呂元菊，吳文麗，劉澤梅，鄭光艷，王立紅，車鑫 （貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴陽 550025）

頭花蓼是蓼科植物頭花蓼Persicariacapitata（Buch.-Ham.ex D.Don）H.Gross的干燥全草或地上部分，有清熱利濕、活血止痛的功效，苗醫(yī)常用頭花蓼單方入藥治療各類感染[1]。傳統(tǒng)傷口敷料對創(chuàng)面有一定保護(hù)作用，但無法維持創(chuàng)面的濕潤環(huán)境，且更換敷料時易造成二次創(chuàng)傷[2]，導(dǎo)致患者依從性差。靜電紡絲技術(shù)是近年來興起的一種新的創(chuàng)面敷料制備方法。基于該技術(shù)制備的納米纖維材料與細(xì)胞外基質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能相似，在創(chuàng)面修復(fù)過程中可起到細(xì)胞支架作用，利于細(xì)胞的黏附、增殖和分化[3]。此外，其中的納米纖維材料還具有較高的孔隙率，有利于創(chuàng)面修復(fù)過程中氧氣和水等充分交換，可為傷口提供理想的愈合環(huán)境，有助于促進(jìn)傷口愈合。本課題組前期研究以頭花蓼提取物作為抗菌促愈合藥物，以聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrro-lidone，PVP）和聚己內(nèi)酯（polycaprolactone，PCL）作為紡絲材料，通過靜電紡絲技術(shù)成功制備了頭花蓼納米纖維功能敷料（下文簡稱“P-PVP-PCL”）[4]?；诖耍狙芯繉-PVP-PCL的抑菌活性、抗氧化活性、生物相容性以及促創(chuàng)面愈合效果進(jìn)行了評價，以探究P-PVPPCL的體內(nèi)外藥效，旨在為P-PVP-PCL的進(jìn)一步開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有FA2004型萬分之一分析天平和FA2035型十萬分之一分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司），Inspect型掃描電子顯微鏡（美國FEI公司），752型紫外分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司），USA 3131型二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo Electron公司），CKX53型倒置顯微鏡[奧林巴斯（中國）有限公司]，Synergy2型熒光吸收酶標(biāo)儀（美國Agilent公司），F(xiàn)D-1C-50型冷凍干燥機(jī)（上海繼譜電子科技有限公司），Leica-2016型轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)（德國Leica公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

頭花蓼飲片購自四平市百草堂中藥飲片有限公司，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院吳之坤副教授鑒定為蓼科植物頭花蓼P.capitata（Buch.-Ham.ex D.Don） H.Gross的干燥全草；PVP（K-30，分子量4萬）購自上海源葉生物科技有限公司；PCL（800C，分子量8萬）購自深圳光華偉業(yè)股份有限公司；MEM培養(yǎng)基（批號WH0022C031）購自武漢普諾賽生命科技有限公司；MTT（批號917Q053）和2.5%戊二醛（批號P1126）均購自北京索萊寶科技有限公司；蘇木精染液（批號CR22002071）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（批號GB23303）購自武漢塞維爾生物科技有限公司；伊紅染液（批號YE2080）和改良Masson三色染色液（批號0420A22）均購自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；3，3'-二氨基聯(lián)苯胺（3，3'-diaminobenzidine，DAB）試劑盒（批號ZLI-9018）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；正常山羊血清（批號AR1009）購自武漢博士德生物工程有限公司；兔源血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，CD31）單克隆抗體（批號ab182981）購自美國Abcam公司；兔源轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）單克隆抗體（批號BS-20411R）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物和細(xì)胞

健康SD大鼠36只，雄性，體重（200±20）g，由貴州中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（黔）2021-0003。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理審核委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為20220092。

