王 劍 劉書斌 沈 萍 楊江媛 陳金素

1.云南省中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650021；2.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；3.重慶市中醫(yī)院，重慶 400020

大黃，別稱為將軍、錦紋等，主要來源為蓼科植物掌葉大黃、藥用大黃或唐古特大黃的干燥根和根莖，味苦性寒，具有瀉下攻積、逐瘀通經(jīng)、清熱瀉火、涼血解毒、利濕退黃的功效[1]。據(jù)調(diào)查，大黃的人工種植分布區(qū)主要在我國西北甘肅、青海和西南地區(qū)四川、云南等地，尤其是甘肅銓水、西禮等地的“銓水大黃”塊形大，占全國大黃商品流通量75%以上，質(zhì)地堅而享譽天下[2]。目前大黃藥材多采用商品等級劃分進行市場流通[3]，一般為一等品、二等品、三等品和水根?，F(xiàn)代研究[4]表明，蘆薈大黃素作為大黃的抗菌有效成分，對葡萄球菌和鏈球菌的抑菌效果最為顯著，還具有抑制癌細胞的作用，這與大黃清熱瀉火、涼血解毒的功效相對應(yīng)；兒茶素具有抗腫瘤、抗氧化、抗病菌以及保護心腦器官等多種藥理作用[5]，與大黃逐瘀通經(jīng)、利濕退黃的功效相一致；大黃素可抑制Na+和K+從腸腔轉(zhuǎn)運至細胞，使水分大量的滯留在人體的腸腔內(nèi)，促進大腸蠕動和排便，具有瀉下攻積作用[6]，故本研究認為通過測定大黃這3種有效成分可以綜合地、全面地對大黃不同商品等級的質(zhì)量進行評價。

目前國內(nèi)外對大黃的質(zhì)量評價，基本以藥典規(guī)定檢查項進行評價，多體現(xiàn)在大黃的顯微理化、薄層鑒別和單一化學(xué)成分的含量測定[7]，或基于藥材化學(xué)指紋圖譜或活血生物效價的單一指標評價模式[8]，或采用多種化學(xué)成分的高低，難以采用科學(xué)、高效和合理的統(tǒng)計學(xué)模型對藥材質(zhì)量進行綜合評價?；疑P(guān)聯(lián)與中醫(yī)藥理論特點相契合，采用“灰色思維”對系統(tǒng)模型內(nèi)的各種作用指標起的作用機制不明確、對中藥材的質(zhì)量評價指標信息等模糊不焦距問題可全面解決。本實驗通過測定11個不同產(chǎn)地共44批大黃不同商品等級樣品中浸出物、總灰分、兒茶素、蘆薈大黃素和大黃素的含量，構(gòu)建大黃不同商品等級質(zhì)量評價的灰色關(guān)聯(lián)度模型，為該藥材不同商品等級的質(zhì)量評價提供新的參考方法。

1 材料

1.1 實驗儀器 1100系列高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)、UPH-I-5T型優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)(上海優(yōu)普超片設(shè)備公司)、DV 215CD型電子天平(奧豪斯儀器有限責(zé)任公司)、GB208型電子分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。對照品為大黃素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號111795-201408，純度>98%)，兒茶素對照品(批號：122811，純度>98%)，蘆薈大黃素對照品(批號：03071201，純度>98%)均購自天津士蘭科技有限公司；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.2 樣品來源 44批樣品于2020年3月至5月分別購于青海、甘肅、四川和云南等省份，經(jīng)云南省中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部陳金素副主任中藥師鑒定為藥典規(guī)定的蓼科植物3種來源大黃的干燥根和根莖。以上樣品均為栽培2年生藥材，依據(jù)《新編中國藥材學(xué)》[9]中對3個不同基原大黃藥材的表面、質(zhì)地、大小、氣味等外觀性狀和有無糠心、雜質(zhì)、蟲蛀、霉變對大黃樣品進行商品等級劃分，具體方法為：一等品以每公斤8個以內(nèi)(或每只150～250 g)，糠心不超過15%；二等品以每公斤12個以內(nèi)(或每只100～200 g)，糠心不超過15%；三等品以每公斤18個以內(nèi)(或中部直徑在3.5 cm以上)，糠心不超過15%；水根以中部直徑在2 cm以上，糠心不超過15%進行商品等級劃分。干燥后粉碎過4號篩，保存后留存，不同商品等級大黃樣品的信息見表1。

表1 不同商品等級大黃藥材的編號及來源表

表1(續(xù))

2 方法與結(jié)果

2.1 浸出物和總灰分的測定 參照《中華人民共和國藥典》[10]2020年版水溶性浸出物測定法(通則2201)項下的熱浸法測定浸出物和通則2302測定總灰分。結(jié)果見表2。

