李 星 劉京鋒 李 博

北京市和平里醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100013

調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，我國腦梗死年發(fā)病率為144.8/10萬，死亡率為62.2/10 萬，已成為居民死亡的主要原因之一[1]。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）斑塊破裂引起的血管狹窄或阻塞是腦梗死發(fā)生的重要原因[2]。目前臨床主要依靠影像學(xué)檢查頸動脈粥樣硬化（carotid atherosclerosis，CAS）斑塊判斷斑塊穩(wěn)定性，尚缺乏理想的生物標(biāo)志物[3]。研究表明，炎癥反應(yīng)和微RNA（microRNA，miRNA）在AS 發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色[4-5]。miR-125a-3p 和miR-224-3p 是新近發(fā)現(xiàn)的廣泛保守的miRNA 分子，研究報(bào)道m(xù)iR-125a-3p和miR-224-3p參與炎癥反應(yīng)過程[6-7]。同時(shí)有研究指出，miR-125a-3p 能通過加重血管狹窄促進(jìn)AS 發(fā)生[8]，miR-224-3p能通過抑制炎癥反應(yīng)抑制AS 形成[9]。然而關(guān)于血清miR-125a-3p、miR-224-3p 表達(dá)與腦梗死患者CAS斑塊穩(wěn)定性的關(guān)系尚不清楚，本研究對此進(jìn)行分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年3 月至2021 年12 月北京市和平里醫(yī)院（以下簡稱“我院”）收治的120 例腦梗死患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]；②年齡≥18 歲；③經(jīng)超聲檢查證實(shí)存在CAS 斑塊；④首次診治；⑤資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①腦出血或近3 個(gè)月內(nèi)顱腦手術(shù)史或外傷史；②合并造血、免疫系統(tǒng)損害、惡性腫瘤；③合并嚴(yán)重實(shí)質(zhì)性臟器損傷；④近3 個(gè)月內(nèi)有急慢性感染；⑤近6 個(gè)月內(nèi)有免疫抑制劑、激素使用史。參考《中國腦卒中血管超聲檢查指導(dǎo)規(guī)范》[11]，將不規(guī)則斑塊（斑塊表面不光滑和纖維帽不全，管腔血流充盈不全）和潰瘍性斑塊（斑塊表面纖維帽不連續(xù)破裂，形成“火山口”征）判定為不穩(wěn)定斑塊。根據(jù)CAS 斑塊穩(wěn)定性將患者分為不穩(wěn)定組（75 例）和穩(wěn)定組（45例）。本研究經(jīng)我院科教科倫理審批（2022-0015）。

1.2 研究方法

1.2.1 資料收集 收集患者資料，包括性別、年齡、體重指數(shù)、吸煙史、病史（高血壓、糖尿?。⒖偰懝檀?、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）。

1.2.2 血清miR-125a-3p、miR-224-3p 檢測 患者入院次日采集空腹靜脈血3 ml，3 000 r/min 離心15 min（半徑為10 cm），分離血清置于-80℃冰箱保存。Trizol 法提取血清總RNA，TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司，RR036A）合成cDNA。以cDNA 為模板，按照SYBRPremix Ex TaqTM試劑盒（上海赫果生物科技有限公司，DRR820A）說明書，采用PCR 儀（美國ABI，型號：ABI7500）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系共20.0 μl：cDNA 模板1.0 μl、2×Master mix 8 μl、正向引物0.5 μl，反向引物0.5 μl、SYBRPremix Ex Taq 5.0 μl、RNase-free ddH2O 5.0 μl。反應(yīng)條件：95℃90 s、95℃30 s、63℃30 s、72℃15 s，循環(huán)40 次后收集 Ct 值，2-ΔΔCT法計(jì)算血清 miR-125a-3p、miR-224-3p 相對表達(dá)量。引物設(shè)計(jì)和合成由上海劍鈍生物科技有限公司完成，miR-125a-3p 正向引物序列為5’-TAACCGCAGAGGTCACACTCAG-3’，反向引物序列為5’-CTCAGAAACTGTGGCATCCCGA-3’。miR-224-3p 正向引物序列為 5’-TAATCTCAGCTGGCAACTGTG-3’，反向引物序列為5’-GAACATGTCTGCGTA-TCTC-3’。miR-125a-3p內(nèi)參U6 正向引物序列為5’-ACTTTCACGCCGCTCATCCAGT-3’，反向引物序列為5’-TCTCAGGACTGGTTCACAG-CGT-3’。miR-224-3p 內(nèi)參U6 正向引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3’，反向引物序列為5’-TTTGCGTGTCATCCTT-GCG-3’。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 28.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)和百分率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。采用logistic 回歸模型分析影響因素；Hosmer-Lemeshow檢驗(yàn)?zāi)Ｐ蛿M合度；采用受試者操作特征曲線分析診斷價(jià)值。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料比較

不穩(wěn)定組吸煙者占比、糖尿病患者占比、LDL-C、miR-125a-3p 表達(dá)高于穩(wěn)定組，miR-224-3p 表達(dá)低于穩(wěn)定組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2 腦梗死患者CAS 斑塊穩(wěn)定情況的影響因素分析

以吸煙（是=1；否=0）、糖尿?。ㄓ?1；無=0）、LDL-C（原值錄入）、miR-125a-3p（原值錄入）、miR-224-3p（原值錄入）為自變量，CAS 斑塊穩(wěn)定性（不穩(wěn)定=1；穩(wěn)定=0）為因變量進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示，吸煙、糖尿病、LDL-C、miR-125a-3p、miR-224-3p 為腦梗死患者CAS 斑塊不穩(wěn)定的影響因素（P＜0.05）。見表2。

