張 梁 ，王保全 ，雷喜鋒 ，王 旭 ，柯 陽 ，張 瑋

（1）渭南市中心醫(yī)院普外科，陜西 渭南 714000;2）昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院肝膽胰外科，云南 昆明 650101）

過量飲酒會促進酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD），如脂肪變性、脂肪性肝炎、纖維化到肝硬化，最終導致肝細胞癌，這是所有慢性肝病的主要死亡原因[1-2]。在ALD 的發(fā)展進程中，肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）扮演者重要的角色。HSCs 是慢性肝損傷創(chuàng)面愈合相關(guān)纖維化過程的主要參與者之一[3-4]。在健康器官中，它們是非實質(zhì)細胞群的一部分，占據(jù)肝細胞和竇狀內(nèi)皮細胞之間的間隙[5]。在組織損傷、炎癥和伴隨的可溶性介質(zhì)（例如TGF-β）激活后，HSCs轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細胞樣細胞，表現(xiàn)出增殖、收縮和成纖維特性，成為纖維化肝臟中纖維性膠原的主要來源[4，6]。HSCs 還參與鄰近細胞的復雜交互，以促進肝纖維化進展。因此，闡明HSCs的分子調(diào)控機制對ALD 的治療具有重要的意義。

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一種由18～24 個核苷酸的組成的非編碼RNA，通常情況下，miRNA 在細胞質(zhì)RNA 誘導沉默復合體中與靶mRNA 的3'-UTR 相互作用以抑制mRNA 翻譯和誘導降解它[7-8]。具體來說，一些miRNA，如miR-122 和miR-21 已被證明在ALD 的肝纖維化的發(fā)展中發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)包括組織炎癥、細胞凋亡和HSCs 的激活等過程[9-10]。此外，由于miRNA 釋放到血液中的疾病依賴性以及它們在血清中的相對穩(wěn)定性，miRNA 是檢測ALD 嚴重程度和致癌性的潛在非侵襲性生物標志物[11]。近期，Zhang 等[12]通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，miR-29c-3p 在ALD 模型小鼠肝臟的表達水平顯著低于正常小鼠，且預測其為ALD 治療的潛在靶標。然而，目前還沒有文獻報道，miR-29c-3p 對ALD 中HSCs 活化，增殖和凋亡的調(diào)控機制。

綜上所述，本研究擬探討miR-29c-3p 在靜息和活化HSCs 中的表達差異，并且檢測其對HSCs 活化，增殖和凋亡的影響，此外，筆者還擬通過生物信息學方法預測miR-29c-3p 的下游靶標，并驗證miR-29c-3p 是否通過該靶標參與HSCs 生物學行為的調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 小鼠HSCs 的原代培養(yǎng)和鑒定

從C57BL/6 J 小鼠（24.0～26.0 g，8～10 周齡）中分離HSCs。簡而言之，C57BL/6 J 小鼠原位灌注四乙酸和膠原酶獲得全肝細胞懸液，用Percoll密度梯度離心法獲得HSCs。將細胞調(diào)整到3×106細胞/mL，接種在25 cm2的培養(yǎng)瓶中，其中含有包含10%胎牛血清的5mL DMEM 完全培養(yǎng)基和1%青霉素/鏈霉素。采用TGF-β 活化HSCs后，采用免疫熒光檢測HSCs 活化標志物ɑ-SMA的表達。簡而言之，HSCs 與一抗抗ɑ-SMA（1∶250）在4℃下孵育過夜，隨后用二抗染色。在400 倍放大的熒光顯微鏡下測量細胞ɑ-SMA熒光陽性表達的變化并收集圖像。

