石素雅 白會(huì)會(huì) 杜夢(mèng)瑤 程冬梅 范琳媛 陳素文 劉朝暉

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院 北京婦幼保健院婦科，北京 100026

自然流產(chǎn)是早期妊娠最為常見的并發(fā)癥，其發(fā)生率占所有妊娠的15%～25%，而稽留流產(chǎn)是一種特殊類型的自然流產(chǎn)，是指胚胎或胎兒在已經(jīng)死亡后滯留宮腔內(nèi)而未能及時(shí)自然排出，占臨床的15%～20%[1]?；袅鳟a(chǎn)導(dǎo)致彌散性血管內(nèi)凝血的風(fēng)險(xiǎn)增加，或可發(fā)生多次成為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)，嚴(yán)重影響孕婦身心健康。常見病因有胚胎染色體異常、解剖異常、內(nèi)分泌異常、感染因素、自身免疫因素等。由陰道菌群失衡引起的感染可能會(huì)通過陰道上行傳播到子宮，激活趨化因子并誘導(dǎo)局部免疫反應(yīng)，進(jìn)一步導(dǎo)致流產(chǎn)。另外，陰道菌群異?？赡芤鸫傺仔约?xì)胞因子升高，進(jìn)而激活炎癥途徑，上行感染宮腔，降低子宮內(nèi)膜容受性和著床，引起稽留流產(chǎn)[2-4]。本研究主要關(guān)注稽留流產(chǎn)患者陰道菌群情況及相關(guān)因素分析，以進(jìn)一步揭示流產(chǎn)相關(guān)因素。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020 年9 月至2021 年6 月就診于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院的患者，將稽留流產(chǎn)患者30 例納入試驗(yàn)組，正常早孕擬行人工流產(chǎn)患者30 例納入對(duì)照組，并進(jìn)一步將稽留流產(chǎn)患者根據(jù)胚胎絨毛染色體檢查結(jié)果分為染色體正常組16 例、染色體異常組6 例、染色體不詳組8例。所有入組者均知情同意，并通過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2019-KY-075-01），填寫調(diào)查問卷。稽留流產(chǎn)患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～55 歲；②有性生活史，現(xiàn)妊娠時(shí)間＜12 周；③經(jīng)臨床檢查及B 超輔助診斷確診為胚胎停止發(fā)育。滿足以上條件且胚胎絨毛染色體正常的胎停育患者納入染色體正常組，滿足以上條件且染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常的胎停育患者納入染色體異常組，滿足以上條件但未行胚胎絨毛染色體檢查的胎停育患者納入染色體不詳組。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～55 歲；②有性生活史，現(xiàn)妊娠時(shí)間＜12周。排除標(biāo)準(zhǔn)：①72 h 內(nèi)有性生活或陰道上藥；②因其他疾病長(zhǎng)期應(yīng)用激素、抗菌藥物或免疫抑制劑；③患有慢性全身系統(tǒng)性疾病或惡性腫瘤。

1.2 研究方法

1.2.1 病史采集 ①基線資料，包括年齡、學(xué)歷、月收入、吸煙、既往陰道炎史、既往泌尿系感染史、既往盆腔炎史、初次性生活年齡、既往流產(chǎn)史；②陰道微生態(tài)指標(biāo)，包括形態(tài)學(xué)及功能學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)[5]，其中形態(tài)學(xué)上的評(píng)價(jià)指標(biāo)包括菌群密集度、多樣性、優(yōu)勢(shì)菌、乳桿菌分級(jí)、清潔度、細(xì)菌性陰道?。╞acterial vaginosis，BV）Nugent 評(píng)分、需氧菌性陰道炎（aerobic vaginitis，AV）Donders 評(píng)分、病原微生物檢測(cè)（假絲酵母菌、BV）；功能學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)包括陰道分泌物酸堿度（pH 值）、過氧化氫、白細(xì)胞酯酶、唾液酸苷酶、β 葡萄糖醛酸酶、乙酰氨基葡萄糖苷酶。

1.2.2 樣本收集 取兩根無菌棉拭子采集陰道側(cè)壁上1/3 的分泌物，其中一根拭子涂片，革蘭染色處理后，油鏡觀察陰道菌群情況并評(píng)價(jià)上述微生態(tài)指標(biāo)；另一根拭子置入含無菌生理鹽水的2 ml EP 管內(nèi)，-80℃密閉保存，用于菌群測(cè)定。

