彭煜航，李焱娟，曲婧紅，唐代歡，張宏偉，吳 睿，徐世蓮

（昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，云南 昆明 650500）

神經(jīng)病理性疼痛和炎癥痛是臨床常見的疼痛，但至今臨床鎮(zhèn)痛藥物療效并不理想，且具有明顯的藥物副作用，故尋找和開發(fā)新的鎮(zhèn)痛效果強(qiáng)而毒副作用小的鎮(zhèn)痛藥物具有重要意義。

甘丙肽是一種廣泛分布于哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周的重要的神經(jīng)肽[1]。研究報道甘丙肽可抑制炎癥介質(zhì)引起的機(jī)械超敏反應(yīng)[2]；對糖尿病外周神經(jīng)痛具有鎮(zhèn)痛作用[3]；在三叉神經(jīng)損傷后的神經(jīng)痛和神經(jīng)再生中也有重要作用[4]。本實驗通過大鼠足底皮下注射鹿角菜堿制作炎癥痛動物模型和左側(cè)坐骨神經(jīng)結(jié)扎制作神經(jīng)痛動物模型，研究甘丙肽對不同動物模型的鎮(zhèn)痛作用。

隨著甘丙肽受體激動劑和拮抗劑的開發(fā)和應(yīng)用，越來越多的研究報道甘丙肽對痛覺的調(diào)節(jié)作用可能是通過激活其受體來完成的[5-7]。甘丙肽有3 種受體，分別是甘丙肽受體1-3（galanin receptor 1-3，GalR1-3）[8]。本實驗通過比較甘丙肽對正常大鼠、炎癥痛大鼠和神經(jīng)痛大鼠不同動物模型的鎮(zhèn)痛作用；并檢測不同模型大鼠GalRs的表達(dá)，探索甘丙肽對痛覺信息的調(diào)節(jié)作用是否通過甘丙肽受體的激活來完成。

伏核可分為核與殼兩部分，每側(cè)大腦半球各有一個。早在1999 年，Gear 等[9]研究報道伏核是一個參與痛覺調(diào)節(jié)的重要的中樞核團(tuán)。Watanabe 等[10]報道伏核內(nèi)灌注乙酰天冬氨酸可明顯減輕光刺激誘發(fā)的感覺神經(jīng)損傷引起的疼痛。最近的研究報道神經(jīng)痛大鼠伏核組織甘丙肽的表達(dá)上調(diào)[11]。本實驗研究不同大鼠模型伏核微量注射甘丙肽的鎮(zhèn)痛作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1 實驗動物 SD 大鼠43 只：170～220 g，雄性，昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部提供。實驗期間大鼠自由飲水、自由進(jìn)食，分籠飼養(yǎng)、自然光照、室溫保持在22 ℃左右。所有實驗操作嚴(yán)格按照國際疼痛協(xié)會和昆明醫(yī)科大學(xué)倫理委員會的規(guī)定執(zhí)行。

1.1.2 實驗試劑和儀器 甘丙肽（rat galanin，Tocris，UK）、Anti-GalR1（Thermo，美國）、Anti-GalR2（Abcam，英國）、Anti-GAPDH（CST，美國）。熱板智能儀（Hot plate，YLS-6B，中國）、Randall-Selitto 痛覺測試儀（UGO Basile，37215，意大利）。

1.2 研究方法

1.2.1 痛覺行為學(xué)檢測 大鼠對傷害性熱刺激誘發(fā)的后爪縮爪潛伏期（hind-paw withdrawal latency，HWL）使用熱板智能儀測定，熱板溫度保持在（52±0.2）℃。對機(jī)械壓力刺激誘發(fā)的后爪縮爪閾值（hind-paw withdrawal threshold，HWT）使 用Randall-Selitto 痛覺測試儀測定。

實驗前對大鼠進(jìn)行5 d 的訓(xùn)練，使大鼠HWL和HWT 較為穩(wěn)定，以減少實驗誤差。

1.2.2 動物模型的建立 實驗采用鹿角菜堿制作炎癥痛模型。在實驗當(dāng)天，將2%的鹿角菜堿0.1 mL 注射到大鼠左側(cè)后爪足底皮下。鹿角菜堿注射3～4 h 之間，大鼠痛敏達(dá)到高峰。