1.2 細胞分組及轉(zhuǎn)染

首先，為觀察miR-29c-3p 對HSCs 的影響，將細胞分為NC 組（未轉(zhuǎn)染）、NCmimic 組（轉(zhuǎn)染miRNAmimic 陰性對照）和miR-29c-3pmimic 組（轉(zhuǎn)染miR-29c-3pmimic）。為進一步觀察miR-494-3p 和IGF-1 對HSCs 的影響，將細胞分為NC 組（未轉(zhuǎn)染）、sh-NC 組（轉(zhuǎn)染sh-NC 陰性對照）、sh-IGF-1 組（轉(zhuǎn)染sh-IGF-1）和sh-IGF-1+miR-29c-3pinhibitor 組（同時轉(zhuǎn)染sh-IGF-1 和miR-29c-3pinhibitor）。miR-29c-3pmimic/inhibitor和sh-IGF-1，及它們對應(yīng)的陰性對照購買于廣州銳博生物技術(shù)有限公司。將HSCs 接種于6 孔板（5×104細胞/mL），按照說明書使用Lipofectamine 2000 試劑及分組信息，進行50 nM miR-29c-3p mimic/inhibitor/NCmimic/sh-IGF-1/sh-NC 的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h 后，采用RT-qPCR 和WB 檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerasechain reaction，RTqPCR）

使用TRIzol Regent 按照說明書提取HSCs 的總RNA 樣本，然后用TurboDNase 試劑盒去除DNA。用NanoDrop 對提取的總RNA 進行定量。用帶用gDNA Eraser 的PrimeScriptTM RT 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄將2 μg 總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBR Green PCR Master Mix 在Bio-Rad Real-Time PCR 儀上進行qPCR 檢測miR-29c-3p 的表達。采用U6 作為內(nèi)部參考。每個數(shù)據(jù)重復3 次，用2-ΔΔCt 法計算miR-29c-3p 的相對表達水平。本研究使用的引物如下：miR-29c-3p sense：5’-GCTGACCGATTTCTCCTGGT-3’ ；miR-29c-3p antisense：5’-TCCCCCTACATCATAACCGA-3’；U6 sense：5’-CTAGATAATGGTGCTGATAGATGGA-3’；U6 antisense：5’-GGCACACCAGAAATCGAAGC-3’。

1.4 免疫印跡實驗（western blot，WB）

使用RIPA 裂解緩沖液從HSCs 中提取總蛋白，使用BCA 蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳，將60 μg 總蛋白質(zhì)樣本進行分離后，轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。用5%脫脂牛奶進行阻斷，在4℃下用小鼠單克隆抗ɑ-SMA（1∶1 000），DDR2（1∶2 000），F(xiàn)N1（1∶1 000），ITGB1（1∶2 000）和GFAP（1∶1 000）孵育過夜。用TBST 清洗膜，然后與適當?shù)睦备^氧化物酶結(jié)合的二抗孵育。采用增強型化學發(fā)光試劑進行膜的顯影，并使用Image Lab?軟件捕獲信號并定量條帶灰度值。

1.5 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>

采用Starbase 數(shù)據(jù)庫預測IGF-1 和miR-29c-3p 的3’ UTR 結(jié)合序列。用PCR 分別擴增野生型和突變型IGF-1 與miR-29c-3p 的3’ UTR 結(jié)合序列，將片段裝入pMIR-REPORT luciferase microRNA expression reporter vector。參照Lipofectamine 2000試劑盒說明書，將0.1 μg 野生型和突變型的IGF-1 熒光素酶報告載體分別共轉(zhuǎn)染到帶有miR-29c-3pmimic 的HEK-293 細胞中。轉(zhuǎn)染48 h 時后，收集細胞裂解液，根據(jù)制造商的說明書，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測量各組的熒光素酶活性。

1.6 CCK-8 實驗

采用CCK-8 試劑盒檢測HSCs 的細胞活力。簡而言之，將5×104細胞/mL 的各組HSCs 加入96 孔板中孵育24 h。各組HSCs 轉(zhuǎn)染24、48 和72 h 后，分別在各孔加入CCK8 溶液。2 h 后，使用酶標儀測量450 nm 處的吸光度。