小鼠成纖維L929細(xì)胞，購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

2 方法

2.1 樣品的制備與表征

2.1.1 P-PVP-PCL的制備

（1）制備PCL紡絲液：取一定量PCL于體積分?jǐn)?shù)為90%的醋酸溶液中，室溫下攪拌至全部溶解，制成含量為25%的PCL紡絲液。（2）制備含藥PVP紡絲液：根據(jù)前期研究方法制備頭花蓼提取物[4]。精密稱取頭花蓼提取物50 mg，加5 mL無水乙醇，超聲使溶解，得頭花蓼提取物乙醇溶液。另取適量PVP加入頭花蓼提取物乙醇溶液中，攪拌混勻，制成PVP含量為40%的含藥PVP紡絲液。（3）制備P-PVP-PCL：調(diào)節(jié)靜電紡絲參數(shù)，設(shè)置紡絲液出口距接收板的距離為14 cm，紡絲液推注速度為0.9 mL/h，25%PCL紡絲液和40%含藥PVP紡絲液的紡絲電壓分別為9.5 kV和12 kV。在上述條件下，先后對PCL紡絲液和含藥PVP紡絲液進(jìn)行靜電紡絲，得到雙層結(jié)構(gòu)的P-PVP-PCL。

2.1.2 空白納米纖維敷料的制備

按“2.1.1”項(xiàng)下方法操作，但在制備時，PVP紡絲液中不添加頭花蓼提取物，并設(shè)置紡絲工藝參數(shù)中PVP紡絲液的紡絲電壓為11 kV，即得空白納米纖維敷料（以下簡稱“PVP-PCL”）。

2.1.3 P-PVP-PCL的微觀形貌表征

利用掃描電子顯微鏡觀察P-PVP-PCL的微觀形貌；選取100根納米纖維，使用Image J 1.8.0軟件測量納米纖維的平均直徑和孔隙率，并使用OriginPro 2021軟件分析納米纖維直徑。

2.2 P-PVP-PCL的體外藥效研究

2.2.1 抑菌活性評價

采用麥?zhǔn)媳葷岱▽⒓?xì)菌懸液濃度調(diào)整至1×106cfu/mL。分別取100 mg經(jīng)紫外線照射滅菌后的PVPPCL和P-PVP-PCL于無菌試管中，再分別加入5 mL濃度為1×106cfu/mL的金黃色葡萄球菌懸液和大腸埃希菌懸液，于37 ℃、200 r/min恒溫孵育24 h。孵育結(jié)束后，分別取100 μL懸液置于96孔板中，每組設(shè)6個復(fù)孔，用酶標(biāo)儀檢測其在600 nm波長處的光密度（optical density，OD）。另將不含菌懸液的試管作為空白，不含敷料的試管作為對照。根據(jù)下列公式計算敷料的抑菌活性，抑菌活性（%）＝[1-（OD敷料-OD空白）/（OD對照-OD空白）]×100%。為了觀察敷料對細(xì)菌生長的影響，另取上述孵育后的菌懸液稀釋100倍后，各取20 μL涂布于LB固體培養(yǎng)基上，于37 ℃條件下培養(yǎng)16 h，觀察培養(yǎng)基上菌落的生長情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.2.2 抗氧化活性評價

采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法評價抗氧化活性。取PVP-PCL、P-PVP-PCL各10 mg，分別浸入含0.1 mmol/L DPPH的乙醇溶液中，于室溫避光條件下分別培養(yǎng)30 min、24 h；另將含0.1 mmol/L DPPH的乙醇溶液作為對照。培養(yǎng)結(jié)束后，分別于517 nm波長下，采用紫外分光光度計檢測各組吸光度（A）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)下列公式計算抗氧化活性，抗氧化活性（%）＝（A對照-A樣品）/A對照×100%。

2.2.3 細(xì)胞活性檢測

（1）藥液的制備：將PVP-PCL、P-PVP-PCL置于紫外燈下照射，正反面分別照射3 h以上；之后，分別用無血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，過0.22 μm無菌微孔濾膜，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，制成質(zhì)量濃度分別為0.05、0.10、0.25、0.50、1.00 mg/mL的浸提液。

（2）細(xì)胞分組處理及活性檢測：將L929細(xì)胞以1×104個/孔接種于96孔板中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后棄去原培養(yǎng)基，分別加入“2.2.3（1）”項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度的PVP-PCL、P-PVP-PCL浸提液作為PVP-PCL組和P-PVP-PCL組，同時設(shè)置不含藥和細(xì)胞的培養(yǎng)基作為空白組，不含藥只含細(xì)胞的培養(yǎng)基作為對照組，每組設(shè)置6個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入100 μL無血清MEM培養(yǎng)基，然后在避光條件下加入10 μL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT溶液，培養(yǎng)4 h后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入100 μL二甲基亞砜，充分振蕩。之后，使用酶標(biāo)儀于490 nm處檢測各孔的OD值，并根據(jù)下列公式計算各組細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率（%）＝（OD敷料-OD空白）/（OD對照-OD空白）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.2.4 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)

