張煒崧,王 漢,孫 鵬,桑子淇,劉玉茹,葉 桐,劉鐵軍

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130117;2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所,北京 100700;3.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春 130021)

肝衰竭是多種因素引起的嚴(yán)重肝臟損害,導(dǎo)致合成、解毒、代謝和生物轉(zhuǎn)化功能嚴(yán)重障礙或失代償,出現(xiàn)以黃疸、凝血功能障礙、肝腎綜合征、肝性腦病、腹水等為主要表現(xiàn)的一組臨床癥候群[1]。肝衰竭病因其多樣性,臨床表現(xiàn)復(fù)雜,病死率極高,因此臨床診治難度大[2]。近10年來,國(guó)內(nèi)關(guān)于重型肝炎、肝衰竭的中醫(yī)證候規(guī)律、中西醫(yī)結(jié)合治療的研究日趨增多,中西醫(yī)結(jié)合治療能夠提高患者的生存率,在改善癥狀等方面也有較好的療效[3]。

肝衰竭屬于中醫(yī)“急黃”“瘟黃”等范疇,《諸病源候論·黃病諸侯》中記載:“脾胃有熱,谷氣郁蒸,因?yàn)闊岫舅?故卒然發(fā)黃,心滿氣喘,命在頃刻,故云急黃也。”急黃(或瘟黃)在發(fā)病過程中可出現(xiàn)血證、鼓脹、肝厥等,病機(jī)上多屬于“正虛邪實(shí)”,其基本病機(jī)集中在濕、熱、毒、瘀、虛等幾方面[3]。金匱腎氣丸記載于張仲景的《金匱要略》,其方由熟地黃、附子、桂枝、山藥、山茱萸、茯苓、牡丹皮、澤瀉諸藥組成,主要功效為溫補(bǔ)腎陽、化氣行水、滋陰化瘀。臨床實(shí)踐表明,金匱腎氣丸不僅能減少腹水,還可降低黃疸、提升血中白蛋白濃度、改善凝血功能,廣泛應(yīng)用于治療肝衰竭[4-10]。鑒于中藥多成分、多靶點(diǎn)等原因,目前金匱腎氣丸治療肝衰竭的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)出發(fā),篩選金匱腎氣丸的主要活性成分及作用靶點(diǎn),挖掘臨床患者肝衰竭已知的疾病靶點(diǎn),根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治黾靶盘?hào)通路富集分析金匱腎氣丸治療肝衰竭的潛在作用機(jī)制,為金匱腎氣丸治療肝衰竭的進(jìn)一步探索提供參考。

1 材料與方法

1.1 金匱腎氣丸靶點(diǎn)預(yù)測(cè)和篩選

通過文獻(xiàn)及TCMSP平臺(tái)中篩選出8味中藥的活性成分(滿足OB≥30%且DL≥0.18)及相應(yīng)的靶點(diǎn)。從PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索文獻(xiàn)中收集的化學(xué)成分,利用SEA數(shù)據(jù)庫(http://sea.bkslab.org)、SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)預(yù)測(cè)其靶點(diǎn)。

1.2 肝衰竭相關(guān)基因的收集

基于GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)檢索“l(fā)iver failure”,對(duì)于Genecards數(shù)據(jù)庫來源的數(shù)據(jù)篩選分?jǐn)?shù)>14的結(jié)果,獲得肝衰竭相關(guān)基因。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選

在Venny 2.1.0軟件中(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)對(duì)金匱腎氣丸活性成分的潛在靶點(diǎn)和肝衰竭相關(guān)基因取交集,且繪制韋恩圖。利用Cytoscape_3.7.2軟件(http://www.cytoscape.org/)進(jìn)行“化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建,并將金匱腎氣丸治療肝衰竭的潛在靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫中(https://www.string-db.org/),進(jìn)行高置信度的靶點(diǎn)蛋白互作關(guān)系分析,在Cytoscape_3.7.2軟件中構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),根據(jù)介數(shù)中心性(Betweenness Centrality,BC),中心接近度(Closeness Centrality,CC),以及連接度值(Degree)的中位數(shù)來篩選核心靶點(diǎn)。