采用坐骨神經(jīng)干部分結(jié)扎（chronic constriction injury，CCI）的方法制作神經(jīng)痛動物模型。大鼠麻醉用戊巴比妥鈉（50 mg/kg，腹腔注射）后，游離左側(cè)約1 cm 長的坐骨神經(jīng)大腿段，輕度結(jié)扎神經(jīng)（4 號羊腸線），共結(jié)扎4 圈，每圈之間間隔約1 mm。

1.2.3 伏核埋管 麻醉后，將大鼠固定在腦立體定位儀上。根據(jù)大鼠的腦定位圖譜（B，+1.7 mm；L or R，1.6 mm；V，7.0 mm），將事先準(zhǔn)備好的不銹鋼套管（外徑為0.8 mm）放置于伏核內(nèi)，并使用牙托粉固定套管。術(shù)后大鼠恢復(fù)2～3 d。

1.2.4 伏核微量注射 實驗當(dāng)天進(jìn)行伏核內(nèi)微量注射，注射管為外徑0.4 mm 的不銹鋼管。

實驗分為生理鹽水對照組（n=8）、正常組（n=8）、炎癥痛組（n=8）和CCI 組（n=7），生理鹽水對照組大鼠伏核注射1 μL 生理鹽水；正常組大鼠伏核注射1 nmol 的甘丙肽1 μL；炎癥痛給藥組大鼠在致炎3 h 伏核注射1 nmol 的甘丙肽1 μL；CCI 給藥組大鼠在坐骨神經(jīng)結(jié)扎第14 天伏核注射1 nmol 的甘丙肽1 μL。

注射前，需測量雙側(cè)HWL 和HWT 作為基礎(chǔ)值，在甘丙肽注射5、10、15、20、30、45、60 min 后分別測量各組大鼠雙側(cè)的HWL 和HWT，計算給藥后變化百分率，即：

實驗結(jié)束后對伏核注射位點進(jìn)行組織學(xué)鑒定（圖1），鑒定結(jié)果顯示注射位點位于伏核的數(shù)據(jù)方可納入統(tǒng)計。

圖1 伏核注射位點鑒定圖Fig.1 Illustration of the location of the injection needle tips

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法（western blot，WB）大鼠用4%的異氟醚麻醉后，迅速取雙側(cè)伏核組織。WB 法檢測GalR1（1∶500）和GalR2（1∶500）的表達(dá)。以 GAPDH（1∶10 000）作為內(nèi)參，蛋白表達(dá)條帶使用Image J 軟件分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用Prism6 軟件分析。組間差異采用重復(fù)測量雙因素方差分析或單因素方差分析進(jìn)行比較。檢驗標(biāo)準(zhǔn)為α=0.05，P＜ 0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甘丙肽對正常大鼠、炎癥痛大鼠和神經(jīng)痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用

和生理鹽水對照組比較，伏核注射甘丙肽引起正常組（左：F=5.76，P＜ 0.05；右：F=10.66，P＜ 0.01）、炎癥痛組（左：F=54.94，P＜ 0.001；右：F=37.92，P＜ 0.001）和CCI 組（左：F=68.13，P＜ 0.001；右：F=33.90，P＜ 0.001）大鼠雙側(cè)HWL 延長，并且正常組（左：F=26.20，P＜ 0.001；右：F=13.71，P＜ 0.01）、炎癥痛組（左：F=5.51，P＜ 0.001；右：F=21.94，P＜ 0.001）和CCI 組（左：F=79.63，P＜ 0.001；右：F=30.03，P＜ 0.001）大鼠雙側(cè)HWT 也延長。表明伏核注射甘丙肽對正常大鼠、炎癥痛大鼠和神經(jīng)痛大鼠都有鎮(zhèn)痛作用，在注射甘丙肽10 min 時鎮(zhèn)痛作用達(dá)到高峰，見圖2。

2.2 甘丙肽對正常大鼠、炎癥痛大鼠和神經(jīng)痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用比較

