易宇光，劉昌平，何佳佳（萍鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院神經(jīng)外科，江西 萍鄉(xiāng) 337000）

創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是神經(jīng)外科常見疾病之一，發(fā)病率高[1]。當(dāng)創(chuàng)傷事件造成腦部原發(fā)性機(jī)械損傷后，患者腦組織中氧自由基和多種細(xì)胞因子表達(dá)出現(xiàn)異常，從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損，并造成腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞繼發(fā)死亡，最終導(dǎo)致患者殘疾甚至死亡，嚴(yán)重影響其生存質(zhì)量[2]。目前，針對(duì)TBI的有效治療藥物較為匱乏，因此深入探討TBI病理機(jī)制，尋找新的、有效的腦保護(hù)藥物具有重要意義。

多種中藥提取物及活性成分對(duì)TBI具有潛在的改善作用，如廣泛存在于海洋生物體內(nèi)的蝦青素，具有強(qiáng)抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用[3]。蝦青素屬類胡蘿卜素類成分，可透過血腦屏障，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有積極的干預(yù)作用；同時(shí)，該成分可改善缺血缺氧性腦損傷大鼠的預(yù)后，具有神經(jīng)保護(hù)作用[4—5]。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激是引起TBI的重要因素[6]。核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）信號(hào)通路是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化應(yīng)激通路，其中Nrf2是氧化應(yīng)激的中樞調(diào)節(jié)因子，可在氧化應(yīng)激狀態(tài)下激活下游HO-1等抗氧化因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而發(fā)揮對(duì)氧化應(yīng)激損傷的改善作用[7]。研究表明，蝦青素可通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1信號(hào)通路來緩解多種疾病的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮器官保護(hù)作用[8—9]。本研究旨在探討蝦青素對(duì)TBI模型大鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響，并基于上述通路探討其可能機(jī)制，為該成分的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括EnSight型多功能酶標(biāo)儀（上海瑋馳儀器有限公司）、Axio Scope A1型光學(xué)顯微鏡（德國(guó)Carl Zeiss公司）、H-7650型透射電鏡（日本Hitachi公司）、ABI 7500型定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）、Amersham Imager 600RGB型超靈敏多功能成像儀（美國(guó)GE Healthcare公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

蝦青素對(duì)照品（批號(hào)A832359，純度≥98%）購(gòu)自上海麥克林生化科技股份有限公司；Nrf2抑制劑ML385對(duì)照品（批號(hào)HY-100276，純度≥98%）購(gòu)自美國(guó)MCE公司；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（批號(hào)分別為HAS-48611、HAS-47926、HAS-47902、HAS-48231）均購(gòu)自深圳海思安生物技術(shù)有限公司；過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號(hào)分別為20220827、20220807、20220814、20220829、20220816）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；熒光定量PCR試劑盒（批號(hào)DRR137A）購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；兔抗大鼠Nrf2、HO-1、NAD（P）H醌氧化還原酶1[NAD（P）H：quinone oxidoreductase 1，NQO1]、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）一抗和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（批號(hào)分別為ab158523、ab189491、ab80588、ab210319、ab203875）均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；ECL發(fā)光試劑盒（批號(hào)170-5031）購(gòu)自上海翌圣生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠75只，10～12周齡，購(gòu)自成都藥康生物科技有限公司，動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（川）2020-0034。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于溫度20～25 ℃、相對(duì)濕度40%～70%、每12 h晝夜交替并定期以紫外線消毒的動(dòng)物房?jī)?nèi)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究方案經(jīng)萍鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審批通過，批件號(hào)為2022007。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

