互作用最弱。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 各因素交互作用對(duì)OD值影響的等高線圖和響應(yīng)面圖

2.4.3 DBT最優(yōu)配方的確定及驗(yàn)證

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)上述二次多項(xiàng)回歸方程求解，得DBT最優(yōu)配方為纖維蛋白原含量6.93 mg/cm2、凝血酶含量8.15 IU/cm2、膠原蛋白含量5.90 mg/mL，預(yù)測(cè)OD值為0.733 0。考慮到實(shí)際操作的可行性，本研究最終選擇DBT的最優(yōu)配方為纖維蛋白原含量6.5 mg/cm2、凝血酶含量8.0 IU/cm2、膠原蛋白含量5.6 mg/mL。

按上述最優(yōu)配方制備3批DBT，所得OD值分別0.727 5、0.722 0、0.730 3，平均OD值為0.726 6（RSD＝0.58%，n＝3），與預(yù)測(cè)OD值的相對(duì)誤差為-0.87%，表明該配方穩(wěn)定、可行。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 DBT最優(yōu)配方驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n＝3）

3 討論

本課題組所制DBT是將極易發(fā)生凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的纖維蛋白原和凝血酶經(jīng)過(guò)特殊工藝與膠原蛋白一起凍干成型而得，多以單片使用，疊加給藥無(wú)法使其止血效能加倍，反而會(huì)改變其原有結(jié)構(gòu)并增加機(jī)體降解負(fù)擔(dān)，因此通過(guò)優(yōu)化其配方以確定內(nèi)在成分含量與其止血性能的關(guān)系更為必要。為提高實(shí)驗(yàn)精確度并減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)[15]，本文選擇了Box-Behnken-響應(yīng)面法對(duì)DBT的主要成分含量進(jìn)行了優(yōu)化。

本課題組在提取純化膠原蛋白中間體溶液的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)膠原蛋白分子量越大、濃度越高時(shí)，所得溶液的黏度越高，當(dāng)膠原蛋白質(zhì)量濃度為8、10 mg/mL時(shí)，中間體已處于非流體狀態(tài)；若使用高質(zhì)量濃度非流體狀態(tài)的膠原蛋白，凍干所得制劑將沒(méi)有疏松、多孔、結(jié)構(gòu)均勻的海綿骨架，其吸收能力將會(huì)大大減弱，甚至?xí)c纖維蛋白原層分離；若通過(guò)高溫或酶水解來(lái)增加膠原蛋白的溶解度，則難以保持其三螺旋結(jié)構(gòu)，凍干所得制劑的蛋白組織結(jié)構(gòu)亦不穩(wěn)定，止血時(shí)極易發(fā)生溶解。因此，本研究選擇了膠原蛋白含量2.5～7.5 mg/mL進(jìn)入下一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。在纖維蛋白原、凝血酶含量的單因素考察中，因纖維蛋白原層的溶解度和吸水力并不強(qiáng)，故為更好地體現(xiàn)纖維蛋白原與凝血酶的效價(jià)強(qiáng)度，本研究只選擇了黏合強(qiáng)度作為效應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行分析，從而更準(zhǔn)確地選擇兩者需優(yōu)化的含量范圍。

然而，止血敷料的止血性能除了與創(chuàng)面黏附的牢固性有關(guān)外，還與其是否能快速吸收滲出血液和與創(chuàng)面黏合的持久性相關(guān)（以預(yù)防止血物短時(shí)間內(nèi)發(fā)生移位脫離）。因此，本研究在Box-Behnken-響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)中，引入黏合強(qiáng)度、持黏力和吸水力作為效應(yīng)指標(biāo)，并以三者的OD值作為綜合評(píng)價(jià)的響應(yīng)值。雖然本研究并未在方差分析中發(fā)現(xiàn)這3個(gè)主要成分含量（即3個(gè)因素）之間的交互作用，但進(jìn)一步的響應(yīng)面分析結(jié)果顯示，這3個(gè)因素之間存在一定的兩兩交互作用；同時(shí)，筆者前期分別對(duì)3個(gè)效應(yīng)值（Y1、Y2、Y3）進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)3個(gè)因素間是有顯著的交互作用存在，前后結(jié)果的差異可能與擬合OD值后部分交互作用被抵消有關(guān)。

本研究最終優(yōu)化得DBT最優(yōu)配方為纖維蛋白原含量6.93 mg/cm2、凝血酶含量8.15 IU/cm2、膠原蛋白含量5.90 mg/mL；結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，最終確定最優(yōu)配方為纖維蛋白原含量6.5 mg/cm2、凝血酶含量8.0 IU/cm2、膠原蛋白含量5.6 mg/mL。經(jīng)3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所得OD值的RSD為0.58%，與預(yù)測(cè)OD值的相對(duì)誤差為-0.87%，提示所得配方穩(wěn)定、可行。此外值得注意的是，DBT的主要有效成分含量并不完全與其止血性能成正比[16]，筆者猜想這可能與不同有效成分含量配伍凍干所得成品的孔隙率差異、微量成分發(fā)生生化反應(yīng)而影響了產(chǎn)品性能等因素有關(guān)。但上述推斷尚需通過(guò)電鏡掃描觀察和藥理、藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步論證。

綜上所述，本文優(yōu)化的DBT配方穩(wěn)定、可行。