呂曉曉，李煥錚，唐少華

溫州醫(yī)科大學(xué)定理臨床學(xué)院 溫州市中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科，浙江 溫州 325000

染色體微缺失微重復(fù)綜合征（chromosome microdeletion/microduplication syndrome, MMS）是由染色體微小片段缺失或重復(fù)引起的一類遺傳性疾病。已知MMS涵蓋了300多種類型，患者常表現(xiàn)出特殊面容、智力發(fā)育異常、精神行為異常、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、自閉癥等[1]。

1997年，香港中文大學(xué)盧煜明教授團(tuán)隊(duì)首次在孕婦的外周血中發(fā)現(xiàn)含有胎兒的游離DNA片段（cell-free fetal DNA, cffDNA）[2]，這一發(fā)現(xiàn)開創(chuàng)了產(chǎn)前篩查的新模式。從2011年起，基于cffDNA的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)（noninvasive prenatal testing,NIPT）已廣泛應(yīng)用于臨床。2016年，美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG）推薦NIPT可以替代常規(guī)篩查模式[3]。然而，目前NIPT的檢測(cè)范圍僅限于常見的13、18、21-三體，而擴(kuò)展性NIPT（expanded noninvasive prenatal testing, NIPT-plus）不僅能檢測(cè)這三種染色體非整倍體，還能篩查其他97種胎兒染色體異常疾病，其中包括17 種胎兒染色體非整倍體，其中涵蓋4種性染色體異常（45, X、47,XXY、47, XXX、47, XYY）以及其他13種常染色體非整倍體；此外，還包括7種大于3 MB的遺傳綜合征，如1p36缺失綜合征、2q33.1缺失綜合征、22q11.2 缺失綜合征、Angelman綜合征、Cri-Du-Chat綜合征、LangerGiedion綜合征、Prader-Willi綜合征；最 后，NIPT-plus還能檢測(cè)76種大于10 MB的胎兒染色體大片段的缺失重復(fù)綜合征。

盡管關(guān)于NIPT-plus在常見三體的檢測(cè)能力已有許多報(bào)道，但對(duì)于篩查MMS的檢測(cè)效能及其臨床應(yīng)用價(jià)值的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少。因此，本研究收集NIPT-plus檢測(cè)MMS高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦，通過(guò)回顧性分析NIPT-plus和染色體微陣列分析（chromosome microarray analysis, CMA）結(jié)果以及隨訪結(jié)果，評(píng)估NIPT-plus在MMS篩查中的檢測(cè)效能，為MMS高風(fēng)險(xiǎn)孕婦提供更可靠的遺傳咨詢。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象 收集2020年1月至2023年6月在溫州市中心醫(yī)院進(jìn)行NIPT-plus檢測(cè)的5 027例孕婦的臨床資料。年齡為16～53歲，高齡孕婦（＞35歲）共占42.59%（2 141/5 027）。收集所有病例中高風(fēng)險(xiǎn)的NIPT-plus檢測(cè)結(jié)果，并對(duì)其進(jìn)行妊娠結(jié)局的隨訪。本研究經(jīng)過(guò)溫州市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（L2023-03-027），并確保所有孕婦在參與研究前簽署了《檢測(cè)知情同意書》和《保險(xiǎn)知情同意書》。

1.2 方法

1.2.1 NIPT-plus檢查：用EDTA抗凝管抽取孕婦10 mL外周血，離心后收集上層血漿，采用北京貝瑞公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒提取cffDNA，構(gòu)建文庫(kù)，通過(guò)Illumina高通量基因測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行樣本測(cè)序檢測(cè)，產(chǎn)出的原始測(cè)序數(shù)據(jù)量約為NIPT的5倍，將測(cè)序序列與人類基因組參考序列圖譜進(jìn)行比對(duì)，并剔除GC異常區(qū)域、低覆蓋度區(qū)域，進(jìn)行數(shù)據(jù)量歸一化，使用主成分分析法（principal-componentanalysis,PCA）來(lái)降低序列數(shù)分布的偏差，使用隱馬爾可夫模型（hidden Markov model, HMM）進(jìn)行拷貝數(shù)變異（copy number variation, CNV）的檢測(cè)。