1.7 克隆形成實驗

各組HSCs（5×102細胞/mL）接種到含有37℃預熱培養(yǎng)基的6 孔板中，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d 更換一次培養(yǎng)基，放置14 d。隨后，各組HSCs 用1∶3 乙酸/甲醇固定30 min，用Giemsa染色20 min，肉眼計數(shù)細胞克隆數(shù)。

1.8 流式細胞術(shù)

采用Annexin V-FITC/PI 試劑盒檢測HSCs 凋亡情況。取1×Annexin V 結(jié)合液500 μL 制備終濃度為1×106細胞/mL 的HSC 懸液，加入6 孔板上。在細胞懸液中加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL 丙二碘，室溫暗培養(yǎng)15 min。流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況。壞死細胞位于左上區(qū)（AnnexinV-，PI+），晚期凋亡細胞位于右上區(qū)（AnnexinV+，PI+），活細胞位于左下區(qū)（AnnexinV-，PI-），早期凋亡細胞位于右上區(qū)（AnnexinV+，PI-）。

1.9 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)重復3 次獨立實驗，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，并通過SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析。根據(jù)數(shù)據(jù)組成，2 組間比較使用student’st檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（兩兩比較采用LSD 法），P＜ 0.05 為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HSCs 的分離及miR-29c-3p 表達差異

如圖1A 所示，ɑ-SMA 陽性表達表明成功從小鼠中分離出HSCs。TGF-β 處理細胞后，HSCs 活化相關(guān)蛋白ɑ-SMA，DDR2，F(xiàn)N1 和ITGB1 表達水平明顯增加，而GFAP 的表達水平則反之（P＜ 0.01，圖1B）。值得注意地，miR-29c-3p 在激活的HSCs 中呈現(xiàn)低表達（P＜ 0.01，圖1C）。以上結(jié)果表明，HSCs 被成功分離并激活，且miR-29c-3p 在不同狀態(tài)的HSCs 中異常表達。

圖1 成功分離HSCs，并且miR-29c-3p 在不同狀態(tài)的HSCs 中差異表達Fig.1 Successful isolation of HSCs and differential expression of miR-29c-3p in HSCs of different status.

2.2 miR-29c-3p 對HSCs 活化，增殖和凋亡的影響

由于miR-29c-3p 在HSCs 中的異常狀態(tài)，進一步探討了miR-29c-3p 對HSCs 活化，增殖和凋亡的影響。首先，通過miRNAmimic 外源性的調(diào)控了活化的HSCs 中miR-29c-3p 的表達。轉(zhuǎn)染效率結(jié)果表明，miR-29c-3p mimic 可以增加活化的HSCs 中miR-29c-3p 的表達水平（P＜ 0.001，圖2A）。WB 結(jié)果表明，過表達miR-29c-3p 能夠減低活化相關(guān)蛋白ɑ-SMA，DDR2，F(xiàn)N1 和ITGB1 表達水平，并增加GFAP 的表達（P＜ 0.01，圖2B）。相較于NCmimic 組，miR-29c-3pmimic組中活化HSCs 的增殖活力（P＜ 0.01，圖2C）和克隆形成數(shù)（P＜ 0.01，圖2D）均有降低，并且凋亡比例增加（P＜ 0.01，圖2E）。以上結(jié)果表明，miR-29c-3p 能夠抑制HSCs 的活化和增殖，并促進其凋亡。

圖2 miR-29c-3p 抑制HSCs 的活化和增殖，并促進其凋亡Fig.2 miR-29c-3p inhibits the activation and proliferation of HSCs and promotes their apoptosis.