1.2.3 菌群測(cè)定及分析 本研究基于Illumina Novaseq測(cè)序平臺(tái)，選取細(xì)菌16S rRNA 基因V3～V4高變區(qū)進(jìn)行測(cè)序及微生物分類分析。具體步驟如下：提取陰道分泌物中的細(xì)菌DNA，PCR 擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA 基因V3～V4區(qū)，構(gòu)建基因文庫，采用Illumina Novaseq 平臺(tái)測(cè)序，首先使用Trimmomatic 對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量過濾，使用Cutadapt 進(jìn)行引物序列的識(shí)別與去除，其后使用Flash 對(duì)雙端序列進(jìn)行拼接并去除嵌合體，最終得到高質(zhì)量的有效序列用于后續(xù)分析。使用Usearch軟件對(duì)有效序列按照97%相似度分成不同操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），選擇豐度最高的序列作為OTU 代表序列，比對(duì)rRNA 基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行OTU 聚類分析、物種分類分析、Alpha 多樣性分析、β 多樣性分析、菌群差異分析，來進(jìn)一步評(píng)價(jià)樣本中的物種在不同分類水平上的相對(duì)豐度情況。其中Alpha 多樣性反應(yīng)單個(gè)樣品物種的豐富度及均勻度，常用的度量菌群豐富度的指標(biāo)有Ace 指數(shù)、Chao1 指數(shù)，其值越高，菌群豐富度越高；度量菌群多樣性即菌群豐富度和均勻度的指標(biāo)有香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)、辛普森多樣性指數(shù)。香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)越高，辛普森多樣性指數(shù)越低，代表菌群多樣性越高。其中菌群差異分析主要是采用線性判別分析（line discriminant analysis effect size，LEfSe）來估算每個(gè)物種豐度對(duì)差異效果的影響，用于尋找各組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的物種。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，定量資料用中位數(shù)和四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)計(jì)數(shù)資料比較采用秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組基線資料及微生態(tài)指標(biāo)單因素比較

單因素組間基線資料比較結(jié)果顯示，四組既往是否有盆腔炎史比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 四組患者基線資料比較

單因素組間微生態(tài)指標(biāo)比較結(jié)果顯示，四組菌群多樣性、優(yōu)勢(shì)菌比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。菌群密集度、乳桿菌分級(jí)、清潔度、BV Nugent 評(píng)分、AV Donders 評(píng)分、假絲酵母菌、BV、pH 值、過氧化氫、白細(xì)胞酯酶、唾液酸苷酶比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；染色體正常組與對(duì)照組微生態(tài)指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；染色體異常組與對(duì)照組微生態(tài)指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.2 OTU 聚類分析

各組間OTU 有一定的重疊，應(yīng)用R 軟件繪制韋恩圖以直觀體現(xiàn)。本研究中稽留流產(chǎn)患者染色體正常組陰道分泌物獲得1 463 個(gè)OTU，染色體異常組陰道分泌物獲得1 237 個(gè)OTU，染色體不詳組陰道分泌物獲得1 323 個(gè)OTU，正常早孕組陰道分泌物獲得1 597個(gè)OTU。正常早孕組OTU 數(shù)目更多，菌群更豐富。

2.3 物種分類分析

將OTU 根據(jù)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行7 個(gè)水平的物種分類，即界、門、綱、目、科、屬和種，本研究共注釋出28 個(gè)門、67 個(gè)綱、167 個(gè)目、326 個(gè)科、641 個(gè)屬、748個(gè)種水平物種，計(jì)算各物種豐度，并繪制統(tǒng)計(jì)圖。見圖1。

圖1 60 份樣本種分類水平中物種分布柱狀圖

2.3.1 在屬分類水平上，對(duì)照組陰道菌群以乳桿菌屬為主，稽留流產(chǎn)患者中染色體正常組占76.49%，染色體異常組占73.31%，染色體不詳組占74.15%，而對(duì)照組占73.31%，次要優(yōu)勢(shì)菌屬分別為加德納菌屬、普雷沃菌屬、埃希氏-志賀菌屬及嗜酸菌屬，染色體正常組分別占4.21%、1.51%、0.99%、1.36%，染色體異常組分別占5.56%、0.90%、2.34%、1.32%，染色體不詳組分別占2.82%、2.96%、1.57%、0.86%，而對(duì)照組分別占1.57%、1.68%、0.88%、1.41%。與對(duì)照組比較，稽留流產(chǎn)患者染色體正常組乳桿菌屬增多，而染色體異常組及染色體不詳組無明顯變化；稽留流產(chǎn)各組加德納菌屬、埃希氏-志賀菌屬均增多，嗜酸菌均減少；但染色體正常組及染色體異常組普雷沃菌屬減少，而染色體不詳組普雷沃菌屬增多。見圖2。