以上結(jié)果顯示，在伏核注射甘丙肽后10 min鎮(zhèn)痛作用達(dá)最高峰。比較3 組大鼠在伏核注射甘丙肽10 min 時的HWL 和HWT，結(jié)果顯示和正常組比較，炎癥痛組（左：q=4.45，P＜ 0.05；右：q=5.00，P＜ 0.05）和CCI 組（左：q=4.95，P＜0.05；右：q=4.52，P＜ 0.05）的雙側(cè)HWL 延長。炎癥痛組（左：q=5.89，P＜ 0.01；右：q=4.96，P＜ 0.05）和CCI 組（左：q=7.98，P＜ 0.001；右：q=6.82，P＜ 0.001）的雙側(cè)HWT 也延長，表明伏核注射甘丙肽對炎癥痛鼠和神經(jīng)痛鼠的鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)于正常鼠的。但比較炎癥痛鼠和CCI 鼠的HWL（左：q=0.65，P＞ 0.05；右：q=0.31，P＞0.05）和HWT（左：q=2.3，P＞ 0.05；右：q=2.02，P＞ 0.05）差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3，提示致炎或神經(jīng)損傷可能引起GalRs 的表達(dá)增加，甘丙肽通過和其受體結(jié)合完成鎮(zhèn)痛作用。

圖3 甘丙肽對正常大鼠、炎癥痛大鼠和神經(jīng)痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用比較Fig.3 Comparison of analgesic effects of galanin on native,inflammatory and CCI rats

2.3 炎癥痛和神經(jīng)痛對伏核神經(jīng)細(xì)胞GalRs 表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步驗證甘丙肽是否通過和其受體結(jié)合對大鼠具有鎮(zhèn)痛作用。取正常組（n=4）、炎癥痛組（致炎3 h，n=4）和神經(jīng)痛組（CCI 第14 天，n=4）大鼠的伏核組織，WB 檢測3 組大鼠伏核神經(jīng)元GalR1 和GalR2 的表達(dá)。結(jié)果顯示，和正常組比較，炎癥痛大鼠伏核神經(jīng)元GalR1（q=10.61，P＜ 0.001）和GalR2（q=5.47，P＜ 0.05）的表達(dá)增加。和正常組比較，CCI 大鼠伏核神經(jīng)元GalR1（q=12.47，P＜ 0.001）和GalR2（q=4.95，P＜0.05））的表達(dá)也增加。該結(jié)果表明致炎或神經(jīng)損傷引起GalR1 和GalR2 的表達(dá)增加，但比較炎癥痛大鼠和CCI 大鼠的GalR1（q=1.86，P＞ 0.05）和GalR2（q=0.53，P＞ 0.05），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05），見圖4。

圖4 正常大鼠、炎癥痛大鼠和神經(jīng)痛大鼠 GalR1 和GalR2 的表達(dá)Fig.4 Expression of GalR1 and GalR2 in native,inflammatory and CCI rats

3 討論

腦內(nèi)與痛覺相關(guān)的中樞部位檢測到甘丙肽的表達(dá)，提示甘丙肽在痛覺的產(chǎn)生和傳導(dǎo)中起到重要作用[5]。Zhang 等[12-13]報道前扣帶回（Anterior cingulate cortex）注射甘丙肽對炎癥痛大鼠和神經(jīng)痛大鼠具有鎮(zhèn)痛作用。Li 等[14]報道中央杏仁核（Central nucleus of amygdala）注射甘丙肽對正常大鼠和神經(jīng)痛大鼠具有鎮(zhèn)痛作用。本實驗選取正常大鼠、炎癥痛大鼠和神經(jīng)痛大鼠不同動物模型，伏核注射相同劑量的甘丙肽，結(jié)果顯示甘丙肽引起3 組大鼠雙側(cè)HWL 和HWT 都延長（圖2），提示伏核注射甘丙肽對正常大鼠、炎癥痛大鼠和神經(jīng)痛大鼠都具有鎮(zhèn)痛作用。并且比較甘丙肽對不同大鼠的鎮(zhèn)痛作用，結(jié)果顯示甘丙肽對炎癥痛大鼠和神經(jīng)痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)于對正常大鼠的鎮(zhèn)痛作用（圖3），提示在炎癥和神經(jīng)損傷過程中，GalRs 的表達(dá)可能上調(diào)，甘丙肽可能是通過激活其受體，從而抑制痛覺信息的傳導(dǎo)。

