李宣儒 夏 玉 王 麗 余思云 劉曉慶 付金榮

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)龍華臨床醫(yī)學(xué)院，上海 200032；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院，上海 200011；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院婦科，上海 200032

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EM)是婦科常見的疑難雜癥，在全世界育齡期婦女中占10%，是導(dǎo)致痛經(jīng)和慢性盆腔疼痛的主要原因之一[1]。其反復(fù)發(fā)作的疼痛嚴(yán)重影響女性的身心健康，使部分患者出現(xiàn)抑郁焦慮傾向，故如何緩解患者的疼痛，提高患者生活質(zhì)量已成為臨床治療EM的關(guān)鍵。課題組前期研究[2]證實盆痛靈可以緩解EM大鼠的疼痛，本研究在前期EM造模的基礎(chǔ)上加入夾尾，建立病證結(jié)合的氣滯血瘀型EM大鼠疼痛模型，以進(jìn)一步探究盆痛靈對氣滯血瘀型EM大鼠的鎮(zhèn)痛作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 動物 9周齡清潔級SD雌性大鼠，規(guī)格為(180±20)g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，合格證號：SCXK(浙)2019-0001，動物實驗嚴(yán)格遵守上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會的要求(No.PZSHUTCM201106008)。

1.2 藥物 盆痛靈顆粒劑(三棱，莪術(shù)，延胡索，川楝子，虎杖)，龍華醫(yī)院中藥房提供，符合質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)。按成年人體重為50 kg計算，每日生藥量為51 g，SD大鼠按人體每日用藥量的6.25倍進(jìn)行換算，故每日給藥量為6.375 g·kg-1·d-1。

1.3 主要試劑和儀器 試劑：反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit(批號：RR037A，TaKaRa公司)，熒光定量PCR試劑盒 TB Green?Premix Ex TaqTM(批號：RR420A，TaKaRa公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(批號：A0208，碧云天)，Cox2(D5H5)XP?Rabbit mAb#12282(批號：12282S，CST)，Trizol(批號：G8011-100mL，Adamas life)，大鼠前列腺素E2(PGE2)酶聯(lián)免疫分析(批號：MM-0068R1，酶免)，大鼠雌二醇(E2)酶聯(lián)免疫(批號：MM-0575R1，酶免)。儀器：VonFrey纖維絲(型號：NC12775-99，NorthCoast)，全自動血流變測試儀(型號：ZL9100C，北京眾馳偉業(yè)科技發(fā)展有限公司)，PCR基因擴增儀(型號：PROFLEX，賽默飛)，實時熒光定量基因擴增儀(型號：7500，賽默飛)，低溫高速離心機(型號：Centrifuge 5810 R，Eppendorf)，酶標(biāo)儀(型號：Synergy H1，BioTek Instruments，Inc.)等。

1.4 分組、造模和給藥方法 通過自體內(nèi)膜種植法[3]對大鼠進(jìn)行EM造模，取造模成功的30只大鼠，隨機分成A組(EM造模1周后夾尾)，B組(EM造模不夾尾)和C組(EM造模1周后夾尾加中藥盆痛靈干預(yù))。另設(shè)假手術(shù)組(結(jié)扎后剪下單側(cè)的一段子宮，不進(jìn)行內(nèi)膜種植)20只：隨機抽取10只作為D組(假手術(shù)1周后夾尾)，剩余10只為E組(假手術(shù)不夾尾)。

在開腹造模1周后，大鼠腹部傷口基本愈合，開始對A組、C組和D組進(jìn)行夾尾造模：用紗布包裹書夾(紗布是為了控制書夾力度，防止大鼠尾部皮膚受損)，夾住大鼠的尾部，大鼠被夾后情緒暴躁，會與其他大鼠發(fā)生打斗，此時可以把書夾松開，每次刺激30 min，每日2次，持續(xù)刺激3周[4]。

2周后各組大鼠進(jìn)行二次開腹，EM模型大鼠內(nèi)異灶向上凸起且內(nèi)含透亮液體視為造模成功。夾尾造模的大鼠通過觀察其行為學(xué)特征(舌紫，暴躁等氣滯血瘀之象)，血液流變學(xué)(升高)和痛閾(變小)的變化判斷其模型質(zhì)量。

所有大鼠均采用直腸給藥，A組、B組、D組、E組給予1 mL 0.9%生理鹽水。C組給予盆痛靈，按照《藥理實驗方法學(xué)》[5]換算，劑量為每日6.375 g·kg-1(臨床等效量)，配成1 mL藥液。各組大鼠灌腸均每次1 mL，每日1次，持續(xù)4周。末次給藥后，采集大鼠血液、腹腔液、子宮內(nèi)膜組織。