圖2 四組陰道菌群屬分類水平中物種分布柱狀圖

2.3.2 在種分類水平上，對(duì)照組陰道菌群以未分類乳桿菌為主，稽留流產(chǎn)患者中染色體正常組占42.35%，染色體異常組占64.33%，染色體不詳組占41.91%，而對(duì)照組占47.41%，次要優(yōu)勢(shì)菌分別為惰性乳桿菌、陰道加德納菌、埃希氏-志賀氏菌、嗜酸菌、巨型球菌、普雷沃菌，染色體正常組分別占34.11%、4.21%、0.99%、1.36%、0.79%、0.97%，染色體異常組分別占8.95%、5.56%、2.34%、1.32%、1.46%、0.04%，染色體不詳組分別占32.26%、2.82%、1.57%、0.86%、0.37%、1.43%。與對(duì)照組比較，染色體正常組及染色體不詳組未分類乳桿菌均減少，惰性乳桿菌均增多，而染色體異常組未分類乳桿菌增多，惰性乳桿菌減少；另外，稽留流產(chǎn)患者各組陰道加德納菌、埃希氏-志賀氏菌均增多，嗜酸菌均減少，但染色體正常組與染色體不詳組普雷沃菌增多，巨型球菌減少，而染色體異常組巨型球菌增多，普雷沃菌減少。見圖3。

圖3 四組陰道菌群種分類水平中物種分布柱狀圖

2.4 Alpha 多樣性分析

結(jié)果顯示，四組菌群豐度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中染色體正常組菌群豐度低于對(duì)照組（P＜0.05），但染色體異常組與對(duì)照組菌群豐度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），另外，四組間菌群多樣性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 四組患者陰道分泌物菌群Alpha 多樣性分析結(jié)果[M（P25，P75）]

2.5 β 多樣性分析

研究基于Unweighted-unifrac 距離行PCoA 分析以比較四組間微生物的差異，結(jié)果顯示第一主成分PCoA1 和第二主成分PCoA2 對(duì)區(qū)分各組的貢獻(xiàn)度分別為18.74%和5.94%，四組陰道菌群比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4。Anosim 分析對(duì)β 多樣性差異進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，提示β 多樣性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 四組陰道菌群β 多樣性分析

2.6 菌群差異分析

LEfSe 分析結(jié)果顯示，四組陰道菌群無明顯差異的物種。見圖5。

圖5 稽留流產(chǎn)各組與對(duì)照組陰道菌群的線性判別分析

3 討論

女性陰道微生態(tài)系統(tǒng)主要是由陰道菌群、內(nèi)分泌系統(tǒng)、陰道解剖結(jié)構(gòu)及免疫系統(tǒng)共同組成的，各組之間相互協(xié)調(diào)[6]，其中，陰道菌群是陰道微生態(tài)系統(tǒng)的核心。育齡期女性陰道菌群主要是由種類繁多的需氧菌和厭氧菌組成的，其中乳桿菌是育齡期女性陰道菌群中的優(yōu)勢(shì)菌，寄生于女性陰道內(nèi)的乳桿菌屬多達(dá)20多種，最常見的4 種乳桿菌是卷曲乳桿菌、詹氏乳桿菌、加氏乳桿菌和惰性乳桿菌，通過16S rRNA 測(cè)序的方法又將陰道菌群狀態(tài)（community state type，CST）分為5 型：CST Ⅰ型（以卷曲乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌）、CST Ⅱ型（以加氏乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌）、CST Ⅲ型（以惰性乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌）、CST Ⅳ型（又稱乳桿菌屬缺失型，以厭氧菌等其他雜菌為優(yōu)勢(shì)菌）和CST Ⅴ型（以詹氏乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌），其中CST Ⅳ型又被分為ⅣA、ⅣB、ⅣC0、ⅣC1、ⅣC2、ⅣC3、ⅣC4 型，分別是以BVAB1、陰道加德納菌、普雷沃菌、鏈球菌、腸球菌、雙歧桿菌、葡萄球菌為優(yōu)勢(shì)菌[7]，乳桿菌尤其是卷曲乳桿菌，可以通過產(chǎn)乳酸、過氧化氫，分泌細(xì)菌毒素、黏附陰道上皮細(xì)胞等作用，抑制其他細(xì)菌生長(zhǎng)，維持女性的生殖健康。

關(guān)于陰道菌群與胚胎發(fā)育之間的具體作用及機(jī)制目前研究尚少，目前認(rèn)為，陰道菌群可能通過以下3 種機(jī)制影響妊娠：①陰道菌群可能是維持女性免疫系統(tǒng)平衡的因素，陰道菌群失調(diào)可能會(huì)引起免疫應(yīng)答導(dǎo)致過度炎癥反應(yīng)[8]，表現(xiàn)為炎癥介質(zhì)及炎癥因子（如白細(xì)胞介素-6、γ 干擾素、腫瘤壞死因子-α 等）的升高[9]，進(jìn)而導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶與基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1 失衡[10]，損害胚胎的發(fā)育導(dǎo)致胎停育；②陰道菌群可能會(huì)在女性免疫功能減弱時(shí)上行感染子宮腔，形成子宮內(nèi)膜的定植菌，可能影響胚胎種植，妨礙胚胎的發(fā)育[11]；③陰道菌群失調(diào)可能會(huì)引起宮頸陰道內(nèi)的屏障功能減弱，增加宮頸細(xì)胞通透性，對(duì)胚胎發(fā)育造成影響。

