董曉蕊 張 亮

青海省中醫(yī)院，青海 西寧 810000

膏滋系指飲片用水煎煮，取煎煮液濃縮，加煉蜜或糖(或轉(zhuǎn)化糖)制成的半流體制劑[1]。膏滋藥有滋補(bǔ)、保健、強(qiáng)身、延年之功效，因膏劑黏稠，在體內(nèi)吸收慢，停留時(shí)間長(zhǎng)，比其他劑型更能發(fā)揮滋養(yǎng)作用[2]，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，有助于預(yù)防和治療相關(guān)疾病，實(shí)乃滋補(bǔ)上品，在中醫(yī)藥寶庫中占據(jù)很重要的地位[3]。

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種特殊的慢性消耗性疾病，容易復(fù)發(fā)，即使經(jīng)過常規(guī)治療后也需要長(zhǎng)期的調(diào)理，中醫(yī)膏方作為祖國醫(yī)學(xué)歷史悠久的八大劑型之一，其藥力緩和，方便攜帶，口感佳，易保存，因而用藥的依從性高，可起到防治結(jié)合的作用[4]。補(bǔ)腎活血膏是我院肺病科?？朴盟帲?lián)合多索茶堿片治療COPD穩(wěn)定期，能改善患者癥狀，提高肺功能及生活質(zhì)量，其原因可能與降低IL-18、α-AT1、TGF-β1水平，使氣道炎癥減輕、氣道重塑改善有關(guān)，臨床療效優(yōu)于單純應(yīng)用多索茶堿片治療，值得臨床推廣應(yīng)用[5]。

補(bǔ)腎活血膏組方中包含炙補(bǔ)骨脂、黨參、黃芪、紅景天等27味中藥，具有扶正固本，祛痰逐瘀，活血通脈的作用。補(bǔ)骨脂溫腎助陽、納氣平喘、溫脾止瀉，主要活性成分為黃酮類、香豆素類及單萜酚類化合物[6]，其中總香豆素是補(bǔ)骨脂止喘的主要成分[7]，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素及其糖苷補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷是香豆素的主要活性成分[8]。紅景天益氣活血、通脈平喘[9]，主要含有黃酮類、苯烷基苷類、有機(jī)酸類、多糖類等化合物[10]。本研究擬通過多指標(biāo)權(quán)重分析結(jié)合正交試驗(yàn)對(duì)補(bǔ)腎活血膏提取過程進(jìn)行分析，篩選補(bǔ)腎活血膏提取工藝，為后期補(bǔ)腎活血膏生產(chǎn)工藝的確定及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 D3(H)021403電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)；QUINTIX35-1CN電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；Agilent 1120 高效液相色譜儀；Direct-Q5UV超純水儀(默克密理博)。

1.2 試藥 補(bǔ)骨脂素(批號(hào)21010802，含量以99.99%計(jì))、異補(bǔ)骨脂素(批號(hào)19101704，含量以99.31%計(jì))對(duì)照品均購自成都格利普生物科技有限公司；紅景天苷(批號(hào)10338-51-9，含量以99.2%計(jì))購自中國食品藥品檢定研究院。試劑均為色譜純，水為超純水。試驗(yàn)用中藥飲片均符合《中國藥典》2020版各藥材相關(guān)項(xiàng)下之規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 單因素考察 通過直觀考察不同浸泡時(shí)間下飲片浸潤及溶劑透心程度，確定制備補(bǔ)腎活血膏樣品的飲片浸泡時(shí)間。由于補(bǔ)腎活血膏方中阿膠、鹿角膠、龜板膠、紫河車粉均在收膏時(shí)加入，黃酒用于膠類的烊化，均不在本次試驗(yàn)的考察范圍內(nèi)，因此在后續(xù)試驗(yàn)中制備樣品時(shí)均將上述細(xì)料藥剔除。取除阿膠、鹿角膠、龜板膠、紫河車粉外其它處方中藥飲片3份，加入2倍量水，分別浸泡5 h、12 h、15 h，觀察飲片浸潤程度及溶劑透心程度。結(jié)果顯示，浸泡12 h后，處方中所有飲片完全浸透，故在后續(xù)提取工藝研究試驗(yàn)中，固定飲片浸泡12 h。見表1。

表1 浸泡時(shí)間考察結(jié)果表

2.2 補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、紅景天苷含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)PN 959990-902；補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素以甲醇-水(55∶45)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為246 nm[11]195；紅景天苷以甲醇-水(15∶85)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm[11]162；流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

