勞錦程,李佳洋,譚洪新,2,3,劉文暢,2,3,羅國(guó)芝,2,3

(1 上海海洋大學(xué)上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心,上海 201306;2 上海市水產(chǎn)動(dòng)物良種創(chuàng)制與綠色養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心,上海 201306;3 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,上海 201306)

近年來,隨著集約化養(yǎng)殖的快速發(fā)展,高密度養(yǎng)殖過程中病害頻發(fā),對(duì)健康綠色養(yǎng)殖和穩(wěn)定持續(xù)發(fā)展造成了巨大的威脅[1]?；【鳛樗w中最常見的致病細(xì)菌[2],對(duì)規(guī)?；a(chǎn)養(yǎng)殖的危害非常嚴(yán)重[3]。中草藥取自于自然界,無化學(xué)添加、副作用相對(duì)較小[4],在水產(chǎn)動(dòng)物疾病防治[5]和提高養(yǎng)殖動(dòng)物生長(zhǎng)[6]、消化[7]、免疫[8]和抗病[9]能力等方面起到良好的作用。黃連作為一種廣譜性殺菌抑菌中草藥,對(duì)多種水產(chǎn)致病菌具有抑制作用[10],其中對(duì)副溶血弧菌、溶藻弧菌、嗜水氣單胞菌均有明顯的抑制作用[11]。已有相關(guān)研究在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中添加了黃連根須[12]、黃連素[7],但僅局限于清水養(yǎng)殖環(huán)境。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用生物絮凝技術(shù)(Biofloc Technology,BFT) 正在國(guó)內(nèi)外各地研究、實(shí)踐并逐步推廣[13]。除絮團(tuán)微生物進(jìn)行的同化作用外,硝化過程被證明也是BFT系統(tǒng)中氨氮的主要轉(zhuǎn)化途徑之一[14],原理是氨氧化微生物在氨單加氧酶(Ammonia Monooxygenase,AMO)催化下將氨氧化成羥氨之后,在羥氨氧化還原酶(Hydroxylamine Oxidereductase,HAO)作用下被氧化為亞硝酸鹽氮,最后亞硝酸鹽氮氧化細(xì)菌通過亞硝酸鹽氧化還原酶(Nitrite Oxidereductase,NOR)將亞硝酸鹽氮氧化為硝酸鹽[15]。在生物絮團(tuán)處理有機(jī)物時(shí),脫氫酶(Dehydrogenase,DHO)是微生物降解有機(jī)物的必需酶[16]。因此脫氫酶活性的高低反映了生物絮團(tuán)中微生物的數(shù)量和對(duì)養(yǎng)殖固體廢棄物的分解能力?，F(xiàn)階段中草藥對(duì)生物絮團(tuán)微生物的影響相關(guān)研究較少,在BFT系統(tǒng)中氨氮的主要轉(zhuǎn)化途徑之一是絮團(tuán)微生物進(jìn)行的硝化過程[17],這一過程可能會(huì)受黃連等藥物的影響。

本研究在生物絮團(tuán)中添加不同濃度的中草藥黃連添加劑,確定中草藥黃連添加劑對(duì)生物絮凝系統(tǒng)氨氮處理效率的影響,為中草藥在生物絮團(tuán)養(yǎng)殖模式中的推廣應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 生物絮團(tuán)裝置

試驗(yàn)共用12個(gè)容積為10 L的聚乙烯透明水桶作為絮團(tuán)培養(yǎng)桶,每6個(gè)桶采用1臺(tái)羅茨鼓風(fēng)機(jī)(功率750 W,森森集團(tuán)股份有限公司)進(jìn)行曝氣(圖1)。

圖1 本研究設(shè)備示意圖

生物絮團(tuán)采用上海海洋大學(xué)養(yǎng)殖技術(shù)與工程實(shí)驗(yàn)室具有良好硝化性能的成熟生物絮團(tuán)[18],該生物絮團(tuán)用魚用膨化配合飼料(通威股份公司)培養(yǎng),培養(yǎng)時(shí)間43 d,所用飼料含28%粗蛋白、12%粗纖維、5%粗脂肪、15%粗灰分、0.6%總磷以及12.5%水分。采用透明硅膠軟管(內(nèi)徑5 mm,外徑7 mm)搭配大馬蹄氣石進(jìn)行曝氣。絮團(tuán)培養(yǎng)時(shí)以葡萄糖(C6H12O6)為碳源,采用碳酸氫鈉(NaHCO3,總堿度99.0%～100.5%,桐柏博源新型化工有限公司生產(chǎn))進(jìn)行調(diào)節(jié)堿度。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

中草藥提取液制備:黃連購(gòu)自當(dāng)?shù)厮幉牡?將黃連洗凈后于60℃恒溫干燥箱中烘至恒重,取50 g,放到洗凈的燒杯中,加500 mL水,浸泡3 h以后煎煮,煮沸后文火保溫30 min;然后將濾液移至錐形瓶,重復(fù)煎煮3次,合并濾液后濃縮至生藥含量1 000 mg/mL,調(diào)pH至中性,置于4 ℃冰箱保存待用[19]。