采用改良Feeney自由落體撞擊法復(fù)制TBI大鼠模型：大鼠經(jīng)麻醉后固定于立體定位儀上，剪毛消毒后沿矢狀縫切開頭皮，露出右頂骨后行顱骨鉆孔術(shù)，打開直徑約4 mm的骨窗并保持硬腦膜完整；用40 g砝碼從40 cm高處自由落體撞擊，造成大鼠右側(cè)大腦半球腦損傷，以出現(xiàn)短暫呼吸暫停、四肢抽搐為造模成功[10]。造模前，選擇14只大鼠作為假手術(shù)組，僅開骨窗但不撞擊。剔除造模未成功和死亡的大鼠（分別為3、2只），將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、蝦青素低劑量組（20 mg/kg）、蝦青素高劑量組（40 mg/kg）、蝦青素+ML385組（40 mg/kg蝦青素+30 mg/kg ML385），每組14只。蝦青素用二甲基亞砜溶解并用生理鹽水稀釋，配制成2、4 g/L的藥液，以10 mL/kg灌胃；ML385用二甲基亞砜溶解并用生理鹽水稀釋，配制成3 g/L的藥液，以10 mL/kg腹腔注射。蝦青素低、高劑量組大鼠分別灌胃20、40 mg/kg的蝦青素；蝦青素+ML385組大鼠在灌胃40 mg/kg蝦青素的同時(shí)腹腔注射30 mg/kg的ML385；假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃等體積的生理鹽水（含二甲基亞砜）；每天1次，連續(xù)7 d。蝦青素的成人日推薦攝取量為4～50 mg[11]，按人與大鼠體表面積比換算得大鼠等效劑量為20 mg/kg，以此作為低劑量，其2倍作為高劑量。ML385的劑量參考相關(guān)文獻(xiàn)[12]設(shè)置。

2.2 大鼠神經(jīng)功能評(píng)估

分別于藥物干預(yù)后第1、3、7天，應(yīng)用Garcia評(píng)分對(duì)各組大鼠的神經(jīng)功能缺損程度進(jìn)行評(píng)估。最高分為18分，評(píng)分越低表示神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重[13]。

2.3 大鼠腦組織形態(tài)學(xué)變化觀察及炎癥浸潤(rùn)評(píng)分

藥物干預(yù)后第7天，各組取4只大鼠處死，提取其腦組織并保存于-80 ℃冰箱中，待用。取上述大鼠的損傷區(qū)腦組織（假手術(shù)組取相同位置腦組織）適量，用4%多聚甲醛溶液固定后，行常規(guī)石蠟包埋、切片，經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）染色后使用顯微鏡觀察其腦組織形態(tài)學(xué)變化情況，并進(jìn)行炎癥浸潤(rùn)評(píng)分，具體標(biāo)準(zhǔn)如下：無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，記0分；有少量散在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，記1分；小血管周圍可見“血管套”結(jié)構(gòu)，記2分；可見大面積廣泛炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，記3分[14]。

2.4 大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

取“2.3”項(xiàng)下各大鼠余下缺損區(qū)腦組織（假手術(shù)組取相同位置腦組織），切成2 mm厚的組織塊，于2.5%戊二醛電鏡固定液中靜置6 h，然后用磷酸鹽緩沖溶液沖洗，再用1%四氧化鋨磷酸緩沖液固定，行丙酮脫水、環(huán)氧樹脂618原位包埋、切片，經(jīng)枸櫞酸鉛和醋酸雙氧鈾染色后使用透射電鏡觀察并拍照，記錄其腦組織神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變情況。

2.5 大鼠腦組織氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

末次給藥1 h后，處死各組剩余10只大鼠，取其損傷區(qū)腦組織（假手術(shù)組取相同位置腦組織）適量，制備腦組織勻漿，通過化學(xué)比色法檢測(cè)大鼠腦組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)（SOD、CAT、GSH-Px、MDA、NO）的含量，通過ELISA法檢測(cè)其腦組織中炎癥反應(yīng)指標(biāo)（TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS）的含量。上述操作均嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書執(zhí)行。