2.2.2 補(bǔ)腎活血膏濃縮液制備 精密稱取除阿膠、鹿角膠、龜板膠、紫河粉外車其它處方中藥飲片9份，按照表2因素水平進(jìn)行提取，提取液趁熱濾過，濾液濃縮至300 mL。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取各正交試驗(yàn)所得的補(bǔ)腎活血膏濃縮液20 mL，精密加入甲醇20 mL，加熱回流2 h，放冷，濾過，精密量取續(xù)濾液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 對(duì)照品溶液的制備 補(bǔ)骨脂素對(duì)照品20.04 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得；異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品20.44 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得。紅景天苷對(duì)照品20.20 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.5 炙補(bǔ)骨脂、紅景天陰性對(duì)照品溶液的制備 精密稱取除炙補(bǔ)骨脂、紅景天、阿膠、鹿角膠、龜板膠、紫河車粉外其它處方中藥飲片1份，加水浸泡12 h，加8倍量水，提取2次，每次2 h，提取液趁熱濾過，濾液濃縮至300 mL。按照2.2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.2.6 專屬性試驗(yàn) 精密吸取各對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀。結(jié)果如圖1所示。

a.補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品圖譜 b.紅景天苷對(duì)照品圖譜 c.補(bǔ)腎活血膏陰性對(duì)照?qǐng)D譜

2.2.7 線性關(guān)系考察 按照2.2.4項(xiàng)下方法，分別配制濃度為0.0626 mg/mL、0.1253 mg/mL、0.2505 mg/mL、0.5010 mg/mL、1.0020 mg/mL、2.0040 mg/mL的補(bǔ)骨脂素對(duì)照品溶液，濃度為0.0634 mg/mL、0.1269 mg/mL、0.2538 mg/mL、0.5075 mg/mL、1.0150 mg/mL、2.0300 mg/mL的異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品溶液，濃度為0.1376 mg/mL、0.2753 mg/mL、0.5506 mg/mL、1.1011 mg/mL、2.2023 mg/mL的紅景天苷對(duì)照品溶液，按2.2.1項(xiàng)下條件進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：補(bǔ)骨脂素：Y=3955.9374X+2.0239，相關(guān)系數(shù)r2=1.0000；異補(bǔ)骨脂素：Y=3709.0685X-1.5040，相關(guān)系數(shù)r2=1.0000；紅景天苷：Y=283.9616X-3.4279，相關(guān)系數(shù)r2=0.9999。表明補(bǔ)骨脂素含量在0.0626～ 2.0040 mg/mL之間范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；異補(bǔ)骨脂素含量在0.0634～2.0300 mg/mL之間范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；紅景天苷含量在0.1376～2.2023 mg/mL之間范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采取正交試驗(yàn)，以補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素及紅景天苷含量為指標(biāo)，研究補(bǔ)腎活血膏最佳提取工藝。因素水平及結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)因素水平及結(jié)果表

2.4 正交試驗(yàn)權(quán)重分析

2.4.1 基于層次分析法(AHP)的正交試驗(yàn)結(jié)果分析 AHP是美國著名運(yùn)籌學(xué)家Saaty教授于20世紀(jì) 70 年代初提出的一種權(quán)重決策分析方法。首先，采用1～9標(biāo)度法對(duì)三項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行兩兩比較評(píng)判重要性[12]，判斷并建立各指標(biāo)的優(yōu)先矩陣，確定優(yōu)先順序?yàn)榧t景天苷>補(bǔ)骨脂素=異補(bǔ)骨脂素，見表3。利用SPSSAU軟件計(jì)算紅景天苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素3個(gè)指標(biāo)權(quán)重系數(shù)。見表4。

表3 各指標(biāo)優(yōu)先矩陣表

表4 AHP層次分析結(jié)果表

由表4可知，三項(xiàng)指標(biāo)的權(quán)重值分別是：26.111%、32.778%、41.111%；同時(shí)，評(píng)價(jià)本次權(quán)重結(jié)果的一致性，計(jì)算一致性指標(biāo)CR值(CR=CI/RI)，CR=0.052<0.1，矩陣滿足一致性檢驗(yàn)，計(jì)算所得權(quán)重具有一致性。

2.4.2 基于CRITIC法的正交試驗(yàn)結(jié)果分析 中藥膏方成分復(fù)雜，在提取過程中各有效成分間的相互作用對(duì)最終提取效果的影響不明確，因此單憑主觀確定權(quán)重系數(shù)有失偏頗，可采用CRITIC客觀賦權(quán)法對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行權(quán)重分析。結(jié)果見表5。

表5 CRITIC權(quán)重分析結(jié)果表

2.4.3 AHP-CRITIC混合加權(quán)法計(jì)算權(quán)重 本試驗(yàn)共采用AHP法和CRITIC法兩種方法分別計(jì)算權(quán)重，AHP法是主觀賦值權(quán)重，量化了評(píng)價(jià)指標(biāo)兩兩間比較判斷的優(yōu)先信息，CRITIC法是客觀賦值權(quán)重，AHP-CRITIC 混合加權(quán)法融合了不同類型賦權(quán)方法的優(yōu)點(diǎn)，在保持權(quán)重穩(wěn)定性的同時(shí)，更能區(qū)分樣本數(shù)據(jù)，保證數(shù)據(jù)點(diǎn)均勻分散，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠[13]，將兩種方法結(jié)合使得到的權(quán)重系數(shù)更加合理。按如下公式：