妊娠期是育齡期女性的一段特殊時(shí)期，高雌激素水平可能會(huì)導(dǎo)致陰道上皮細(xì)胞糖原含量增加、陰道前庭腺體分泌增加、陰道及宮頸黏膜充血等生理變化，妊娠期陰道微生態(tài)受感染、遺傳、種族、孕產(chǎn)史及應(yīng)激等的影響[3]?，F(xiàn)已有研究證明，妊娠期女性陰道微生態(tài)狀態(tài)與非妊娠女性存在明顯差異[12-14]，并且妊娠期陰道菌群的改變從早孕期即開始[15-16]。我國(guó)女性妊娠期陰道優(yōu)勢(shì)菌主要為卷曲乳桿菌[17]，德國(guó)一項(xiàng)研究同樣證實(shí)了妊娠期女性陰道優(yōu)勢(shì)菌主要為卷曲乳桿菌，而只是部分女性妊娠期以惰性乳桿菌和陰道加德納菌為優(yōu)勢(shì)菌，印度女性妊娠期陰道優(yōu)勢(shì)菌主要為加氏乳桿菌[18]。

本研究主要通過對(duì)染色體異常組、染色體正常組、對(duì)照組患者陰道菌群狀況分析，來揭示稽留流產(chǎn)與陰道菌群之間的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)染色體異常組與對(duì)照組在物種組成、菌群豐度上無明顯差異，但染色體正常組較對(duì)照組存在不同乳桿菌菌株比例失衡及除乳桿菌以外的其他細(xì)菌（如陰道加德納菌、埃希氏-志賀菌、普雷沃菌等）相對(duì)豐度增加，故稽留流產(chǎn)患者存在的陰道菌群失調(diào)可能與稽留流產(chǎn)有關(guān)。目前認(rèn)為，不同亞型乳桿菌可能對(duì)妊娠結(jié)局的影響不同[19-22]，以卷曲乳桿菌、詹氏乳桿菌、加氏乳桿菌為主的陰道菌群在妊娠中非常常見，與流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)較低有關(guān)[23]，以惰性乳桿菌為主的陰道菌群似乎與特定妊娠相關(guān)病理發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[24]，在稽留流產(chǎn)患者中卷曲乳桿菌、詹氏乳桿菌、加氏乳桿菌的相對(duì)豐度明顯降低，而惰性乳桿菌增加，削弱了乳桿菌對(duì)生殖道正常生理功能的保護(hù)作用。另外，也有研究認(rèn)為陰道菌群中乳桿菌相對(duì)豐度降低，可能會(huì)增加潛在病原體的豐度和多樣性，這種乳桿菌水平低而細(xì)菌多樣性增加的陰道菌群，已經(jīng)檢測(cè)到早產(chǎn)和流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)增加[11-12]；稽留流產(chǎn)患者除乳桿菌以外的其他菌群，如鏈球菌、普雷沃菌、阿托波菌[25]、解脲支原體、沙眼衣原體等相對(duì)豐度高于正常妊娠女性。其中，關(guān)于妊娠期支原體的篩查和治療仍有爭(zhēng)議，有一些研究證明稽留流產(chǎn)患者生殖支原體及解脲支原體相對(duì)豐度均降低[26]。還有研究報(bào)告稱，支原體在陰道環(huán)境中普遍存在，似乎不會(huì)影響妊娠結(jié)局[27]，只有當(dāng)癥狀出現(xiàn)時(shí)才需要治療，所以還需要更多的證據(jù)來證實(shí)。

綜上所述，妊娠期女性陰道微生態(tài)受多種因素的影響，在某些體內(nèi)外因素的影響下，陰道菌群發(fā)生失衡，如乳桿菌相對(duì)豐度降低和/或乳桿菌菌株比例失調(diào)，或其他細(xì)菌（如加德納菌、普雷沃菌、假單胞菌等）相對(duì)豐度增加，機(jī)體免疫力下降，上行感染宮腔，從而導(dǎo)致稽留流產(chǎn)，然而陰道菌群導(dǎo)致稽留流產(chǎn)的直接病因及機(jī)制目前尚未明確。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，可對(duì)陰道菌群進(jìn)行宏基因組測(cè)序，尋找關(guān)鍵菌群及相關(guān)代謝通路，不斷挖掘陰道微生態(tài)環(huán)境對(duì)妊娠結(jié)局的影響，進(jìn)一步探索影響稽留流產(chǎn)的直接病因，從而指導(dǎo)臨床應(yīng)用。