2.6 大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)PCR（real-time PCR，RT-PCR）法進(jìn)行檢測(cè)。取“2.5”項(xiàng)下各大鼠損傷區(qū)腦組織（假手術(shù)組取相同位置腦組織）適量，采用Trizol法提取總RNA，檢測(cè)RNA濃度后將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以上述cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書操作。反應(yīng)體系包括：10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTP混合液3 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，TaqDNA聚合酶1 μL，Mg2+1.5 μL，加水（經(jīng)焦碳酸二乙酯處理）至25 μL。反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃再延伸5 min。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。Nrf2的上、下游引物分別為5'-TCAGCGACTGTCACTCGATGA-3'、5'-CCACTGGTCGTGGAGTGGATG-3'；HO-1的上、下游引物分別為5'-GGGTCGTCAGTACCAGTTTC-3'、5'-CCAGGCATCGGCAGCAATTC-3'；NQO1的上、下游引物分別為5'-ATCCTGCGCTACTGCGACTT-3'、5'-GCATGCTAGAGTGTTCTCTCCT-3'；GAPDH的上、下游引物分別為5'-CTCGCTTCTGAAGCACA-3'，5'-AACGCTGCTCGAATTTGCGT-3'。

2.7 大鼠Nrf2/HO-1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。取“2.5”項(xiàng)下各大鼠損傷區(qū)腦組織（假手術(shù)組取相同位置腦組織）適量，加入RIPA裂解液提取總蛋白，于沸水中加熱10 min變性；取變性蛋白適量，經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，以5%脫脂奶粉封閉1 h；用TBST緩沖液清洗2 min×3次，加入Nrf2、HO-1、NQO1、β-actin一抗（稀釋比例均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜；用TBST緩沖液清洗2 min×3次，加入相應(yīng)二抗（稀釋比例為1∶2 000），室溫孵育1 h；用TBST緩沖液清洗2 min×3次，加入ECL顯色，置于多功能成像儀下成像，并采用Image J 5.0軟件進(jìn)行分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）的灰度值比值表示各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠第1、3、7天時(shí)的神經(jīng)功能評(píng)分均顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，蝦青素高劑量組大鼠在藥物干預(yù)第1天時(shí)和蝦青素低、高劑量組大鼠在藥物干預(yù)第3、7天時(shí)的神經(jīng)功能評(píng)分均顯著升高（P＜0.05），且隨著蝦青素干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠神經(jīng)功能評(píng)分有升高的趨勢(shì)。與同期蝦青素高劑量組比較，蝦青素+ML385組大鼠在藥物干預(yù)第1、3、7天時(shí)的神經(jīng)功能評(píng)分均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分和炎癥浸潤(rùn)評(píng)分的比較（±s，分）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分和炎癥浸潤(rùn)評(píng)分的比較（±s，分）

a：與假手術(shù)組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與蝦青素高劑量組比較，P＜0.05。

神經(jīng)功能評(píng)分（n＝14）炎癥浸潤(rùn)評(píng)分（n＝4）0.46±0.03 3.14±0.31a 2.58±0.28b 1.63±0.21b 2.95±0.29c組別假手術(shù)組模型組蝦青素低劑量組蝦青素高劑量組蝦青素+ML385組第1天16.70±0.68 9.20±1.03a 10.00±1.25 11.10±1.45b 9.53±1.16c第3天16.50±0.71 9.00±1.33a 10.70±1.70b 11.80±1.93b 9.72±1.66c第7天16.80±0.42 9.20±1.69a 12.50±1.58b 13.70±1.89b 9.85±1.70c

3.2 各組大鼠腦組織的病理形態(tài)