1.2.2 CMA檢查：對(duì)NIPT-plus檢測(cè)結(jié)果高風(fēng)險(xiǎn)孕婦，召回并告知侵入性產(chǎn)前診斷風(fēng)險(xiǎn)。在超聲引導(dǎo)定位下，常規(guī)消毒后于孕16～24 周行羊膜腔穿刺術(shù)抽取羊水10 mL。采用德國(guó)QIAGEN公司DNA提取試劑盒提取羊水基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)，用美國(guó)Affymetrix公司生產(chǎn)的Affymetrix CytoScan 750k芯片檢測(cè)，用Chromosome Analysis Suite Software（ChAS）軟件分析。

1.2.3 隨訪：對(duì)NIPT-plus檢出MMS高風(fēng)險(xiǎn)孕婦通過(guò)電話隨訪，孕產(chǎn)婦健康管理電子信息系統(tǒng)查詢，孕產(chǎn)婦保健手冊(cè)查閱等方式明確孕婦妊娠結(jié)局信息。

2 結(jié)果

2.1 孕婦基本情況 共計(jì)5 027例孕婦納入研究，將孕婦的年齡分成5類，≤24歲238例，25～29歲1 191例，30～34歲1 457例，35～39歲1 682例，≥40歲459例，其中＞35歲高齡孕婦有2 141例，占42.59%。NIPT-plus檢出MMS高風(fēng)險(xiǎn)54例，其中＞35歲高齡孕婦有24例，占44.45%。CMA確診14例，其中＞35歲高齡孕婦有7例，占50%，見圖1。

圖1 孕婦年齡分布

2.2 NIPT-plus篩查結(jié)果以及妊娠結(jié)局 在5 027例樣本中，檢出21-三體、18-三體、13-三體、性染色體異常、微缺失微重復(fù)高風(fēng)險(xiǎn)總共94例，陽(yáng)性率為1.87%。其中檢出21-三體18例，其中3例拒絕產(chǎn)前診斷，對(duì)3例孕婦進(jìn)行跟蹤隨訪，1例引產(chǎn)，1例失聯(lián)，1例生育唐氏兒；CMA確診21-三體14例，總體陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（positive predictive value, PPV）為93.33%（14/15）。檢出18-三體2例，其中1例孕婦拒絕進(jìn)一步診斷，隨訪孕婦已胎停，另1例CMA確診。檢出13-三體1例，進(jìn)一步診斷結(jié)果為陰性。檢出性染色體非整倍體異常19例，3例孕婦拒絕進(jìn)行侵入性產(chǎn)前診斷，跟蹤隨訪，1例生產(chǎn)健康胎兒，1例死胎，1例失聯(lián)，確診6例，PPV為37.5%（6/16），其中一例為嵌合體（45, X[36]/47, XXX[4]）。檢出MMS高風(fēng)險(xiǎn)有54例，19例孕婦拒絕進(jìn)行侵入性產(chǎn)前診斷，最終入組MMS高風(fēng)險(xiǎn)孕婦35例，CMA確診14例，其中2例為NIPT-plus檢出外的其他異常，PPV為40%（14/35），見表1。

表1 NIPT-plus檢測(cè)5027例高風(fēng)險(xiǎn)孕婦的胎兒情況

2.3 NIPT-plus與產(chǎn)前診斷結(jié)果的符合情況 NIPTplus篩查提示MMS高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦群體中，通過(guò)CMA實(shí)證了14例。其中12例的CMA結(jié)果與NIPT-plus的預(yù)測(cè)相吻合，見表2；2例為NIPT-plus未能捕獲的其他異常，見表3。經(jīng)CMA驗(yàn)證，根據(jù)ACMG和ClinGen專家共識(shí)及臨床建議，4例判定為致病性變異，5例為疑似致病變異，5例意義未明。

