劉瀅 ，譚輝 ，夏菁 ，熊偉 ，鄧雪松 #（1.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，重慶 404120；2.重慶市抗腫瘤天然藥物工程研究中心，重慶 404120；3.三峽庫(kù)區(qū)道地藥材開(kāi)發(fā)利用重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 404120）

惡性膠質(zhì)瘤多來(lái)源于低級(jí)別的星形細(xì)胞瘤細(xì)胞或正常的膠質(zhì)細(xì)胞，其早期診斷和治療方法雖不斷發(fā)展，但患者易耐受，且復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差、5年生存率低，現(xiàn)有手段的治療效果仍然有限[1—2]。因此，深入研究惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)病特征并開(kāi)發(fā)新的治療方法，對(duì)改善膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后具有重要意義。

人參為傳統(tǒng)中草藥，是五加科植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根，至今已有兩千多年的應(yīng)用歷史?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，從人參根莖中提取的主要活性成分人參皂苷Rh2（ginsenoside Rh2）具有抗菌、抗腫瘤等藥理作用[3—4]。本課題組前期研究初步證實(shí)，該成分對(duì)腫瘤細(xì)胞具有良好的體內(nèi)外抑制活性[5]。有研究指出，人參皂苷Rh2能有效抑制大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡[6]?？梢?jiàn)，該成分有望成為膠質(zhì)瘤臨床輔助治療的候選藥物。

近年來(lái)的研究表明，組蛋白脫乙酰酶（histone deacetylases，HDACs）的異常表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7]。人類高發(fā)惡性腫瘤的最新相關(guān)研究表明，HDAC1/醇脫氫酶1A（alcohol dehydrogenase 1A，ADH1A）軸在抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移并促進(jìn)其凋亡過(guò)程中具有重要作用[8]，其可通過(guò)干擾小RNA（small interfering RNA，siRNA）來(lái)調(diào)控HDAC1的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)肝癌細(xì)胞標(biāo)志物p21的表達(dá)并抑制細(xì)胞增殖[9]；同時(shí)，有學(xué)者在另一項(xiàng)膠質(zhì)瘤研究中指出，HDAC1活性的增強(qiáng)可能是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及耐藥的基礎(chǔ)[10]。本課題組前期基于中國(guó)腦膠質(zhì)瘤基因組圖譜計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(kù)（Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA），利用在線分析工具（http：//www.cgga.org.cn）對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中膠質(zhì)瘤患者的臨床樣本進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，HDAC1 mRNA在惡性膠質(zhì)瘤（WHO病理分級(jí)為Ⅲ、Ⅳ級(jí)）患者體內(nèi)呈高表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤惡性程度成正比，與患者生存率成反比。可見(jiàn)，HDAC1有望成為惡性膠質(zhì)瘤的潛在治療靶點(diǎn)。本研究以人膠質(zhì)瘤細(xì)胞為對(duì)象，擬分析人參皂苷Rh2對(duì)其增殖、凋亡的影響，并基于HDAC1初步探討上述作用的可能機(jī)制，以期為進(jìn)一步研究該成分的藥理作用和開(kāi)發(fā)惡性膠質(zhì)瘤的治療藥物提供新的思路。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括ChemiDoc Touch型凝膠成像系統(tǒng)、M450型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司），Cyto-FLEX型流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter公司），TGL-185型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（重慶平凡儀器儀表有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

人參皂苷Rh2原料藥（貨號(hào)78214-33-2，純度≥98%）購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司；胎牛血清和DMEM高糖培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；CCK-8試劑盒（批號(hào)K1018）購(gòu)自美國(guó)APExBIO公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒（批號(hào)WLA010a）購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)P0012）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒（批號(hào)P0012A）、細(xì)胞裂解液（批號(hào)P0013K）、青-鏈霉素雙抗（批號(hào)C0222）、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF；批號(hào)ST506）、小鼠抗人β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體（批號(hào)AF0003）、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L）二抗（批號(hào)A0208）、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗（批號(hào)A0216）均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；小鼠抗人HDAC1單克隆抗體（批號(hào)5356T）、兔抗人B細(xì)胞淋巴瘤2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）單克隆抗體（批號(hào)3498T）、兔抗人Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）單克隆抗體（批號(hào)41162S）、兔抗人切割型胱天蛋白酶3（cleaved caspase-3）單克隆抗體（批號(hào)9664T）均購(gòu)自美國(guó)CST公司；ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑（批號(hào)P10100）購(gòu)自蘇州新賽美生物科技有限公司。

