李正剛 邵大志 張亦萌 馬 彧 馬金剛

1.吉林省四平市食品藥品檢驗(yàn)所，吉林 四平 136000；2.四平市中心人民醫(yī)院，吉林 四平 136000

現(xiàn)階段，大量使用農(nóng)藥導(dǎo)致農(nóng)藥殘留超標(biāo)問題頻頻發(fā)生[1-2]，且大多數(shù)的農(nóng)藥都有難降解、易蓄積、毒性高、易污染等特點(diǎn)[3-4]。農(nóng)藥使用后，很大一部分農(nóng)藥會進(jìn)入環(huán)境中，進(jìn)而在土壤、水等環(huán)境介質(zhì)中傳播，并隨著食物鏈的傳遞在生物體內(nèi)累積，從而使整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞。農(nóng)藥殘留對食品安全性及人類健康產(chǎn)生的負(fù)面作用日益凸顯出來。因此，為保證中藥材用藥的安全性。必須加強(qiáng)對農(nóng)藥殘留量檢測的力度。建立合適的分析方法來檢測和量化中藥材中的農(nóng)藥。并且制定合理的限值范圍，提高中藥材在實(shí)際應(yīng)用過程中的安全性[5-7]。農(nóng)藥殘留的檢測方法有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)、液相色譜-紫外檢測(LC-UV)、氣相色譜-電子捕獲檢測(GC-ECD)等[8-11]。GC-ECD法為實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)用最多的測定方法。

地龍為常用動物類藥材，最早在《神農(nóng)本草經(jīng)》就有記載[12]。地龍性味寒、咸，歸肺、腎、肝經(jīng)，具有清熱定驚、通絡(luò)、平喘、利尿的功效，常用于治療高熱、神昏、驚癇抽搐、肺熱喘咳等癥狀?，F(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)收載在2020版《中國藥典》一部，標(biāo)準(zhǔn)中安全性質(zhì)量控制項(xiàng)目進(jìn)行了重金屬和黃曲霉毒素的限量控制檢驗(yàn)[13]。經(jīng)過文獻(xiàn)調(diào)研，也未有關(guān)于農(nóng)藥殘留的研究檢測報(bào)道。市場上野外捕獲地龍和人工養(yǎng)殖均有，環(huán)境中農(nóng)藥的使用可能造成地龍藥材中農(nóng)藥含量超標(biāo)。有害元素含量的多少，直接反映中藥材的質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)以不同產(chǎn)地及不同批次地龍為研究對象，采用GC-ECD法，測定了17種有機(jī)氯類農(nóng)藥的殘留含量，為進(jìn)一步提高動物藥的質(zhì)量，保證其用藥安全提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 7890B型氣相色譜儀(配備Ni-ECD電子捕獲檢測器，安捷倫科技有限公司)；BP211D型電子天平(北京賽多利斯儀器天平有限公司)；RE 52-99 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；TDL-5-A臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 試驗(yàn)材料 有機(jī)氯農(nóng)藥混合對照品溶液(批號：610005-202003；特性量值：約10μg/mL，中國食品藥品檢定研究院)。丙酮、二氯甲烷、正己烷、硫酸(均為色譜純)；氯化鈉、無水硫酸鈉(均為分析純)；純化水為自制。

本次收集到不同產(chǎn)地和批次的地龍藥材共10 批，基本信息見表1。

表1 地龍藥材樣品基本信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 儀器參數(shù) OV-1701(30 m×0.32 mm×0.25 μm)毛細(xì)管色譜柱；載氣：N2，檢測器為Ni-ECD電子捕獲檢測器；進(jìn)樣口溫度：230℃；檢測器溫度：300 ℃；流速：1.5 mL/min；進(jìn)樣模式：不分流進(jìn)樣；程序升溫：60 ℃，保持 0.3 min，以 60 ℃/min 升至170 ℃，再以10 ℃/min升至220 ℃，保持10 min，再以1 ℃/min升至240 ℃，15 ℃/min升至280 ℃，保持5 min，進(jìn)樣量為1 μL。

2.2 混合對照品溶液的制備 精密量取17種有機(jī)氯農(nóng)藥混合對照品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用正已烷逐級稀釋制成每1 mL分別約含2 ng、5 ng、10 ng、20 ng、50 ng、100 ng的溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品，粉碎成細(xì)粉(過二號篩)，取約5 g，置具塞錐形瓶中，加水30 mL，振搖10 min，使分散，精密加入丙酮50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再用丙酮進(jìn)行補(bǔ)重，再加氯化鈉約5 g，精密加二氯甲烷25 mL，稱定重量，超聲處理15 min，放冷，再用二氯甲烷進(jìn)行補(bǔ)重，振搖使氯化鈉充分溶解，靜置，轉(zhuǎn)移至具塞離心管中，離心5 min，使完全分層，將有機(jī)相轉(zhuǎn)移至裝有適量無水硫酸鈉的具塞錐形瓶中，放置30 min。精密量取15 mL。置于40 ℃水浴中減壓濃縮至約 1 mL，再加正己烷約5 mL，減壓濃縮至近干，用正己烷溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，轉(zhuǎn)移至離心管中，再加入硫酸溶液(9→10)1 mL，振搖1 min，離心 10 min，分取上清液，加水1 mL，振搖，取上清液，即得。