表3 CMA與NIPT-plus結(jié)果不符合的2例胎兒情況

2.4 隨訪結(jié)果 19例NIPT-plus檢測(cè)提示MMS高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦拒絕產(chǎn)前診斷，隨訪胎兒結(jié)局：1例失訪，5 例選擇終止妊娠，其余13 例均胎兒正常。21 例NIPT-plus檢測(cè)結(jié)果高風(fēng)險(xiǎn)CMA正常的孕婦，隨訪胎兒發(fā)現(xiàn)均正常。

3 討論

目前，在臨床實(shí)踐中，染色體缺失和重復(fù)的產(chǎn)前診斷仍主要依賴于侵入性檢測(cè)手段。然而，隨著全基因組測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，NIPT技術(shù)現(xiàn)已被用于該領(lǐng)域的檢測(cè)工作。近幾年，NIPT-plus作為升級(jí)版的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查技術(shù)被推廣使用，它不僅可以篩查常見的染色體非整倍體，還可用于檢測(cè)其他染色體的非整倍體及MMS[4]。國(guó)際產(chǎn)前診斷協(xié)會(huì) （International Society for Prenatal Diagnosis, ISPD）和ACMG聯(lián)合聲明，NIPT-plus可用于對(duì)明確的MMS進(jìn)行研究性檢測(cè)，并適用于所有人群的產(chǎn)前篩查[5-6]。ACMG指南建議，孕婦應(yīng)進(jìn)行常規(guī)的MMS篩查，大樣本人群研究認(rèn)為胎兒的染色體MMS發(fā)生與孕婦的年齡無(wú)關(guān)，并且比非整倍體更常見[7]。本研究結(jié)果顯示在NIPT-plus檢出MMS高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦中，大于35歲的孕婦占44.45%，小于35歲的孕婦占55.55%，經(jīng)CMA確診MMS的孕婦中，大于35歲和小于35歲孕婦各占50%，提示MMS的發(fā)生與年齡無(wú)緊密關(guān)聯(lián)，與之前的報(bào)道一致。

近幾年，研究學(xué)者對(duì)NIPT-plus在MMS篩查中的應(yīng)用進(jìn)行了深入探討，但不同研究對(duì)NIPT-plus在篩查MMS的檢測(cè)準(zhǔn)確性的報(bào)道存在一定差異，PPV為40%～59%[8-11]。在2019年的一項(xiàng)研究中，LIANG 等[8]使用NIPT-plus對(duì)94 085例孕婦的外周血進(jìn)行非整倍體和全基因組MMS篩查，其結(jié)果顯示MMS的陽(yáng)性率為0.174%，PPV為40.8%（49/120）。2021年4 月[9]，第6屆胎兒醫(yī)學(xué)臨床基本技能培訓(xùn)班暨第2屆國(guó)際產(chǎn)前診斷協(xié)會(huì)培訓(xùn)課程公布了近30萬(wàn)例NIPTplus檢測(cè)的臨床隨訪數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)顯示，MMS的PPV為59%。在2022年的一項(xiàng)研究中，XUE等[10]使用NIPT-plus在31 256例單胎妊娠婦女中進(jìn)行了染色體微缺失和微重復(fù)的檢測(cè)，結(jié)果表明MMS的陽(yáng)性率為0.71%，PPV為55.56%（15/27）。2023年ZOU等[11]在江西省婦幼保健院針對(duì)23 116例行NIPT-plus檢測(cè)的樣本進(jìn)行了胎兒非整倍體和CNV的性能研究，結(jié)果顯示MMS的陽(yáng)性率為0.13%，PPV為50%（8/16）。本研究5 027例接受NIPT-plus檢測(cè)的孕婦中，有54例顯示為MMS高風(fēng)險(xiǎn)，陽(yáng)性率為1.07%，總體PPV為40%，這與文獻(xiàn)報(bào)道[8]中的數(shù)據(jù)相似。