取P-PVP-PCL和醫(yī)用紗布敷料，剪成直徑為1.5 cm的圓形，分別置于24孔板底部的其中一個孔中，以1×105個/mL的密度在敷料上接種L929細(xì)胞，于37 ℃、5% CO2恒溫恒濕培養(yǎng)3 d。孵育結(jié)束后，用磷酸鹽緩沖液洗滌敷料3次，用2.5%戊二醛于4 ℃條件下固定2 h。分別在不同體積分?jǐn)?shù)梯度（30%、50%、70%、90%、100%）的乙醇溶液中進(jìn)行脫水處理，每個乙醇梯度下脫水10 min，冷凍干燥過夜，利用掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞的黏附情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.2.5 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

以1×105個/mL的密度將細(xì)胞接種于6孔板中的3個孔中，待細(xì)胞100%鋪滿孔板底部時，用200 μL無菌槍頭劃3條直線，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液緩慢清洗細(xì)胞2～3次。3個孔分別加入2 mL的無血清MEM培養(yǎng)基（對照組）、0.25 mg/mL PVP-PCL浸提液（PVPPCL組）和0.25 mg/mL P-PVP-PCL浸提液（P-PVP-PCL組），繼續(xù)培養(yǎng)。分別于0、24、48 h時拍照記錄細(xì)胞遷移的情況，并根據(jù)下列公式計算各組細(xì)胞遷移率，細(xì)胞遷移率（%）＝（0 h時劃痕面積-設(shè)定時間點(diǎn)下的劃痕面積）/0 h時劃痕面積×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 P-PVP-PCL的體內(nèi)藥效研究

2.3.1 造模、分組與給藥

取大鼠36只，麻醉后對背部皮膚進(jìn)行脫毛處理，用手術(shù)剪剪一個直徑約1.5 cm的圓形全層皮膚傷口。將大鼠隨機(jī)分為醫(yī)用紗布敷料組、PVP-PCL組和P-PVPPCL組，每組12只。每組大鼠分別用相應(yīng)的敷料覆蓋創(chuàng)面，最外層用繃帶進(jìn)行固定，每2 d更換一次敷料。

2.3.2 創(chuàng)面愈合情況觀察

觀察并拍照記錄傷口愈合情況。根據(jù)公式計算干預(yù)第3、7、14天時的創(chuàng)面愈合率，創(chuàng)面愈合率（%）＝（第0天創(chuàng)面面積-第3/7/14天創(chuàng)面面積）/第0天創(chuàng)面面積×100%。

2.3.3 創(chuàng)面組織染色觀察

各組大鼠干預(yù)第7、14天時，每組分別取6只大鼠，小心切除創(chuàng)面和周圍組織，用生理鹽水將組織上的血液沖洗干凈，用4%多聚甲醛溶液固定，制作石蠟切片，采用HE染色觀察創(chuàng)面組織的病變情況，采用Masson三色染色觀察創(chuàng)面組織中膠原纖維沉積情況，采用免疫組化染色檢測創(chuàng)面組織中CD31陽性血管數(shù)量和TGF-β蛋白表達(dá)情況。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 P-PVP-PCL的微觀形貌

如圖1所示，本研究制成的P-PVP-PCL表面光滑、無串珠現(xiàn)象，斷面處清晰可見雙層結(jié)構(gòu)。P-PVP-PCL的直徑為（476±88）nm，孔隙率為95.77%。

圖1 P-PVP-PCL的掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果

3.2 體外藥效評價結(jié)果

3.2.1 抑菌活性

如圖2所示，PVP-PCL對大腸埃希菌的生長具有促進(jìn)作用，對金黃色葡萄球菌的生長無明顯影響；P-PVPPCL對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的生長具有抑制作用，抑制率分別為（98.88±0.66）%、（94.75±1.41）%（n＝6）。