表2 腦梗死患者CAS 斑塊穩(wěn)定情況的影響因素分析

2.3 腦梗死患者CAS 斑塊不穩(wěn)定的預(yù)測模型及其診斷價(jià)值

以CAS 斑塊不穩(wěn)定的獨(dú)立影響因素構(gòu)建預(yù)測模型Log=P/（1-P）=0.973×吸煙+1.161×糖尿病+1.866×LDL-C+0.034×miR-125a-3p-0.668×miR-224-3p。Hosmer-Lemeshow 檢驗(yàn)結(jié)果顯示模型擬合效果良好（χ2=14.377，P=0.072）。受試者操作特征曲線分析顯示，該模型預(yù)測腦梗死患者CAS 斑塊不穩(wěn)定的曲線下面積為0.915（95%CI：0.850～0.958，P＜0.05），截?cái)嘀禐?.625，約登指數(shù)、靈敏度、特異度分別為0.751、84.00%、91.11%。見圖2。

圖1 腦梗死患者頸動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定預(yù)測模型的受試者操作特征曲線

3 討論

炎癥反應(yīng)貫穿AS 發(fā)生發(fā)展的全過程，在AS 初期炎癥反應(yīng)能損害血管內(nèi)皮和促進(jìn)血管平滑肌增殖、遷移等促進(jìn)AS 形成和發(fā)展，在AS 后期炎癥反應(yīng)能誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)降解增加和合成減少，導(dǎo)致斑塊纖維帽變薄，最終引起斑塊不穩(wěn)定和破裂[12-17]。近年來隨著生命科學(xué)的快速發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 能通過引發(fā)mRNA 降解或轉(zhuǎn)錄后沉默，通過調(diào)控炎癥反應(yīng)等參與AS 發(fā)生發(fā)展[18-20]。miR-125a-3p 定位于人染色體19q13.41，參與炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展，Wang 等[21]研究報(bào)道，下調(diào)miR-125a-3p 能靶向Wnt/β-連環(huán)蛋白和核因子κB 通路抑制成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。Wang 等[22]研究報(bào)道，下調(diào)miR-125a-3p 能靶向酪氨酸蛋白激酶Fyn 抑制核因子κB 通路，抑制成牙母細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。上述研究提示，miR-125a-3p 具有促炎作用。同時(shí)有研究指出，miR-125a-3p 表達(dá)上調(diào)會加重低密度脂蛋白誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損害，促進(jìn)AS 形成[23]。本研究顯示，不穩(wěn)定組血清miR-125a-3p表達(dá)升高，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，血清miR-125a-3p 表達(dá)升高為腦梗死患者CAS 斑塊不穩(wěn)定的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示血清miR-125a-3p 表達(dá)上調(diào)與腦梗死患者斑塊不穩(wěn)定有關(guān)，分析原因可能與miR-125a-3p 表達(dá)上調(diào)通過促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)展，誘導(dǎo)AS 斑塊不穩(wěn)定有關(guān)。劉演龍等[24]研究也發(fā)現(xiàn)，抑制miR-125a-3p 能減輕AS 斑塊炎癥反應(yīng)和細(xì)胞外基質(zhì)降解，增強(qiáng)AS斑塊穩(wěn)定性。

miR-224-3p 定位于人染色體Xq28，研究報(bào)道[25]miR-224-3p 能通過抑制白細(xì)胞介素-1β 減輕軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)。Wang 等[26]研究指出，上調(diào)miR-224-3p能減輕血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)，發(fā)揮內(nèi)皮保護(hù)和抗AS 作用。這些研究提示，miR-224-3p 具有抗感染作用。本研究結(jié)果顯示，不穩(wěn)定組血清miR-224-3p 表達(dá)降低，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，血清miR-224-3p 表達(dá)升高為腦梗死患者CAS 斑塊不穩(wěn)定的保護(hù)因素，提示血清miR-224-3p 表達(dá)下調(diào)與腦梗死患者斑塊不穩(wěn)定有關(guān)，分析原因可能是miR-224-3p 表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致炎癥進(jìn)展，進(jìn)而引起AS 斑塊不穩(wěn)定。巨噬細(xì)胞在AS 炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，研究表明，miR-224-3p 能靶向腫瘤壞死因子超家族成員14 抑制巨噬細(xì)胞向炎癥表型轉(zhuǎn)換，減輕巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚，進(jìn)而增強(qiáng)AS 斑塊穩(wěn)定性[27]。

本研究結(jié)果顯示，吸煙、糖尿病和LDL-C 升高也會增加腦梗死患者CAS 斑塊不穩(wěn)定，分析原因可能是吸煙和糖尿病均能增強(qiáng)機(jī)體炎癥反應(yīng)，通過破壞斑塊纖維帽導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定性增加[28]；LDL-C 是AS 斑塊形成的必要條件，LDL-C 升高會促進(jìn)AS 進(jìn)一步發(fā)展，導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定性風(fēng)險(xiǎn)增加[29-31]。本研究聯(lián)合吸煙、糖尿病、LDL-C、miR-125a-3p、miR-224-3p 構(gòu)建腦梗死患者CAS 斑塊不穩(wěn)定的預(yù)測模型，結(jié)果顯示該模型的曲線下面積為0.915，提示其預(yù)測價(jià)值較高。

綜上所述，腦梗死患者血清miR-125a-3p 表達(dá)升高，miR-224-3p 表達(dá)降低，可能成為腦梗死患者CAS斑塊不穩(wěn)定的輔助評估指標(biāo)。但本研究結(jié)果還需多中心大樣本研究證實(shí)。