2 檢測指標(biāo)及方法

2.1 痛閾測量 搭建老鼠足底觸覺痛覺測試鑿孔臺，該設(shè)備分為鑿孔臺和鼠籠。大鼠放于鼠籠適應(yīng)環(huán)境30 min，按照Dixon的“up&down”法，使用VonFrey纖維絲從2.0 g的力度開始刺激大鼠腳掌中部的皮膚，觀察大鼠是否有縮足舔爪等躲避反應(yīng)，并進(jìn)行記錄[6]。如大鼠無反應(yīng)為陰性反應(yīng)(記為“o”)，使用大一級的纖維絲繼續(xù)刺激。大鼠出現(xiàn)縮足為陽性反應(yīng)(記為“x”)，使用小一級力度的纖維繼續(xù)刺激。當(dāng)大鼠陰性反應(yīng)和陽性反應(yīng)(“ox”或“xo”)交替出現(xiàn)時，再連續(xù)往后測 4 次，得到一串以“o”和“x”組合而成的序列，以該序列和最后一根纖維絲的刺激力規(guī)格，計算得出痛閾。測量時間為各組大鼠造模前(術(shù)前痛閾，術(shù)D0)，以及二次開腹術(shù)后第 1天、第 3天、第 5天 、第 7天 、第14天、第21天和第28天(術(shù)D1、術(shù)D3、術(shù)D5、術(shù)D7、術(shù)D14、術(shù)D21、術(shù)D28)。

2.2 內(nèi)異灶體積測量 游標(biāo)卡尺測量內(nèi)異灶的最大橫徑，和與之垂直的縱徑，計算體積。

2.3 血液流變學(xué)檢測 腹主動脈取血4 mL，放入肝素抗凝負(fù)壓采血管中，采用全自動血流變測試儀檢測凝血四項。

2.4 免疫組化檢測子宮內(nèi)膜組織中COX-2蛋白的表達(dá) 對大鼠子宮內(nèi)膜組織進(jìn)行包埋，切片，脫蠟復(fù)水，抗原修復(fù)，血清封閉。加一抗，濕盒 4 ℃ 孵育過夜。加二抗，濕盒37 ℃內(nèi)孵育45 min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察及拍片，每張切片拍攝5個視野(x200)，使用Image-pro軟件對COX-2蛋白進(jìn)行積分光密度(IOD)的計算。

2.5 ELISA檢測腹腔液中E2、PGE2的水平 取大鼠腹腔液，配置試劑備用。在待測樣品孔中加樣品稀釋液40 μL，再加待測樣品10 μL?；靹?，除空白孔外每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL，貼封板膜，37 ℃孵育60 min。棄去孔內(nèi)液體，甩干，加洗滌液洗滌5次，拍干。每孔先加入顯色劑A50 μL，再加入顯色劑B50 μL，混勻，37 ℃避光顯色15 min。加終止液50 μL，以空白孔調(diào)零，450 nm波長測量各孔的OD值。

2.6 RT-qPCR檢測子宮內(nèi)膜組織中COX-2mRNA的表達(dá) 50 mg大鼠組織加入 1 mL Trizol，冰上靜置，加入氯仿，離心，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，離心，加入等體積乙醇洗滌，離心，溶解于DEPC水中，以紫外分光光度計測其濃度和OD260/OD280、OD260/OD230。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit合成cDNA，β-actin作為內(nèi)參，擴增引物由生工生物工程合成，引物序列見表1，使用熒光定量PCR試劑盒TB Green?Premix Ex TaqTM進(jìn)行實時熒光定量PCR。每組設(shè)3個復(fù)孔，采用2-△△ct的方法計算其COX-2mRNA表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 氣滯血瘀型疼痛模型大鼠的行為學(xué)特征 A組與D組爪甲舌色瘀紫，耳緣發(fā)紫，尾部有暗紫色瘀斑，眼睛突出，暴躁易怒，攻擊性強，易激惹[7]，體型偏瘦，食少，飲水多。C組用藥后4周爪甲舌色呈粉紅色，性情溫和，體型圓潤，B組與E組無明顯特征。