圖2 不同敷料的抑菌活性結(jié)果

3.2.2 抗氧化活性

如圖3A所示，PVP-PCL組溶液的顏色與對照組比較無明顯變化，均呈紫色，而P-PVP-PCL組溶液顏色變化明顯，從紫色變成淺黃色。如圖3B所示，培養(yǎng)24 h后，P-PVP-PCL組的抗氧化活性為（83.69±1.56）%，而PVP-PCL組的抗氧化活性僅為（11.48±1.67）%（n＝3），表明P-PVP-PCL具有較高的抗氧化能力。

圖3 不同敷料的抗氧化活性結(jié)果（n＝3）

3.2.3 細(xì)胞活性

如圖4所示，在0.05～1.00 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，與對照組比較，PVP-PCL組（0.05 mg/mL除外）和PPVP-PCL組L929細(xì)胞的活性均顯著提高（P＜0.05），且P-PVP-PCL組（1.00 mg/mL除外）的細(xì)胞存活率顯著高于PVP-PCL組（P＜0.05）；P-PVP-PCL組各質(zhì)量濃度下的細(xì)胞存活率均達(dá)130%以上。

3.2.4 細(xì)胞黏附情況

如圖5所示，與醫(yī)用紗布敷料相比，P-PVP-PCL上附著的L929細(xì)胞更多，細(xì)胞形態(tài)良好，說明P-PVP-PCL有利于L929細(xì)胞的黏附和擴(kuò)散。

圖5 L929細(xì)胞對不同敷料的黏附結(jié)果

3.2.5 細(xì)胞遷移情況

與對照組[24 h時（15.33±1.52）%；48 h時（23.36±2.05）%]比較，PVP-PCL組和P-PVP-PCL組的細(xì)胞遷移速度更快[24 h時（21.72±2.19）%和（82.36±2.81）%，P＜0. 01；48 h時（33.08±1.30）%和100%，P＜0.01，n＝3]。可見，48 h時，P-PVP-PCL組的細(xì)胞劃痕已基本愈合，表明P-PVP-PCL具有一定的促進(jìn)傷口愈合的能力。

3.3 體內(nèi)藥效評價結(jié)果

3.3.1 創(chuàng)面愈合情況

與醫(yī)用紗布敷料組比較，PVP-PCL組和P-PVP-PCL組在干預(yù)第3、7、14（PVP-PCL組除外）天時的創(chuàng)面愈合率均顯著升高（P＜0.05）；與PVP-PCL組比較，P-PVPPCL組干預(yù)第7、14天時的創(chuàng)面愈合率均顯著升高（P＜0.05），且第14天時創(chuàng)面已基本愈合，愈合率達(dá)99.50%。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠干預(yù)不同時間的創(chuàng)面愈合率測定結(jié)果（n＝12）

3.3.2 創(chuàng)面組織病變

如圖6所示，與醫(yī)用紗布敷料組或PVP-PCL組比較，干預(yù)第7天時，P-PVP-PCL組可見輕微修復(fù)作用，增生纖維排列相對整齊且出血較少；干預(yù)第14天時，PPVP-PCL組創(chuàng)面組織中可見少量真皮性壞死，增生纖維組織排列相對緊密，修復(fù)效果較好。

圖6 各組大鼠創(chuàng)面組織染色結(jié)果（HE染色，×200）

3.3.3 創(chuàng)面組織膠原纖維沉積

如圖7所示，與醫(yī)用紗布敷料組和PVP-PCL組比較，干預(yù)第14天時，P-PVP-PCL組創(chuàng)面組織中的膠原纖維排列相對整齊、密度相對均勻。

圖7 各組大鼠創(chuàng)面組織染色結(jié)果（Masson三色染色，×400）

3.3.4 創(chuàng)面組織中CD31陽性血管數(shù)量和TGF-β蛋白表達(dá)