假手術(shù)組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)較為完整，細(xì)胞間質(zhì)無明顯水腫；模型組大鼠損傷區(qū)腦組織結(jié)構(gòu)受損，水腫明顯，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，其炎癥浸潤(rùn)評(píng)分較假手術(shù)組顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，蝦青素低、高劑量組大鼠損傷區(qū)腦組織有不同程度改善，水腫現(xiàn)象逐漸減輕，炎癥細(xì)胞逐漸減少，其炎癥浸潤(rùn)評(píng)分均較模型組顯著降低（P＜0.05），且以蝦青素高劑量組效果更好。蝦青素+ML385組大鼠的腦組織病理形態(tài)與模型組相似，其炎癥浸潤(rùn)評(píng)分較蝦青素高劑量組顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表1、圖1。

圖1 各組大鼠腦組織病理改變的顯微圖（HE染色）

3.3 各組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)

假手術(shù)組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞中各細(xì)胞器形態(tài)和結(jié)構(gòu)均較完整，神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)基本正常；模型組大鼠腦組織中各細(xì)胞器形態(tài)受損明顯，數(shù)量明顯減少，神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重；蝦青素低劑量組大鼠上述癥狀有逐漸好轉(zhuǎn)趨勢(shì)，蝦青素高劑量組大鼠腦組織中各細(xì)胞器受損形態(tài)及神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)均明顯好轉(zhuǎn)，且接近于假手術(shù)組。蝦青素+ML385組大鼠上述癥狀與模型組相似。結(jié)果見圖2。

圖2 各組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的電鏡掃描圖

3.4 各組大鼠腦組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)含量

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中SOD、CAT、GSH-Px、NO含量均顯著降低，MDA含量顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，蝦青素低、高劑量組大鼠腦組織中SOD、CAT、GSH-Px（低劑量組除外）、NO含量均顯著升高，MDA含量均顯著降低，且上述指標(biāo)（GSH-Px除外）的變化均有劑量依賴性（P＜0.05）。與蝦青素高劑量組比較，蝦青素+ML385組大鼠腦組織中SOD、CAT、GSH-Px、NO含量均顯著降低，MDA含量顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠腦組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)含量的比較（±s，n＝10）

表2 各組大鼠腦組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)含量的比較（±s，n＝10）

a：與假手術(shù)組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與蝦青素低劑量組比較，P＜0.05；d：與蝦青素高劑量組比較，P＜0.05。

NO/（μmol/g）2.91±0.45 1.38±0.66a 1.97±0.52b 2.59±0.35bc 1.46±0.59d組別假手術(shù)組模型組蝦青素低劑量組蝦青素高劑量組蝦青素+ML385組SOD/（U/g）19.13±1.62 9.09±1.15a 13.74±1.40b 16.87±1.59bc 11.44±1.32d CAT/（U/g）3.63±0.55 2.23±0.67a 2.86±0.55b 3.59±0.82bc 2.50±0.71d GSH-Px/（U/mg）182.67±14.22 148.87±26.43a 166.43±15.41 177.69±17.33b 152.19±18.02d MDA/（nmol/g）8.32±1.21 17.85±2.78a 14.36±2.45b 10.04±1.23bc 16.55±2.27d

3.5 各組大鼠腦組織中炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)含量

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS含量均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，蝦青素低、高劑量組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS含量均顯著降低，且上述指標(biāo)的變化均有劑量依賴性（P＜0.05）。與蝦青素高劑量組比較，蝦青素+ML385組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS含量均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠腦組織中炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)含量的比較（±s，n＝10）

表3 各組大鼠腦組織中炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)含量的比較（±s，n＝10）

a：與假手術(shù)組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與蝦青素低劑量組比較，P＜0.05；d：與蝦青素高劑量組比較，P＜0.05。

IL-6/（pg/mg）3.74±0.75 11.78±1.06a 7.85±1.26b 6.19±0.94bc 9.83±1.17d組別假手術(shù)組模型組蝦青素低劑量組蝦青素高劑量組蝦青素+ML385組TNF-α/（pg/mg）2.59±0.44 9.52±0.77a 6.69±0.92b 5.11±0.64bc 8.44±0.82d IL-1β/（pg/mg）5.40±1.45 12.63±1.17a 10.04±1.65b 7.92±1.07bc 11.06±1.25d iNOS/（ng/mg）84.39±5.31 195.64±9.67a 145.69±9.52b 102.35±7.74bc 172.65±10.55d