2.4 空白溶液 除不添加樣品外，其余按“2.3”項(xiàng)下操作，制得空白溶劑溶液。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 系統(tǒng)適用性考察 分別精密量取混合對照品溶液、樣品溶液和空白溶液各1 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果，17種有機(jī)氯農(nóng)藥色譜峰分離度均大于1.5，空白溶液無干擾。具體如圖1所示。

A.對照品溶液(1.六氯苯；2.α-六六六；3.五氯硝基苯；4.γ-六六六；5.七氯；6.艾氏劑；7.β-六六六；8.氧化氯丹；9.δ-六六六；10.順式環(huán)氧七氯；11.反式環(huán)氧七氯；12.反式氯丹；13.順式氯丹；14.p，p’-滴滴伊；15.o，p’-滴滴涕；16.p，p’-滴滴滴；17.p，p’-滴滴涕)；B.樣品溶液；C.空白試劑溶液

2.5.2 線性范圍和檢出限 精密量取“2.2”項(xiàng)下系列不同濃度的17種有機(jī)氯農(nóng)藥混合對照品溶液各1 μL，注入氣相色譜儀。以進(jìn)樣濃度X(ng/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計(jì)算17 種農(nóng)藥的線性回歸方程。結(jié)果，各組分線性關(guān)系良好。將17 種有機(jī)氯農(nóng)藥對照品溶液逐步稀釋后進(jìn)樣測定，進(jìn)樣1 μL，以3倍基線噪聲(S/N=3)確定方法的檢出限(LOD)。結(jié)果見表2。

表2 回歸方程、線性范圍、檢出限歸納表

2.5.3 精密度試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下17種有機(jī)氯農(nóng)藥混合對照品溶液(濃度約為20 ng/mL)，重復(fù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算峰面積的RSD 值均小于2.3%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下17種有機(jī)氯農(nóng)藥混合對照品溶液(濃度約為20 ng/mL)，分別于0 h、4 h、8 h、16 h、18 h、24 h，進(jìn)樣1 μL，記錄所測各組分峰面積。結(jié)果17種有機(jī)氯農(nóng)藥組分峰面積的RSD均小于3.3% (n=6)，表明17種有機(jī)氯農(nóng)藥在24 h內(nèi)均穩(wěn)定。

2.5.5 重復(fù)性試驗(yàn)及回收率試驗(yàn) 經(jīng)考察10批地龍藥材樣品中均未檢出17種農(nóng)藥殘留，故本次實(shí)驗(yàn)重復(fù)性采用加樣回收試驗(yàn)進(jìn)行考察。取供試品粉末約5 g，各6份，精密稱定，再精密加入17種有機(jī)氯農(nóng)藥混合對照品溶液0.25 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件測定。計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率在81.2%～93.1%之間，RSD均小于4.0%(n=6)，符合規(guī)定。測定結(jié)果見表3。表明方法的重復(fù)性和回收率滿足實(shí)驗(yàn)要求。

表3 重復(fù)性和回收率試驗(yàn)結(jié)果表

表3(續(xù))

2.5.6 樣品測定 應(yīng)用本方法對海南、廣東、廣西、河南、湖北、浙江采集的10批次樣品進(jìn)行檢測，均未檢出17 種有機(jī)氯農(nóng)藥，其原因可能為現(xiàn)階段國家對農(nóng)藥的使用管理日趨規(guī)范嚴(yán)格，環(huán)境中的農(nóng)藥殘留顯著減少，中藥材種養(yǎng)植基地也更加注重生態(tài)化管理。同時(shí)本次收集的樣品批次局限，更多樣品量仍待研究考察。

3 結(jié)論

3.1 基線偏移 本次試驗(yàn)為達(dá)到17中測定成分均達(dá)到較好的分離效果，故采用程序梯度升溫?；€因測試的溫度的不斷提高而緩慢向上偏移，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，不影響最終結(jié)果的準(zhǔn)確性，可以接受。

3.2 樣品提取方法及檢測方式 本次樣品前處理方式考察了丙酮和二氯甲烷有機(jī)溶劑直接超聲提取、固相萃取和快速樣品前處理(QuEChERS)3種方法，3種提取法的平均回收率分別為≥81.2%、75.4%、78.7%。最終采用了方便、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的直接超聲提取法，能較好地去除雜質(zhì)，降低樣品對于儀器的污染。

有機(jī)氯類農(nóng)藥的殘留檢測方法主要有氣相色譜法-電子捕獲檢測法、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，相比與后兩種檢測方法，氣相色譜在使用的普遍性和經(jīng)濟(jì)性上都有很大的優(yōu)勢，也是目前大部分生產(chǎn)企業(yè)配備的檢測儀器。

綜上所述，研究為地龍藥材中多種有機(jī)氯農(nóng)藥殘留的檢測、風(fēng)險(xiǎn)評估等研究提供了經(jīng)濟(jì)、實(shí)用、可靠的檢測方法，同時(shí)為監(jiān)管部門監(jiān)控當(dāng)前地龍藥材中的農(nóng)藥殘留情況提供了一定參考數(shù)據(jù)[14-20]。