3.2 大鼠不同時間段的痛閾變化 各組大鼠術(shù)D0痛閾無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.10)。E組術(shù)D0、術(shù)D7與術(shù)D28的痛閾無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，可證明假手術(shù)造模和生理鹽水灌腸對痛閾無影響。B組術(shù)D14痛閾小于E組(P<0.05)，可證明EM造?？山档痛笫笸撮?，使大鼠的疼痛敏感度升高。D組術(shù)D14痛閾小于E組(P<0.05)，提示單純夾尾也可以降低大鼠痛閾，提高大鼠疼痛敏感度。D組術(shù)D14痛閾大于B組(P<0.05)，說明EM造模降低痛閾的效果高于夾尾。A組術(shù)D14痛閾小于D組(P<0.01)與B組(P<0.05)，提示相較于單純的夾尾或EM造模，夾尾聯(lián)合EM造模降低大鼠痛閾的效果最好。A組術(shù)D28痛閾與術(shù)D14無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.50)，小于B組術(shù)D28(P<0.05)；D組術(shù)D28痛閾與術(shù)D14無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，小于E組術(shù)D28(P<0.001)，術(shù)D28時夾尾造模已停止2周，痛閾仍持續(xù)下降，說明該造模具有持續(xù)性。C組術(shù)D28大于A組術(shù)D28(P<0.001)，提示盆痛靈可治療氣滯血瘀型EM。見表2。

表2 大鼠不同時間段的痛閾變化

如圖1，E組和C組在術(shù)后先下降，后逐漸上升，高于其他3組。D組在術(shù)后先下降，后緩慢上升，又在氣滯血瘀的造模過程中下降。A組和B組術(shù)后基本呈下降趨勢，前者整體較后者更低。

圖1 大鼠不同時間段的痛閾變化

3.3 盆痛靈對大鼠異位灶體積的影響 如表3，A組、B組在二次開腹時的異位灶體積小于其取材時(P<0.01)，提示此兩組異位灶體積隨著時間變化逐漸增大，生理鹽水灌腸無治療作用。C組在二次開腹時的異位灶體積大于其取材時(P<0.001)，小于A組取材時(P<0.001)，提示盆痛靈可縮小異位灶體積。

表3 二次開腹和取材時大鼠異位灶體積變化

3.4 大鼠血液流變學(xué)變化 如表4，B組全血黏度低、中、高切大于E組(P<0.05)，提示大鼠經(jīng)EM造模后血液黏度變高。A組全血黏度低切大于B組(P<0.05)，D組全血黏度低、中切大于E組(P<0.05)，提示大鼠經(jīng)過夾尾造模后，紅細(xì)胞聚集性變高，血液黏度變高。D組全血黏度低、中、高切小于A組(P<0.05)，與B組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，提示夾尾聯(lián)合EM造模相較于單純的EM造模或夾尾，可以進(jìn)一步提高大鼠血液黏度。C組全血黏度低、中、高切小于A組(P<0.05)，全血黏度低、中、高切和血漿黏度均與E組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.10)，提示盆痛靈可以改善氣滯血瘀型EM大鼠的血液黏滯程度。

表4 大鼠血液流變

3.5 免疫組化檢測大鼠子宮內(nèi)膜組織中COX-2蛋白的表達(dá) COX-2主要在大鼠異位子宮內(nèi)膜組織的腺上皮細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞的胞漿中進(jìn)行表達(dá)，在正常子宮內(nèi)膜上表達(dá)較弱。它在A組表達(dá)最為明顯，B組其次，在D組的陽性表達(dá)較前兩者減弱，在C組和E組里基本無明顯陽性表達(dá)，如圖2所示。

圖2 大鼠子宮內(nèi)膜組織中COX-2蛋白的表達(dá)(免疫組化，×200)

如表5，A組的COX-2蛋白表達(dá)高于B組(P<0.05)，D組高于E組(P<0.01)，提示經(jīng)過夾尾造模后，大鼠子宮內(nèi)膜組織中COX-2蛋白的表達(dá)水平升高。C組和E組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，低于A組(P<0.001)，提示盆痛靈可以降低COX-2蛋白表達(dá)水平。

3.6 ELISA檢測大鼠腹腔液中E2，PGE2的水平 如表6與表7，A組高于B組(E2：P<0.001；PGE2：P<0.01)，D組高于E組(P<0.001)，提示經(jīng)過夾尾造模后，大鼠E2，PGE2水平增高。C組和E組無統(tǒng)計學(xué)差異(E2：P>0.05；PGE2：P>0.5)，低于A組(P<0.001)，提示盆痛靈可降低氣滯血瘀型EM大鼠的E2，PGE2水平。

表5 大鼠子宮內(nèi)膜組織中COX-2蛋白的表達(dá)

表6 大鼠腹腔液的E2水平

表7 大鼠腹腔液的PGE2水平

3.7 RT-qPCR檢測大鼠子宮內(nèi)膜組織中COX-2mRNA的表達(dá) 見表8，A組的COX-2 mRNA大于B組(P<0.001)，D組的COX-2 mRNA高于E組(P<0.01)，提示經(jīng)過夾尾造模后，大鼠COX-2 mRNA表達(dá)升高。C組與E組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，低于A組(P<0.01)，證明盆痛靈可降低氣滯血瘀型EM大鼠COX-2 mRNA表達(dá)水平。