1.4 生物信息學(xué)分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)潛在治療靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析和KEGG分析,設(shè)定物種為人,設(shè)置閾值:Pvalue<0.05?；贑ytoscape_3.7.2軟件繪制“化合物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)[11]。

2 結(jié)果

2.1 金匱腎氣丸活性成分收集及肝衰竭相關(guān)基因的獲取

通過文獻(xiàn)及TCMSP平臺(tái)共得到金匱腎氣丸82個(gè)活性成分,通過TCMSP平臺(tái)、SWISS數(shù)據(jù)庫、SEA數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)成分靶點(diǎn),去除重復(fù)后共得到871個(gè)靶點(diǎn)?；贕enecards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫篩選出肝衰竭相關(guān)的疾病靶點(diǎn)547個(gè)。

2.2 韋恩圖的制作

利用Venny 2.1.0軟件,將金匱腎氣丸成分靶點(diǎn)與肝衰竭疾病靶點(diǎn)分別導(dǎo)入,分析得到76個(gè)中藥-疾病共同靶點(diǎn)基因,即金匱腎氣丸治療肝衰竭的潛在靶點(diǎn),繪制韋恩圖,如圖1所示。

圖1 藥物-疾病共同靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 “化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

在Cytoscape_3.7.2軟件中構(gòu)建金匱腎氣丸治療肝衰竭的“化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò),如圖2所示,網(wǎng)絡(luò)中共有159個(gè)節(jié)點(diǎn)和2 113條邊,涉及82個(gè)活性成分和76個(gè)靶點(diǎn),其中藥物作用靶點(diǎn)用紫色節(jié)點(diǎn)表示,活性成分用綠色、藍(lán)色及粉色節(jié)點(diǎn)表示。經(jīng)文獻(xiàn)檢索進(jìn)一步篩選出藥理活性較好的18個(gè)核心成分見表1,分別來源于熟地黃的成分地黃苷A(Rehmannioside A,M1)、野菰酸(Aeginetic acid,M2)、海膽苷(Echinacoside,M3);來源于附子的成分烏頭堿 (Aconitine,M4)、新烏頭堿 (Mesaconitine,M5);來源于桂枝的成分表兒茶素 (Epicatechin,M7)、肉桂酸(Cinnamic acid,M8);以及來源于山藥的山藥素Ⅰ(Batatasin I,M17)、谷氨酸(Glutamic acid,M18)等。

表1 金匱腎氣丸核心活性成分信息

圖2 “化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 金匱腎氣丸治療肝衰竭靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選

構(gòu)建金匱腎氣丸治療肝衰竭靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò),如圖3所示。根據(jù)BC≥0.004 856 45,CC≥0.553 030 3,以及Degree≥20篩選出30個(gè)核心靶點(diǎn)。其中節(jié)點(diǎn)的大小和顏色與Degree值正相關(guān),Degree的大小決定了靶點(diǎn)在此網(wǎng)絡(luò)關(guān)系重要性。表2展示了Degree≥21的IL-6(29)、VEGFA(29)、JUN(26)、MMP9(26)、EGFR(26)、MTOR(26)等20個(gè)核心靶點(diǎn)的信息。推測(cè)以上靶點(diǎn)可能在金匱腎氣丸治療肝衰竭中發(fā)揮重要作用。

表2 金匱腎氣丸治療肝衰竭的核心靶點(diǎn)拓?fù)浞治鲂畔?/p>

圖3 高置信度PPI網(wǎng)絡(luò)分析

2.5 生物信息學(xué)分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)金匱腎氣丸治療肝衰竭的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG分析。其中有465個(gè)GO項(xiàng)目顯著富集,360個(gè)在BP(生物過程)中富集,33個(gè)在CC(細(xì)胞組分)中富集,72個(gè)在MF(分子功能)中富集(圖4)。包括氧化還原酶活性、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、活化T細(xì)胞增殖、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)等。