2 試驗(yàn)指標(biāo)與檢測(cè)方法

2.1 水質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

2.2 氨氮、亞硝酸鹽氮去除率計(jì)算

STAN=(C1-C2)/(T×t)

(1)

SN=(C1-C2)/(T×t)

(2)

2.3 絮團(tuán)采樣及檢測(cè)方法

錐形瓶試驗(yàn)結(jié)束時(shí),每個(gè)10 L水桶取50 mL絮團(tuán),經(jīng)高溫滅菌的0.22 μm醋酸纖維濾膜過濾,將濾膜折疊放入滅菌離心管,置于-20℃冰箱存放待測(cè)。絮團(tuán)的氨單加氧酶(AMO),羥氨氧化還原酶(HAO),亞硝酸鹽氮氧化還原酶(NOR)和脫氫酶(DHO)含量的測(cè)定均采用ELISA試劑盒(上海哈靈生物科技有限公司)測(cè)定。

2.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì),采用Origin 8.5軟件進(jìn)行插圖繪制。試驗(yàn)數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)形式表示,采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA 單因素方差分析,P<0.05為差異性顯著。

3 結(jié)果

3.1 試驗(yàn)前初始水質(zhì)指標(biāo)

表1 各處理組主要水質(zhì)指標(biāo)

3.2 添加黃連前后TSS含量

如圖2所示,發(fā)現(xiàn)添加黃連會(huì)使BFT系統(tǒng)水體中TSS質(zhì)量濃度降低。初始未添加黃連狀態(tài)下,各組之間不存在顯著性差異(P>0.05);經(jīng)添加黃連處理后,處理組的TSS含量均顯著低于對(duì)照組,其中T3組又顯著低于其余組(P<0.05)。

注:C組(0 g/L)、T1組(2 g/L)、T2組(4 g/L)、T3組(6 g/L),下同

3.3 氨氮和亞硝酸鹽氮濃度

如圖3所示,添加黃連處理組的TAN最終質(zhì)量濃度均低于C組,T2組最低。

圖3 各組總氨氮快速轉(zhuǎn)化試驗(yàn)動(dòng)態(tài)變化圖

表2 各組生物絮團(tuán)氨氮、亞硝酸鹽氮去除速率

圖4 各組亞硝酸鹽氮快速轉(zhuǎn)化試驗(yàn)動(dòng)態(tài)變化圖

3.4 生物絮團(tuán)酶活指標(biāo)

在絮團(tuán)中添加黃連,氨單加氧酶(AMO)、羥胺氧化還原酶(HAO)及亞硝酸鹽氮氧化還原酶(NOR)活性均有升高的趨勢(shì)(圖5)。其中,T2組的AMO、NOR質(zhì)量濃度顯著大于C組(P<0.05),T2和T3組的HAO濃度顯著大于C組(P<0.05)。

圖5 各組生物絮團(tuán)中AMO(a)、HAO(b)、NOR(c)和DHO(d)的含量

在絮團(tuán)中添加黃連,脫氫酶(DHO)活性均有先升高的趨勢(shì)(圖5)。其中,僅T3組顯著大于C組(P<0.05)。

4 討論

4.1 黃連對(duì)水質(zhì)變化的影響

氨氮和亞硝酸鹽氮是水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中主要的代謝廢物[26],高濃度的氨氮與亞硝酸鹽氮會(huì)對(duì)養(yǎng)殖對(duì)象產(chǎn)生毒害作用,在養(yǎng)殖活動(dòng)開始前有必要將生物絮團(tuán)系統(tǒng)中的氨氮與亞硝酸鹽氮降至低水平[27]。試驗(yàn)結(jié)果顯示,在生物絮團(tuán)中添加黃連,可加快氨氮降至低水平(圖3),這與王洛洋等[28]的研究結(jié)果一致,中草藥對(duì)減少水中氨氮含量有積極作用,在生物絮團(tuán)中添加黃連不會(huì)引起水質(zhì)的惡化,還能加快降低氨氮質(zhì)量濃度(表2)。試驗(yàn)結(jié)果表明,在生物絮團(tuán)中添加黃連對(duì)亞硝酸鹽氮的去除有影響(圖4),且與黃連的用量有關(guān),當(dāng)添加量到6 g/L時(shí)會(huì)抑制亞硝酸鹽氮的轉(zhuǎn)化過程(表2)。在添加黃連素養(yǎng)殖草魚[8]、團(tuán)頭魴、大口黑鱸[7]和日本蟳[9]等水產(chǎn)動(dòng)物的研究中并未見因添加黃連素導(dǎo)致水質(zhì)惡化的報(bào)道。結(jié)合絮團(tuán)硝化酶測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn),添加黃連能提高絮團(tuán)硝化酶活性,而絮團(tuán)在水質(zhì)處理能力方面,硝化酶是氨氮轉(zhuǎn)化途徑中的關(guān)鍵酶,硝化酶活性的強(qiáng)弱是絮團(tuán)微生物氨氮處理能力強(qiáng)弱的關(guān)鍵[29]。本研究表明,在生物絮團(tuán)中添加適宜濃度的黃連能加快降低氨氮、亞硝酸鹽氮濃度,提高絮團(tuán)的氨氮處理效率,對(duì)BFT系統(tǒng)水質(zhì)的穩(wěn)定具有積極作用。