表8 大鼠子宮內(nèi)膜組織中COX-2mRNA的表達(dá)

3.8 各檢測指標(biāo)與痛閾的相關(guān)性分析 見表9，COX-2蛋白、COX-2 mRNA、E2和PGE2的表達(dá)水平與痛閾之間均存在顯著相關(guān)及負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明COX-2蛋白、COX-2 mRNA、E2和PGE2的表達(dá)水平越高，大鼠痛閾越低，疼痛越嚴(yán)重。

表9 各檢測指標(biāo)與痛閾的相關(guān)性分析

4 討論

目前臨床上尚無能徹底治愈EM的藥物，故人們一直致力于新藥物的研發(fā)。疼痛是EM最主要的癥狀，構(gòu)建符合EM臨床發(fā)病特點的動物模型是藥物研發(fā)的基礎(chǔ)，所以創(chuàng)建理想的EM疼痛動物模型是值得關(guān)注的問題。

當(dāng)前EM模型多著重于EM疾病本身，尚未見有針對EM疼痛的模型報道。課題組前期研究[2]已證實通過自體內(nèi)膜移植可成功建造EM模型大鼠。本研究在前期研究基礎(chǔ)上首次加入夾尾，建立病證結(jié)合的氣滯血瘀型EM大鼠疼痛模型，通過機械測痛，檢測血液流變和觀察行為學(xué)特征對該模型質(zhì)量進(jìn)行評價。該疼痛模型在西醫(yī)理論復(fù)制疾病模型的基礎(chǔ)上，運用中醫(yī)理論構(gòu)建證候模型的方法加重大鼠疼痛度，旨在為EM疼痛防治研究提供穩(wěn)定性高，重復(fù)性好且與臨床實際更吻合的動物模型。

本研究中，夾尾后的大鼠爪、甲、舌、耳，尾部的顏色發(fā)紫，且伴有眼突，暴躁易激，是持續(xù)疼痛導(dǎo)致的氣滯血瘀之象；比較各組痛閾，與單純夾尾或EM造模相比，夾尾聯(lián)合EM造模的大鼠痛閾最低，說明夾尾作為一種輔助手段，聯(lián)合EM造?？勺畲蟪潭冉档痛笫笸撮?，增高其痛覺敏感度；比較各組血液流變學(xué)，夾尾聯(lián)合EM造模的大鼠全血黏度上升程度最高，提示大鼠紅細(xì)胞聚集性變高，紅細(xì)胞積聚形成血瘀，使血液黏度變高[9]，符合氣滯血瘀狀態(tài)。該模型夾尾造模結(jié)束于術(shù)D14，血液流變水平和痛閾(術(shù)D28)的結(jié)果均是在夾尾造模停止2周后測得的，說明其氣滯血瘀狀態(tài)具有持續(xù)性，不會隨物理刺激的停止而消失，故具有一定推廣性。

有研究證實，COX-2與PGE2在EM中與疼痛呈正相關(guān)。COX-2通過生成PGE2，參與炎癥反應(yīng)，加重EM的疼痛[10-11]。PGE2升高可加速E2的合成[12]，E2可介導(dǎo)ERβ上調(diào)COX-2表達(dá)，而COX-2又刺激炎性介質(zhì)PGE2產(chǎn)生[13-14]，三者相互作用，使EM患者感到疼痛。

觀察各組COX-2蛋白、COX-2 mRNA、E2和PGE2表達(dá)水平及各指標(biāo)與痛閾的相關(guān)性分析可發(fā)現(xiàn)：夾尾后大鼠各項指標(biāo)表達(dá)皆有上升，痛閾變低，疼痛程度加重，其中夾尾聯(lián)合EM造模的大鼠各指標(biāo)表達(dá)水平最高，痛閾最低。使用盆痛靈治療后，大鼠各項指標(biāo)表達(dá)皆下降，痛閾變高，疼痛得到緩解。

盆痛靈方由三棱、莪術(shù)、虎杖、延胡索和川楝子組成，具活血行氣、祛濕止痛之功[15-16]。前期研究[17]表明盆痛靈可緩解EM盆腔疼痛，本實驗大鼠治療后，爪甲舌色呈粉紅，性溫體圓；血液流變水平下降；內(nèi)異灶縮??；痛閾升高，大鼠疼痛得到緩解，盆痛靈方的作用機理可能是通過COX2-PGE2信號通路，抑制PGE2的表達(dá)水平，從而起到鎮(zhèn)痛作用。