3.6 各組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，蝦青素低、高劑量組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平均顯著升高，且上述指標(biāo)的變化均有劑量依賴性（P＜0.05）。與蝦青素高劑量組比較，蝦青素+ML385組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表4。

表4 各組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較（±s，n＝10）

表4 各組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較（±s，n＝10）

a：與假手術(shù)組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與蝦青素低劑量組比較，P＜0.05；d：與蝦青素高劑量組比較，P＜0.05。

NQO1 mRNA 1.18±0.13 0.95±0.08a 1.49±0.06b 1.97±0.12bc 1.26±0.10d組別假手術(shù)組模型組蝦青素低劑量組蝦青素高劑量組蝦青素+ML385組Nrf2 mRNA 1.12±0.22 0.78±0.15a 1.02±0.09b 1.31±0.16bc 0.83±0.11d HO-1 mRNA 1.33±0.33 1.06±0.10a 1.80±0.19b 2.46±0.32bc 1.35±0.13d

3.7 各組大鼠Nrf2/HO-1信號(hào)通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，蝦青素低、高劑量組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平均顯著升高，且上述指標(biāo)的變化均有劑量依賴性（P＜0.05）。與蝦青素高劑量組比較，蝦青素+ML385組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表5、圖3。

圖3 各組大鼠Nrf2/HO-1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖

表5 各組大鼠Nrf2/HO-1信號(hào)通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較（±s，n＝10）

表5 各組大鼠Nrf2/HO-1信號(hào)通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較（±s，n＝10）

a：與假手術(shù)組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與蝦青素低劑量組比較，P＜0.05；d：與蝦青素高劑量組比較，P＜0.05。

NQO1/β-actin 1.16±0.10 0.69±0.07a 0.95±0.09b 1.06±0.09bc 0.80±0.08d組別假手術(shù)組模型組蝦青素低劑量組蝦青素高劑量組蝦青素+ML385組Nrf2/β-actin 1.09±0.14 0.47±0.04a 0.59±0.08b 0.75±0.11bc 0.52±0.06d HO-1/β-actin 1.14±0.09 0.62±0.08a 0.81±0.07b 0.93±0.08bc 0.74±0.08d

4 討論

TBI是由于機(jī)械性沖擊致腦組織嚴(yán)重?fù)p傷的一類疾病，包括原發(fā)性和繼發(fā)性腦損傷[15]。研究表明，繼發(fā)性腦損傷是原發(fā)性腦損傷后慢性神經(jīng)變性及神經(jīng)功能損傷的主要機(jī)制，可進(jìn)一步加重患者的腦損傷程度，是導(dǎo)致患者神經(jīng)功能障礙和死亡的重要原因之一，而氧化應(yīng)激是繼發(fā)性腦損傷的核心病理環(huán)節(jié)[6，16—17]。因此，改善氧化應(yīng)激對(duì)TBI的治療具有重要意義。作為純天然抗氧化劑，蝦青素的抗氧化活性較其他類胡蘿卜素類成分更強(qiáng)，且具有清除自由基、保護(hù)神經(jīng)等作用，已成為近年來的研究熱點(diǎn)[18]。研究表明，蝦青素能減輕腦出血大鼠的炎癥反應(yīng)和腦水腫，提高其血腦屏障通透性并減輕神經(jīng)功能損傷[19]。本研究采用改良Feeney自由落體撞擊法構(gòu)建TBI大鼠模型，結(jié)果顯示，模型組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分顯著低于假手術(shù)組，蝦青素低、高劑量組的神經(jīng)功能評(píng)分明顯高于模型組，且隨著蝦青素濃度的升高和藥物干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)功能評(píng)分也有升高的趨勢(shì)。這說明，蝦青素對(duì)TBI大鼠的神經(jīng)功能有一定的改善作用。