ωi表示綜合權(quán)重，α1為AHP法所得權(quán)重值，β1為CRITIC法所得權(quán)重值。

計(jì)算得補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、紅景天苷權(quán)重系數(shù)分別為12.14%、15.84%、21.85%。

2.4.4 結(jié)果 采用 AHP-CRITIC 混合加權(quán)法得到的權(quán)重系數(shù)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)分，綜合評(píng)分=[(補(bǔ)骨脂素含量/ 補(bǔ)骨脂素最大含量)× 0.1341+(異補(bǔ)骨脂素含量/異補(bǔ)骨脂素最大含量)×0.1410+(紅景天苷含量/紅景天苷最大含量)×0.2185]×100%[14](表2)；利用SPSSAU對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，直觀分析結(jié)果見表6。

由表6結(jié)果直觀分析可知，試驗(yàn)各因素對(duì)于補(bǔ)腎活血膏提取工藝的影響主次順序?yàn)锽>C>A，最優(yōu)工藝為A2B2C3。因此，補(bǔ)腎活血膏提取工藝確定為：按處方比例，取炙補(bǔ)骨脂、黨參、黃芪、紅景天等27味藥材，加水浸泡12 h，加10倍量水，提取2次，每次2 h。

表6 正交試驗(yàn)直觀分析結(jié)果表

3 討論

近些年來，隨著中醫(yī)治未病理念的不斷推廣，膏方的臨床應(yīng)用日益受到青睞，已逐步成為群眾廣為接受的慢病調(diào)理、改善體質(zhì)、養(yǎng)生保健的有效手段[15]。膏方制劑的質(zhì)量控制，是目前亟待解決的一個(gè)問題，除了在制備過程中(諸如浸泡、煎煮、濃縮、收膏和儲(chǔ)存等環(huán)節(jié))要把好質(zhì)量關(guān)外，尚如浸泡飲片的加水量及浸泡時(shí)間、藥物的煎煮時(shí)間及煎液的濃縮溫度控制，收膏中糖和蜂蜜的用量以及成膏后包裝材料的選擇等環(huán)節(jié)，均有待于進(jìn)一步深入探討[16]。

補(bǔ)腎活血膏為中藥配伍組方，成分眾多，其療效的發(fā)揮是方中多種有效成分綜合作用的結(jié)果。方中補(bǔ)骨脂對(duì)腎陽虛衰，腎不納氣之虛喘，可奏標(biāo)本兼顧之效[9]。補(bǔ)骨脂總香豆素對(duì)豚鼠過敏性哮喘及組胺性哮喘潛伏期有顯著的延長(zhǎng)作用，作用機(jī)制可能與補(bǔ)骨脂總香豆素調(diào)節(jié)體內(nèi)環(huán)磷酸腺苷、環(huán)鳥苷酸的量及比值變化有關(guān)[17]。紅景天及其有效成分紅景天苷具有抗疲勞、抗抑郁、增強(qiáng)免疫力、清除活性氧自由基(ROS)、抗腫瘤等藥理活性，常用于治療高原反應(yīng)，對(duì)心腦血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等的疾病均有一定療效[18]。同時(shí)，研究[18]表明紅景天及紅景天苷對(duì)多種肺部疾病(如肺動(dòng)脈高壓、肺組織纖維化、COPD)均具有一定的療效，其機(jī)制主要與抗氧化、抗炎、抗凋亡有關(guān)。故本試驗(yàn)選擇了組方中療效確切，含量較高的補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素及紅景天苷作為檢測(cè)指標(biāo)。

多個(gè)指標(biāo)共同指導(dǎo)工藝往往難以獲得一致的評(píng)價(jià)結(jié)果，所以對(duì)于多指標(biāo)成分來說，如何進(jìn)行合適的權(quán)重劃分是最終確定最佳提取工藝的關(guān)鍵[19]。針對(duì)權(quán)重系數(shù)分配，目前常用方法有 AHP 法、CRITIC法。其中，AHP法雖體現(xiàn)了中藥復(fù)方君臣佐使配伍的規(guī)律特點(diǎn)，但受研究者主觀判斷影響；CRITIC法權(quán)重結(jié)果受客觀試驗(yàn)數(shù)據(jù)影響，忽略了中藥復(fù)方各藥材的配伍特點(diǎn)[20]。本試驗(yàn)以AHP-CRITIC混合加權(quán)法分配權(quán)重系數(shù)，主觀與客觀結(jié)合，使總體評(píng)價(jià)的結(jié)果更具科學(xué)性和合理性。

綜上所述，本研究通過正交試驗(yàn)前單因素試驗(yàn)，考察確定了組方飲片的浸泡時(shí)間，采用AHP-CRITIC 混合加權(quán)法得到權(quán)重系數(shù)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)分，利用SPSSAU軟件對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，確定了補(bǔ)腎活血膏的提取工藝為組方藥材加水浸泡12 h，加10倍量水，提取2次，每次2 h。研究所得結(jié)果科學(xué)合理，為日后補(bǔ)腎活血膏工業(yè)化生產(chǎn)提供了支持，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。