表2 44批大黃中浸出物和總灰分的測定表

2.2 含量測定 參照顏永剛等[11]的HPLC色譜條件為：ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相：甲醇(A)-0.2%乙酸(B)，梯度洗脫程序見表3，流速1.0 mL·min-1，進樣量10 μL，柱溫25 ℃，檢測波長260 nm；在上述色譜條件下，理論板數(shù)以各待測成分峰計均≥5000，各成分基線分離良好，分離度>1.5，色譜峰對稱因子均在0.95～1.05。結(jié)果見表4。

表3 梯度洗脫程序表

表4 44批大黃中3種化學(xué)成分的含量測定表

2.3 大黃不同商品等級質(zhì)量評價及灰色關(guān)聯(lián)度模型的建立

2.3.1 灰色關(guān)聯(lián)度方法的建立

2.3.1.1 參考序列的選擇 參照文獻[12]的方法，本研究共有44個樣品，每個樣品有5個評價指標，分別是總灰分、浸出物、兒茶素、蘆薈大黃素和大黃素。組成一個灰色關(guān)聯(lián)度評價單元序列，記為：{Xik}(i=1，2，……44；k=1，2，3，4，5)；本研究中m=44，n=5。其次選擇參考序列，確定大黃質(zhì)量評價的最優(yōu)和最差參考序列。設(shè){Xsk}=max{1≤s≤m}{Xik}是大黃質(zhì)量評價最優(yōu)參考序列，表明該序列是各項指標是n個樣品對應(yīng)指標的最大值，反之，則{Xtk}=min{l≤t≤m}{Xik}是最差參考序列。

2.3.1.2 5個評價指標的規(guī)格化處理 因為大黃藥材的5個指標的計量單位不統(tǒng)一，需要對所有數(shù)據(jù)進行規(guī)格化處理才能最大限度的減少數(shù)據(jù)差異帶來的分析誤差，一般采用以該數(shù)值的均值化作為參照，進行歸一化變換，其公式為Yik=Xik/Yk，其中Yik代表評價指標規(guī)格化處理后的數(shù)據(jù)，Xik為5個指標，Yk為第m個大黃樣品的第k個指標的平均值。本研究采用均值法對5個指標的質(zhì)量分數(shù)數(shù)據(jù)進行歸一化數(shù)據(jù)5個指標處理，結(jié)果見表5。

表5 44批大黃的原始數(shù)據(jù)規(guī)格化表

2.3.1.3 關(guān)聯(lián)系數(shù)與關(guān)聯(lián)度的計算 按公式①和②計算，分別計算出評價單元相對最優(yōu)參考序列和最差參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)。按公式③和公式④計算出評價單元相對于最優(yōu)參考序列和最差參考序列的關(guān)聯(lián)度，結(jié)果見表6、表7。

表6 44批大黃藥材最優(yōu)參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)與關(guān)聯(lián)度表

表7 44批大黃藥材最差參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)與關(guān)聯(lián)度表

①

式中Δmin=min|Yik-Ysk|，Δmax=max|Yik-Ysk|(i=1，2，……m；k=1，2，……n)。

②

③

④

2.3.1.4 相對關(guān)聯(lián)度的計算 若該評價單元與ri(s)關(guān)聯(lián)程度距離越接近而同時與ri(t)的關(guān)聯(lián)程度最遠，說明這一批的大黃藥材是本研究系統(tǒng)中最佳評價單元。本研究將相對關(guān)聯(lián)度定義為ri=ri(s)/(ri(s)+ri(t))，(i=1，2，……n)，認為相對關(guān)聯(lián)度r能夠綜合、全面的代表大黃的實際質(zhì)量，以相對關(guān)聯(lián)度進行排序，得出大黃不同商品等級的質(zhì)量名次，見表8。

表8 大黃樣品相對關(guān)聯(lián)度質(zhì)量排序名次表

2.3.2 質(zhì)量評價 由表8可知，相對關(guān)聯(lián)度越大，則不同商品等級的大黃質(zhì)量評價越高。44批樣品中各評價單元序列的相對關(guān)聯(lián)度>0.400的樣本有33批，這些樣本的質(zhì)量評價較高，主要來源于大黃主產(chǎn)區(qū)甘肅省禮縣、青海省化隆縣、四川省阿壩州九寨溝縣的樣本。相對關(guān)聯(lián)度排名在前25名的樣本中，甘肅產(chǎn)有10批，青海產(chǎn)有6批，云南產(chǎn)有5批，四川產(chǎn)有4批，分別占各樣本總數(shù)的40.0%、24.0%、20.0%和16.0%，說明采購于甘肅、青海的大黃質(zhì)量較優(yōu)，這與當?shù)厮庌r(nóng)認為“甘肅、青海的的大黃評價度較高”一致。另外，前25名排序中，一等品(n=11)>二等品(n=8)>三等品(n=4)>水根(n=2)，觀察數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，同一產(chǎn)地的不同大黃商品等級排名一般為：一等品>二等品>三等品>水根，這與《七十六種藥材商品規(guī)格標準》中商品等級劃分結(jié)果相吻合，說明依據(jù)大黃藥材的質(zhì)地輕重、直徑大小等性狀差異對大黃進行商品等級劃分具有一定意義，與主產(chǎn)地藥農(nóng)根據(jù)商品等級進行“優(yōu)形即優(yōu)價”評價方法的科學(xué)內(nèi)涵相一致。