本研究進(jìn)一步探討了蝦青素對(duì)TBI大鼠腦組織及神經(jīng)細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示，蝦青素低、高劑量組大鼠腦組織水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度均有所減輕，其炎癥浸潤(rùn)評(píng)分較模型組顯著降低；同時(shí)，蝦青素低、高劑量組大鼠神經(jīng)細(xì)胞各細(xì)胞器受損形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)均有所好轉(zhuǎn)，且高劑量組與假手術(shù)組相似。這表明，蝦青素能有效改善TBI大鼠腦組織及神經(jīng)細(xì)胞的病理狀態(tài)。

研究表明，TBI后機(jī)體會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，可產(chǎn)生大量的活性氧，當(dāng)活性氧的生成量超過機(jī)體清除能力時(shí)，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蛋白會(huì)被大量自由基氧化，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡[20]。其中，SOD是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化因子，當(dāng)其含量降低時(shí)，機(jī)體的抗氧化能力也隨之減弱；CAT、GSH-Px含量間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力；MDA是系統(tǒng)氧化應(yīng)激損傷的主要標(biāo)志物之一，其可造成血管內(nèi)皮損傷，從而導(dǎo)致NO分泌減少，血管收縮功能受損[21—22]。本研究結(jié)果顯示，蝦青素可顯著升高TBI大鼠腦組織中SOD、CAT、GSH-Px、NO含量，降低MDA含量，且上述指標(biāo)（GSH-Px除外）的變化均有劑量依賴性。這表明，蝦青素可有效減輕TBI大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

TBI損傷發(fā)生后，加劇的炎癥反應(yīng)可破壞血腦屏障、損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而進(jìn)一步加重腦損傷[23]。既往研究表明，TBI大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥細(xì)胞因子呈過量表達(dá)，從而介導(dǎo)了腦組織炎癥反應(yīng)和繼發(fā)性腦損傷[24]。本研究結(jié)果顯示，蝦青素低、高劑量組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS含量均顯著低于模型組，且有劑量依賴性。這表明，蝦青素可有效減輕TBI大鼠的炎癥反應(yīng)。

Nrf2/HO-1信號(hào)通路與多種組織器官的氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)，在正常生理情況下，Nrf2被Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）固定在細(xì)胞質(zhì)中，因發(fā)生泛素化而被蛋白酶體快速降解；在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，Nrf2可從Keap1中釋放并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合并發(fā)揮抗氧化作用，活化的Nrf2可調(diào)控下游抗氧化因子表達(dá)，其下游關(guān)鍵靶點(diǎn)HO-1、NQO1表達(dá)的上調(diào)對(duì)抑制氧化還原反應(yīng)和對(duì)抗外來有害物質(zhì)侵襲具有重要作用[25—26]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白及mRNA的相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低；與模型組比較，蝦青素低、高劑量組上述指標(biāo)均劑量依賴性地上升。為了明確激活的Nrf2/HO-1信號(hào)通路是否參與了蝦青素的神經(jīng)保護(hù)作用，本研究聯(lián)合應(yīng)用Nrf2抑制劑ML385和蝦青素進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，與蝦青素高劑量組比較，蝦青素+ML385組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分，SOD、CAT、GSH-Px、NO含量和Nrf2、HO-1、NQO1蛋白及mRNA的相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低，炎癥浸潤(rùn)評(píng)分、MDA含量、炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)含量均顯著升高，其腦組織病理形態(tài)和神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)均與模型組相似，佐證了蝦青素對(duì)TBI大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用與激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，蝦青素可能通過激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路而減輕TBI大鼠的氧化應(yīng)激，緩解其神經(jīng)功能損傷，降低炎癥反應(yīng)水平。