2.3 miR-29c-3p 下游靶標預測及驗證

調(diào)控下游mRNA 的表達是miRNA 在生物學進程中的主要功能之一。因此，筆者通過Starbase 數(shù)據(jù)庫預測了miR-29c-3p 的下游可能靶標。如圖3A 所示，IGF-1 可能是miR-29c-3p 的下游靶標，并且通過雙熒光素酶報告基因檢測發(fā)現(xiàn)，miR-29c-3p mimic 能夠抑制細胞內(nèi)野生型IGF-1 的熒光素酶活性（P＜ 0.01），但是對突變型IGF-1 的熒光素酶活性無影響（P＞ 0.01）。進一步，通過WB 檢測了miR-29c-3p 對活化HSCs 中IGF-1 表達的影響。結(jié)果顯示，過表達miR-29c-3p 可抑制IGF-1 的表達（P＜ 0.01，圖3B），低表達miR-29c-3p 能促進活化HSCs 中IGF-1 表達（P＜0.01，圖3B）。以上結(jié)果表明，在HSCs 中，IGF-1 是miR-29c-3p 的下游靶標。

圖3 IGF-1 是miR-29c-3p 下游靶標mRNAFig.3 IGF-1 is a downstream target mRNA of miR-29c-3p.

2.4 miR-29c-3p 通過IGF1 對HSCs 活化，增殖和凋亡的影響

進一步探討了miR-29c-3p 是否是通過IGF1對HSCs 活化，增殖和凋亡產(chǎn)生影響的。結(jié)果表明，活化的HSCs 中轉(zhuǎn)染miR-29c-3pinhibitor 或sh-IGF-1 能夠降低miR-29c-3p 或IGF-1 的表達水平（P＜ 0.05，圖4A、圖4B）。回復實驗表明，相較于sh-NC 組，sh-IGF-1 組中活化相關(guān)蛋白ɑ-SMA，DDR2，F(xiàn)N1 和ITGB1 表達水平降低，并且GFAP 的表達增加（P＜ 0.05，圖4C）；相較于sh-IGF-1 組，sh-IGF-1+miR-29c-3pinhibitor組中活化相關(guān)蛋白ɑ-SMA，DDR2，F(xiàn)N1 和ITGB1表達水平增加，并且GFAP 的表達減少（P＜ 0.05，圖4C）。此外，敲低IGF-1 的表達能夠降低活化HSCs 的增殖活力（P＜ 0.01，圖4D）和克隆形成數(shù)（P＜ 0.01，圖4E），并且增加其凋亡水平（P＜0.001，圖4F），但是在此基礎(chǔ)上同時敲低miR-29c-3p 的表達則會逆轉(zhuǎn)這一過程。以上結(jié)果表明，IGF-1 能夠促進HSCs 的活化和增殖，并抑制其凋亡，這一功能被miR-29c-3p 靶向抑制。

圖4 miR-29c-3p 通過IGF-1 抑制HSCs 的活化和增殖，并促進其凋亡Fig.4 miR-29c-3p inhibits the activation and proliferation of HSCs and promotes their apoptosis through IGF-1.

3 討論

非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）及其晚期形式-非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）已成為一種代謝性流行病[2]。此前的生物信息學分析表明，miR-29c-3p 在ALD 患者血液中的表達水平顯著低于正常人群[12]，但是其功能還沒有在ALD 中得到驗證。在本研究中，筆者成功分離了小鼠中的HSCs，并且發(fā)現(xiàn)激活的HSCs 中miR-29c-3p 異常低表達。此外，筆者還發(fā)現(xiàn)，過表達miR-29c-3p 能夠抑制HSCs 的激活和增殖，并促進其凋亡。值得注意地，miR-29c-3p 的這一功能是通過靶向調(diào)控IGF-1 的表達實現(xiàn)的。這些結(jié)果證實了Yao 等[12]的預測，并為miR-29c-3p作為ALD 的治療靶標提供了理論基礎(chǔ)。