1.3 細(xì)胞

人膠質(zhì)瘤U87、U251細(xì)胞由重慶醫(yī)科大學(xué)干細(xì)胞與組織工程研究室提供。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥液配制

U87、U251細(xì)胞用2倍以上體積的培養(yǎng)基混勻，以1 000 r/min離心5 min，棄去上清液；收集細(xì)胞，用含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基（以下簡(jiǎn)稱“完全培養(yǎng)基”）重懸于培養(yǎng)瓶中，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

取人參皂苷Rh2原料藥20 mg，以二甲基亞砜（DMSO）200 μL充分溶解，配制成濃度為160 mmol/L的儲(chǔ)備液，于-20 ℃下保存。臨用前，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)濃度的藥液（DMSO不能超過(guò)總體積的0.1%）。

2.2 細(xì)胞增殖檢測(cè)

采用CCK-8法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87、U251細(xì)胞，按5 000個(gè)/孔接種于96孔板中。將細(xì)胞分為空白組（只加完全培養(yǎng)基）、對(duì)照組（不加藥物）和不同濃度人參皂苷Rh2組（10、20、30、40、50、60、70、80 μmol/L，濃度參考前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置），每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。分別于培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，加入CCK-8試劑10 μL，孵育2 h后，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度（A）值，按下式計(jì)算藥物作用48 h時(shí)的細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率＝（A對(duì)照組-A實(shí)驗(yàn)組）/（A對(duì)照組-A空白組）；同時(shí)擬合人參皂苷Rh2的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87、U251細(xì)胞，按50 000個(gè)/孔接種于6孔板中。將細(xì)胞分為對(duì)照組（不加藥物）和不同濃度人參皂苷Rh2組（30、50 μmol/L，濃度參考“2.2”項(xiàng)下結(jié)果設(shè)置，下同），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，收集各組細(xì)胞，按AnnexinⅤ-FITC/PI試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其總凋亡率。

2.4 HDAC1和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)

采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87、U251細(xì)胞，按50 000個(gè)/孔接種于6孔板中。將細(xì)胞分為對(duì)照組（不加藥物）和不同濃度人參皂苷Rh2組（30、50 μmol/L），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，收集各組細(xì)胞并提取其總蛋白，以BCA法測(cè)定蛋白濃度后作變性處理。取變性蛋白適量，經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用脫脂奶粉于室溫下封閉0.5 h；加入HDAC1、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、β-actin一抗（稀釋比例均為1∶1 000），于4 ℃下孵育過(guò)夜；以TBST緩沖液洗膜3次，加入相應(yīng)二抗（稀釋比例均為1∶1 000），于室溫下孵育1 h；以TBST緩沖液洗膜3次，加入ECL試劑顯色并置于凝膠成像系統(tǒng)下成像，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）的條帶灰度值比值作為目的蛋白的表達(dá)水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 人參皂苷Rh2對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響

經(jīng)不同濃度人參皂苷Rh2作用24、48、72 h后，各藥物組U87、U251細(xì)胞的增殖均受到明顯抑制，其增殖抑制率均較對(duì)照組顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），且有一定的濃度依賴趨勢(shì)。結(jié)果見(jiàn)圖1（對(duì)照組細(xì)胞的增殖抑制率為0，未在圖中展示）。人參皂苷Rh2對(duì)2種細(xì)胞作用48 h時(shí)的IC50分別為51.34、55.84 μmol/L，故后續(xù)將30、50 μmol/L作為該成分的干預(yù)濃度。

圖1 人參皂苷Rh2對(duì)人膠質(zhì)瘤U87、U251細(xì)胞增殖的影響

3.2 人參皂苷Rh2對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響

經(jīng)30、50 μmol/L的人參皂苷Rh2作用48 h后，U87、U251細(xì)胞的總凋亡率均較對(duì)照組顯著升高（P＜0.01），且有隨藥物濃度增加而升高的趨勢(shì)。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 人參皂苷Rh2對(duì)人膠質(zhì)瘤U87、U251細(xì)胞凋亡的影響