NIPT-plus檢出16p13.11-p12.3區(qū)域2.7 MB缺失1 例，該區(qū)域涉及到12 個(gè)蛋白編碼基因，其中9個(gè)是OMIM相關(guān)基因，涉及16p13.11 recurrent microdeletion綜合征，到目前為止，已報(bào)告了超過(guò)100例16p13.11微缺失患者，缺失范圍從162 kB到5.5 MB[12-13]。HANNES等[14]使用BAC array CGH篩查了1 027 例智力低下和/或多發(fā)性先天性畸形患者，發(fā)現(xiàn)1例16p13.11缺失的患者進(jìn)行了三人組分析，結(jié)果顯示該缺失遺傳自表型正常的父親。其余存在16p13.11缺失的患者臨床表型多樣，并發(fā)現(xiàn)2 例產(chǎn)前診斷的胎兒均存在腦部結(jié)構(gòu)異常，其中1例為前腦無(wú)裂畸形，另1例為側(cè)腦室擴(kuò)張伴其他不同程度的先天畸形。該孕婦因?yàn)槟挲g高風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行NIPT-plus檢測(cè)，超聲結(jié)果未見異常，且缺失區(qū)域來(lái)源于表型正常孕婦，故孕婦選擇繼續(xù)妊娠，隨訪妊娠結(jié)局，胎兒未見異常，也提示16p13.11缺失可能會(huì)引起神經(jīng)異常表型，但也可能是神經(jīng)認(rèn)知疾病的易感位點(diǎn)，但在得出明確結(jié)論之前，致病性需要進(jìn)一步的研究。

另一方面，盡管NIPT-plus檢測(cè)可以顯著提高胎兒染色體異常的檢出率，但存在假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。在2017年柯瑋琳等[15]的報(bào)道中，14 235例中無(wú)創(chuàng)檢出15例MMS，其中2例為假陽(yáng)性結(jié)果。在2020年王梓茗等[16]的報(bào)道中，37 845無(wú)創(chuàng)檢出27例，其中7例為假陰性結(jié)果。本研究提示兩例NIPT-plus與CMA結(jié)果不符合，其中1例孕婦NIPT-plus檢測(cè)結(jié)果顯示4q34.1-q34.3區(qū)域缺失5.7 MB，但是CMA結(jié)果顯示1p36.21-p36.13區(qū)域重復(fù)1.32 MB，根據(jù)ACMG和ClinGen專家共識(shí)及臨床建議判定為臨床意義未明，隨訪孕婦選擇繼續(xù)妊娠，并生育一健康兒。另1例NIPT-plus顯示22q11.21區(qū)域重復(fù)2.4 MB，而CMA結(jié)果顯示22q11.21重復(fù)2.40 MB，Xp22.31缺失 1.63 MB，因Xp22.31缺失涉及STS綜合征，主要臨床表型為四肢、面、頸、軀干、臀部大面積鱗屑，部分患者可出現(xiàn)角膜渾濁、支氣管哮喘和性器官發(fā)育異常等癥狀，隨訪孕婦選擇終止妊娠。目前認(rèn)為NIPT-plus假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果的原因可能與母親的染色體異常，胎兒游離DNA比例過(guò)高或過(guò)低、母源性腫瘤、局限性胎盤嵌合（confined placental mosaicism, CPM）等有關(guān)[17]。其中，母親自身攜帶的拷貝數(shù)變異是造成假陽(yáng)性結(jié)果最常見原因[18]，建議采集NIPT-plus同時(shí)采集母親DNA進(jìn)行檢測(cè)，既可有效降低假陽(yáng)性的發(fā)生，又可明確遺傳性變異來(lái)源，本研究?jī)衫袐D不愿提供本人及配偶的血液，無(wú)法進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，故難以確定假陽(yáng)性結(jié)果是否來(lái)自母親。

總的來(lái)說(shuō)，NIPT-plus與常規(guī)NIPT檢測(cè)比較，可以發(fā)現(xiàn)更多的染色體微缺失微重復(fù)，NIPT-plus與產(chǎn)前診斷CMA在檢測(cè)MMS方面具有較高的一致性。NIPT-plus作為一種新的篩查技術(shù)，其檢測(cè)結(jié)果可以為臨床醫(yī)師和孕婦提供重要的參考，有助于識(shí)別高危孕婦，從而在妊娠期間和出生后提供更好的臨床管理。這對(duì)于預(yù)防出生缺陷、避免孕婦身心傷害、減輕家庭和社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)具有重要的意義。