4.2 黃連對(duì)生物絮團(tuán)硝化性能的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示在絮團(tuán)中添加黃連能夠提高AMO和HAO活性(圖5)。有關(guān)研究表明在BFT系統(tǒng)中氨氮的主要轉(zhuǎn)化途徑之一是絮團(tuán)微生物進(jìn)行的硝化過程[17],原理是氨氧化微生物在AMO催化下將氨氧化成羥氨之后,在HAO作用下被氧化為亞硝酸鹽氮[29],本試驗(yàn)中經(jīng)黃連處理后的絮團(tuán)能更快地將氨氮氧化為亞硝酸鹽氮;并且試驗(yàn)結(jié)果表明在絮團(tuán)中添加黃連能夠提高NOR活性(圖5)。有關(guān)研究表明亞硝酸鹽氮氧化細(xì)菌通過NOR將亞硝酸鹽氮氧化為硝酸鹽氮[29],本試驗(yàn)中經(jīng)黃連處理后的絮團(tuán)NOR活性增強(qiáng),能更快地將亞硝酸鹽氮氧化為硝酸鹽氮。這可能是添加黃連抑制了絮團(tuán)中的部分有害菌,使水體環(huán)境更利于硝化細(xì)菌生長(zhǎng),從而提升了絮團(tuán)的硝化性能。

4.3 黃連對(duì)TSS的影響

TSS常用來衡量水體中固體有機(jī)顆粒物的含量[30]。本研究結(jié)果顯示,添加黃連組的TSS均低于未添加組(圖2),并且呈現(xiàn)出隨添加濃度的增加而降低的趨勢(shì),說明添加黃連后,水體中固體有機(jī)顆粒物含量降低。這可能是因?yàn)樘砑狱S連后,絮團(tuán)DHO活性提高導(dǎo)致的。在生物絮團(tuán)處理利用有機(jī)物時(shí),脫氫酶(DHO)是微生物降解利用有機(jī)物的必需酶,脫氫酶活性反映了生物絮團(tuán)中微生物的數(shù)量和對(duì)養(yǎng)殖固體廢棄物的分解能力[16]。添加黃連組的DHO含量均高于未添加組(圖5),并且呈現(xiàn)出隨添加濃度的增加而升高的趨勢(shì),這說明添加黃連能提高生物絮團(tuán)對(duì)養(yǎng)殖固體廢棄物的處理能力,加快對(duì)BFT系統(tǒng)水體中殘飼糞便的降解。結(jié)合TSS與DHO的變化趨勢(shì),可以看出添加黃連能提高絮團(tuán)微生物DHO活性,提高了對(duì)水體中固體有機(jī)顆粒物的降解水平,從而降低了BFT系統(tǒng)水體中TSS。過高的TSS會(huì)對(duì)養(yǎng)殖生物產(chǎn)生脅迫,研究表明,當(dāng)TSS濃度較高時(shí),短蓋肥脂鯉幼魚生長(zhǎng)減少,紅細(xì)胞值改變,鰓形態(tài)受到影響,當(dāng)系統(tǒng)中維持低水平TSS可以激活鰓內(nèi)固有的非特異性免疫反應(yīng),減少寄生蟲的存在[31]。Liu等[32]發(fā)現(xiàn),TSS低于300 mg/L有利于凡納濱對(duì)蝦無節(jié)幼體的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)中添加黃連能減少BFT系統(tǒng)水體中TSS的積累,在養(yǎng)殖過程中能減少TSS對(duì)養(yǎng)殖生物的脅迫,特別是在養(yǎng)殖對(duì)象幼體培養(yǎng)階段。

5 結(jié)論

中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用現(xiàn)階段大多局限于清水養(yǎng)殖模式,本研究在生物絮團(tuán)中添加黃連,發(fā)現(xiàn)適宜添加量的黃連能夠提高絮團(tuán)去除氨氮、亞硝酸鹽氮的效率,能夠提高生物絮團(tuán)硝化酶活性,對(duì)生物絮團(tuán)水處理能力無負(fù)面影響,以4 g/L的添加量最佳;試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)添加黃連能夠顯著降低生物絮團(tuán)系統(tǒng)水體中TSS含量,提高絮團(tuán)對(duì)水體中養(yǎng)殖固體顆粒物的降解能力,減緩水體中TSS的積累,防止過高TSS對(duì)養(yǎng)殖對(duì)象造成脅迫。應(yīng)進(jìn)一步研究黃連對(duì)生物絮團(tuán)抑菌能力及應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)對(duì)養(yǎng)殖對(duì)象產(chǎn)生的影響。