伏核是腦內(nèi)調(diào)節(jié)痛覺的最重要的核團(tuán)之一。大鼠伏核內(nèi)注射降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）具有鎮(zhèn)痛作用[15]。本實驗選取正常大鼠、炎癥痛大鼠和神經(jīng)痛大鼠不同動物模型，伏核內(nèi)注射相同劑量的甘丙肽，結(jié)果顯示甘丙肽引起3 組大鼠雙側(cè)HWL 和HWT 都延長，見圖2。提示伏核注射甘丙肽對正常大鼠、炎癥痛大鼠和神經(jīng)痛大鼠都具有鎮(zhèn)痛作用。

既往研究報道，甘丙肽通過激活一種或幾種甘丙肽受體而發(fā)揮作用[16]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)已經(jīng)檢測到甘丙肽與其受體的結(jié)合[17]。為了研究甘丙肽在伏核對痛覺信息的抑制作用是否通過激活甘丙肽受體來完成，本實驗首先比較伏核注射相同劑量的甘丙肽10 min 后對不同大鼠模型的鎮(zhèn)痛作用，結(jié)果顯示甘丙肽對炎癥痛大鼠和神經(jīng)痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)于對正常大鼠的鎮(zhèn)痛作用，見圖3。這一結(jié)果提示在炎癥和神經(jīng)損傷過程中，GalRs的表達(dá)可能上調(diào)，甘丙肽通過和受體結(jié)合完成鎮(zhèn)痛作用，因而對炎癥痛和神經(jīng)痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)于對正常大鼠的鎮(zhèn)痛作用。

GalRs 屬于G 蛋白耦聯(lián)受體[18]。先前的研究也報道在一些痛覺過敏的狀態(tài)下，比如神經(jīng)損傷，甘丙肽和其受體的表達(dá)都是增加的[13,19]。Xu 等[20]報道坐骨神經(jīng)損傷引起脊髓背根神經(jīng)節(jié)GalR1 的表達(dá)下調(diào)；但在脊髓，GalR1 的表達(dá)是上調(diào)的；GalR2 的表達(dá)則在脊髓背根神經(jīng)節(jié)和脊髓神經(jīng)細(xì)胞都是上調(diào)的。Zhang 等[11]報道伏核注射GalRs的共同阻斷劑Galantide 能阻斷甘丙肽對神經(jīng)痛的鎮(zhèn)痛作用；而伏核內(nèi)微量注射GalR1 的特異性激動劑M617 對神經(jīng)痛大鼠具有鎮(zhèn)痛作用[7]；在CCI 大鼠[21]和炎癥痛大鼠[22]伏核內(nèi)注射GalR2的特異性激動劑M1145 也具有鎮(zhèn)痛作用。這些研究都提示在痛敏狀態(tài)下可能腦內(nèi)GalRs 激活，從而抑制痛覺信息的產(chǎn)生而具有鎮(zhèn)痛作用。本實驗檢測正常大鼠、炎癥痛和神經(jīng)痛大鼠3 種不同動物模型的伏核神經(jīng)細(xì)胞GalR1 和GalR2 的表達(dá)，結(jié)果顯示和正常組大鼠比較，炎癥痛和神經(jīng)痛大鼠GalR1 和GalR2 的表達(dá)上調(diào)，見圖4，進(jìn)一步表明在炎癥和神經(jīng)損傷過程中，神經(jīng)細(xì)胞GalR1和GalR2 被激活。本實驗未能檢測到伏核神經(jīng)細(xì)胞GalR3 的表達(dá)。

綜上所述，伏核注射甘丙肽對炎癥痛和神經(jīng)痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)于對正常大鼠的鎮(zhèn)痛作用；在炎癥和神經(jīng)損傷過程中，伏核神經(jīng)元GalR1 和GalR2 的表達(dá)增加。這些結(jié)果表明甘丙肽通過和其受體結(jié)合完成鎮(zhèn)痛作用。隨著對甘丙肽鎮(zhèn)痛作用及其機(jī)制的深入研究，甘丙肽及其受體激動劑可望成為臨床治療疼痛的新型鎮(zhèn)痛藥物。