3 討論

對中藥材質(zhì)量評價研究和類似模糊不明確的系統(tǒng)，灰色系統(tǒng)作為有效手段已被廣泛應(yīng)用。因為灰色系統(tǒng)理論中，“中藥成分與中藥質(zhì)量的關(guān)系是一種灰色關(guān)系”，關(guān)聯(lián)度能遵從中醫(yī)藥的灰色思維，極大限度地排除未知因素對灰色關(guān)聯(lián)度法整體評價的影響，尤其適用于現(xiàn)代多因素相互影響、相互制約的問題的研究[13-14]。由本研究建立的模型可知，以大黃素、兒茶素、蘆薈大黃素、總灰分及浸出物為指標建立的灰色關(guān)聯(lián)度模型應(yīng)用于大黃不同商品等級藥材的質(zhì)量評價，能夠較為客觀地反映大黃不同商品等級的內(nèi)在質(zhì)量，與傳統(tǒng)鑒別評價結(jié)果基本一致。在走訪調(diào)查中，大黃由于種植、采收、初加工方法不同，藥農(nóng)一般在采挖后除去雜質(zhì)，用線串起來晾干，有些部分地區(qū)則剝?nèi)ネ馄ず笱?，人為隨意加工造成商品規(guī)格等級混亂的情況多有發(fā)生，說明“辨狀論質(zhì)”雖然具有很強的操作性，但其科學(xué)內(nèi)涵理論研究還是要基于多種化學(xué)成分來闡述商品規(guī)格劃分的科學(xué)性，探索新技術(shù)、新方法在根及根莖類藥材商品規(guī)格等級中的應(yīng)用，不斷提高標準的穩(wěn)定性、科學(xué)性和實用性。

目前國內(nèi)不同產(chǎn)地大黃的流通交易多以“小規(guī)模、自加工”的農(nóng)戶生產(chǎn)模式普遍存在[15]，加之各主產(chǎn)區(qū)鄉(xiāng)鎮(zhèn)因種植不規(guī)范、采收年限短等原因，導(dǎo)致該藥材商品質(zhì)量參差不齊。本文收集了44批大黃不同商品等級，能夠代表全國不同產(chǎn)地不同商品等級大黃質(zhì)量的實際情況。由表7可以看出，蒽醌類化學(xué)成分含量均有不同程度的降低，順序均為一等品>二等品>三等品>水根。原因可能是蒽醌類化學(xué)成分多聚集在大黃藥材組織的韌皮部內(nèi)部，隨著樣品的性狀變化，相比其內(nèi)部橫切面減少程度增加，故蒽醌類化學(xué)成分隨著商品等級的變化而顯著降低，另外，樣品具有“質(zhì)地堅實，大黃藥材的斷面呈深黃色，橫切面具有明顯的放射狀紋理，口嘗后味較苦”的優(yōu)質(zhì)性狀，其蒽醌類化學(xué)成分含量相對較多，與王雁梅等[16]研究結(jié)果一致，說明制訂規(guī)格等級以藥材形狀、長短、粗細、色澤、斷面等特征傳統(tǒng)的性狀特征作為主要依據(jù)，并結(jié)合藥材內(nèi)在化學(xué)成分的質(zhì)量，來制定商品規(guī)格等級標準較為合理。

中藥材既有藥物屬性，又有商品屬性，尤其大黃藥材在流通和貿(mào)易中有著不同的商品規(guī)格等級，以保證中藥材市場交易的有序性和藥材的品質(zhì)。本研究采用灰色關(guān)聯(lián)法，將中醫(yī)藥的灰色思維運用于大黃藥材商品等級劃分，進行大黃藥材質(zhì)量綜合評價的研究，可探索藥材物理特征變化和化學(xué)特性變化的相關(guān)性，能更好地反映了不同產(chǎn)地中不同商品等級的大黃質(zhì)量特性。數(shù)據(jù)結(jié)果表明不同商品等級劃分與大黃中多種有效成分含量存在一定相關(guān)性，優(yōu)形即優(yōu)價，說明現(xiàn)行的大黃商品等級劃分具有一定的科學(xué)性和合理性，建議在臨床的使用上，應(yīng)根據(jù)病癥的程度不同，選擇對應(yīng)的商品等級，使中藥飲片更好地發(fā)揮藥效。