3.3 人參皂苷Rh2對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞中HDAC1蛋白表達(dá)的影響

經(jīng)30、50 μmol/L的人參皂苷Rh2作用48 h后，U87、U251細(xì)胞中HDAC1蛋白的表達(dá)水平均較對(duì)照組顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），且表達(dá)水平有隨藥物濃度增加而降低的趨勢(shì)。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 人參皂苷Rh2對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞中HDAC1蛋白表達(dá)的影響

3.4 人參皂苷Rh2對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

經(jīng)30、50 μmol/L的人參皂苷Rh2作用48 h后，U87、U251細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)水平均較對(duì)照組顯著降低，Bax、cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平均較對(duì)照組顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖4。

4 討論

膠質(zhì)瘤是人神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)且難治療的惡性腫瘤，其復(fù)發(fā)率高，現(xiàn)有治療方案效果有限，因此尋找安全、有效的治療藥物非常重要。中醫(yī)藥具有毒副作用小、藥效持久、靶點(diǎn)多及作用較安全等特點(diǎn)，在提高患者生活質(zhì)量、延長(zhǎng)生存期方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，頗受臨床關(guān)注[11]。挖掘具有膠質(zhì)瘤臨床治療和患者預(yù)后改善潛力的中藥及活性成分是目前的研究方向之一?？紤]到人參皂苷Rh2對(duì)腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)外抑制活性以及對(duì)大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響，本研究選擇了2種常用人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系——U87、U251細(xì)胞，初步評(píng)價(jià)了該成分的抗腫瘤活性。

有研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rh2能通過(guò)抑制HDAC1、HDAC2、HDAC6的表達(dá)而發(fā)揮抑制白血病細(xì)胞增殖的作用[12]，因此該成分可能是一種天然的HDAC抑制劑（histone deacetylase inhibitor，HDACi）。已有研究表明，HDAC1在結(jié)腸癌、肝癌等多種腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，可參與組蛋白和非組蛋白的去乙?；⑶遗c患者的不良預(yù)后存在密切關(guān)聯(lián)[13—14]。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rh2可下調(diào)2種人膠質(zhì)瘤細(xì)胞中HDAC1蛋白的表達(dá)，且這種作用有一定的濃度依賴趨勢(shì)?？梢?jiàn)，HDAC1有望成為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。

本研究采用CCK-8實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了人參皂苷Rh2對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響，結(jié)果顯示，人參皂苷Rh2能有效抑制2種人膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。為了進(jìn)一步明確人參皂苷Rh2對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制，本研究針對(duì)經(jīng)典的Bcl-2家族蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑進(jìn)行了探索。在Bcl-2家族蛋白中，Bax是促凋亡關(guān)鍵蛋白，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡；Bcl-2是抑制凋亡的關(guān)鍵蛋白，可抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。現(xiàn)有研究表明，促凋亡蛋白Bax可增加線粒體外膜的通透性，有利于細(xì)胞色素C等介質(zhì)被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而激活下游caspase-3，活化產(chǎn)物cleaved caspase-3可通過(guò)破壞細(xì)胞來(lái)促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]；抑凋亡蛋白Bcl-2則可通過(guò)與Bax蛋白形成異二聚體而發(fā)揮凋亡抑制作用[16]。可見(jiàn)，細(xì)胞凋亡受Bax、Bcl-2蛋白的共同調(diào)控。Wang等[17]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，下調(diào)HDAC1可影響B(tài)cl-2/caspase信號(hào)通路的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。本研究Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，人參皂苷Rh2能顯著促進(jìn)2種人膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Bax、cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)，抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)。

綜上所述，人參皂苷Rh2能抑制人膠質(zhì)瘤U87、U251細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，其作用可能與下調(diào)HDAC1蛋白的表達(dá)和激活Bcl-2家族蛋白介導(dǎo)的凋亡途徑有關(guān)。在后續(xù)研究中，本課題組擬構(gòu)建HDAC1轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，進(jìn)一步對(duì)人參皂苷Rh2的上述作用進(jìn)行驗(yàn)證，以期為其分子機(jī)制的闡釋提供參考。