如圖8所示，與醫(yī)用紗布敷料組比較，干預(yù)第7天時，P-PVP-PCL組創(chuàng)面組織中CD31陽性血管數(shù)量和TGF-β蛋白表達(dá)均明顯升高（P＜0.05），且TGF-β蛋白表達(dá)顯著高于PVP-PCL組（P＜0.05）；與干預(yù)第7天時比較，干預(yù)第14天時，P-PVP-PCL組創(chuàng)面組織中CD31陽性血管數(shù)量和TGF-β蛋白表達(dá)均有所下降，其中CD31陽性血管數(shù)量顯著低于醫(yī)用紗布敷料組和PVPPCL組（P＜0.05），TGF-β蛋白表達(dá)顯著高于醫(yī)用紗布敷料組和PVP-PCL組（P＜0.05）。

圖8 各組大鼠創(chuàng)面組織中CD31陽性血管數(shù)量和TGF-β蛋白表達(dá)測定結(jié)果（n＝6）

4 討論

4.1 P-PVP-PCL的體外藥效

受損的皮膚創(chuàng)面容易受到細(xì)菌感染，導(dǎo)致傷口愈合時間延長。因此，具有抗菌活性的傷口敷料對傷口愈合至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示，P-PVP-PCL對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌均具有良好的抗菌活性，而PVP-PCL對細(xì)菌的生長顯示出促進(jìn)作用，其原因可能有以下兩點(diǎn)：一是PVP-PCL沒有負(fù)載抗菌活性藥物；二是由于該納米纖維敷料采用靜電紡絲納米技術(shù)制成，其結(jié)構(gòu)與細(xì)胞外基質(zhì)相似，生物學(xué)功能也相似，這可能有利于細(xì)菌的黏附和增殖。

氧化應(yīng)激反應(yīng)是創(chuàng)面修復(fù)過程中重要的環(huán)節(jié)之一，在創(chuàng)傷發(fā)生時即開始，并伴隨創(chuàng)面修復(fù)的整個過程。過度的氧化應(yīng)激可造成脂類、蛋白質(zhì)和DNA的損傷，影響創(chuàng)面愈合過程[5]。本研究結(jié)果顯示，P-PVP-PCL具有較好的抗氧化活性，有利于減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)創(chuàng)面愈合過程。

皮膚真皮部位的成纖維細(xì)胞作為抵御損傷的一道防線，是負(fù)責(zé)合成和沉積新的細(xì)胞外基質(zhì)從而修復(fù)結(jié)構(gòu)框架的主要細(xì)胞類型，在創(chuàng)面愈合過程中扮演關(guān)鍵角色[6]。本研究結(jié)果顯示，PVP-PCL和P-PVP-PCL對L929細(xì)胞的生長均具有促進(jìn)作用，且P-PVP-PCL的促細(xì)胞生長作用更強(qiáng)；L929細(xì)胞對P-PVP-PCL的黏附效果明顯優(yōu)于對醫(yī)用紗布敷料的黏附，這可能與P-PVP-PCL與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)類似、孔隙率較高有關(guān)[7]，且細(xì)胞劃痕在48 h后已基本愈合，這表明，P-PVP-PCL具有良好的生物相容性，有利于促進(jìn)傷口愈合。

4.2 P-PVP-PCL的體內(nèi)藥效

本研究結(jié)果顯示，干預(yù)第14天時，P-PVP-PCL組大鼠創(chuàng)面愈合率高達(dá)99.50%，創(chuàng)面可見較多纖維組織增生，膠原纖維排列相對整齊、密度相對均勻，更接近正常皮膚。

CD31是一種跨膜蛋白，可以特異性地為新生血管著色。新生血管出現(xiàn)得越早、數(shù)量越多，代表傷口愈合的速度越快，傷口愈合情況越好[8]。TGF-β能促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化以及新肉芽組織的形成，同時也可抑制瘢痕形成，在傷口愈合的各個階段中均起到多效性作用[9]。本研究結(jié)果顯示，P-PVP-PCL在創(chuàng)面愈合早期能夠增加大鼠創(chuàng)面組織中CD31陽性血管數(shù)量、促進(jìn)TGF-β蛋白表達(dá)，表明其能在創(chuàng)面愈合早期促進(jìn)新生血管和肉芽組織的形成，加速傷口愈合。

綜上所述，P-PVP-PCL在體外具有良好的抗菌和抗氧化活性，能夠促進(jìn)L929細(xì)胞的增殖、黏附和遷移；在體內(nèi)能夠促進(jìn)大鼠傷口愈合。