HSCs 活化是ALD 進程中肝纖維化的關(guān)鍵事件，也是肝臟細胞外基質(zhì)的主要來源之一，它們已被確定為主要負責肝臟纖維化發(fā)展的前體細胞類型[13]。肝損傷后，HSC 經(jīng)歷活化，導致典型的星形，脂肪儲存表型的喪失和肌成纖維母細胞樣表型的獲得[13-14]。因此，為了緩解ALD 的發(fā)展進程，如何抑制HSCs 的活化成為了主要目標之一。研究表明，ɑ-SMA，DDR2，F(xiàn)N1，ITGB1和GFAP 已成為研究做多的HSCs 活化標志物[15-16]。在筆者的研究中發(fā)現(xiàn)miR-29c-3pmimic 可以抑制ɑ-SMA，DDR2，F(xiàn)N1 和ITGB1，并促進HSCs中GFAP 的表達。這表明，過表達miR-29c-3p可以抑制HSCs 的活化，這對緩解ALD 的肝纖維化至關(guān)重要。此外，介導HSCs 增殖和凋亡對明晰ALD 的機制也是十分重要的。例如，Liang 等[17]表明，嘌呤信號通路調(diào)節(jié)HSCs 激活和增殖，這在ALD 中起著關(guān)鍵作用。研究表明，miRNA-150-5p 抑制HSCs 增殖，并在肝纖維化期間使HSCs凋亡敏感，這有利于緩解ALD 的肝纖維化進程[18]。本研究表明：miR-29c-3p 的過表達對HSCs 的增殖是有抑制作用的，并且促進HSCs 的凋亡。此外，Chen 等[19]表明，miR-29c-3p 通過激活ADH6 增強子促進酒精脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADHs）基因簇表達，而ADHs 在酒精代謝和酒精毒性中起著至關(guān)重要的作用，這或許是miR-29c-3p 調(diào)控HSCs 參與ALD 的機制之一。

眾所周知，miRNAs 通過介導下游靶標mRNA 的表達是參與調(diào)控多種生物學進程的主要途徑之一[20-21]。在本研究中，通過Starbase 數(shù)據(jù)庫預測發(fā)現(xiàn)IGF-1 是miR-29c-3p 的下游靶標之一，并通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M行了驗證。IGF-1 是一種70-氨基酸合成代謝激素，具有多種內(nèi)分泌，旁分泌和自分泌作用[22]。胰島素樣生長因子-1（Insulin-like growth factor-1,IGF-1）和IGF 結(jié)合蛋白（IGF-binding proteins,IGFBPs）在包括肝臟在內(nèi)的多種組織中產(chǎn)生，主要是對生長激素（growth hormone,GH）信號的反應(yīng)。肝臟合成的IGF-1 和 IGFBPs 占全身循環(huán) IGF-1 和 IGFBPs 的大部分[23]。眾所周知，IGF-1 主要由肝臟產(chǎn)生（占循環(huán)IGF-1 的75%），但幾乎每個組織都能夠分泌IGF-1 用于自分泌/旁分泌的目的[22-23]。此前的研究表明，IGF-1 是非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）/非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）治療的生物學靶標，IGF-I 可以調(diào)控細胞衰老和激活，從而介導NASH 中的肝纖維化[24-26]。IGF-I 治療已被證明可以改善NASH 和肝硬化的動物模型[27-28]，表明IGF-I 在這些條件下的潛在臨床應(yīng)用。在ALD 中，有研究表明，S-烯丙基巰半胱氨酸通過直接調(diào)節(jié)IGF-I 信號通路來改善ALD[29]。M?lle 等[30]表明，IGF-I 是ALD 患者的生存獨立預測因子。本研究中，HSCs 中轉(zhuǎn)染sh-IGF-1 能夠降低細胞活化和增殖，并上調(diào)其凋亡比例。但是，這一過程受miR-29c-3p 的調(diào)控。

綜上所述，筆者證明了miR-29c-3p 能夠通過靶向下調(diào)IGF-1 的表達水平，進而抑制HSCs活化和增殖，并促進其凋亡。本研究為AH 提供了新的治療策略。但是，本研究僅僅只在HSCs驗證了miR-29c-3p 的功能，體內(nèi)實驗驗證miR-29c-3p 在ALD 中的功能仍需進一步的挖掘。