圖4 交集靶點(diǎn)GO富集分析

KEGG通路顯著富集138條,其中與炎癥與免疫相關(guān)通路有HIF-1信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、B細(xì)胞受體信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等;與細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)信號(hào)通路包括PI3K-Akt信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路;與病毒感染相關(guān)信號(hào)通路包括乙型肝炎、丙型肝炎、冠狀病毒病-新冠肺炎等;以及與其他機(jī)制相關(guān)信號(hào)通路包括癌癥的途徑、肝細(xì)胞癌、癌癥中PD-L1表達(dá)和PD-1檢查點(diǎn)途徑、非酒精性脂肪肝等?；谖墨I(xiàn)和現(xiàn)有研究,篩選出其中10個(gè)關(guān)鍵通路,并繪制富集氣泡圖(圖5)。以上結(jié)果表明金匱腎氣丸可通過調(diào)節(jié)多個(gè)生物過程及多個(gè)通路的協(xié)調(diào)作用來治療肝衰竭。“化合物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)(圖6)共有100個(gè)節(jié)點(diǎn)和2 394條邊,涉及30條KEGG通路和52個(gè)靶點(diǎn),說明金匱腎氣丸治療肝衰竭的藥理過程涉及多靶點(diǎn)、多途徑。

圖5 交集靶點(diǎn)KEGG富集分析

圖6 金匱腎氣丸治療肝衰竭的“化合物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)

3 討論

肝衰竭是臨床常見的嚴(yán)重肝病癥候群,病死率極高。在我國(guó)引起肝衰竭的主要病因是肝炎病毒(尤其是乙型肝炎病毒),其次是藥物及肝毒性物質(zhì)(如酒精、化學(xué)制劑等)[1]。雖然目前肝衰竭病死率隨著抗病毒、人工肝、肝移植等方法的應(yīng)用,有了一定程度的下降,但仍存在社會(huì)、經(jīng)濟(jì)、血源和肝源的困擾,人工肝及肝移植在我國(guó)尚難普及,肝衰竭的病死率仍高達(dá)50%～70%[12],探尋治療肝衰竭的有效途徑仍是當(dāng)前醫(yī)藥領(lǐng)域廣泛追求的目標(biāo)。

祖國(guó)醫(yī)學(xué)中并無肝衰竭病名,其證候多屬本虛標(biāo)實(shí),實(shí)證中以毒、熱、濕、瘀為主,虛證以陽虛、氣虛、陰虛最為常見[13]。金匱腎氣丸廣泛應(yīng)用于臨床,其配伍特點(diǎn)有三:一是補(bǔ)陽之中配伍滋陰之品,陰中求陽,使陽有所化;二是少量補(bǔ)陽藥與大量滋陰藥為伍,旨在微微生火,少火生氣;三是補(bǔ)中有瀉,以補(bǔ)為主,以瀉助補(bǔ)。故取其助陽亦化氣、利濕亦化濁、滋陰亦清熱之功,收陰陽共調(diào)、攻補(bǔ)兼施、標(biāo)本同治之效。

目前金匱腎氣丸已被證實(shí)的化學(xué)成分主要為生物堿類、三萜類、環(huán)烯醚萜苷類、單萜類、倍半萜類、氨基酸類、酚類、苯丙素類、黃酮類等[14-15]。現(xiàn)代藥理研究進(jìn)一步闡釋了金匱腎氣丸的藥理作用,附子辛甘大熱,為諸藥之首,其含有M4、M5等化學(xué)成分,為C19-二萜生物堿中的雙酯型生物堿的主要活性成分,具有抗腫瘤的藥理作用[16];桂枝辛甘而溫,為溫通陽氣之要藥,與附子共為君藥,周碩等[17]研究了桂枝中活性成分對(duì)體溫的雙向調(diào)節(jié)作用,桂枝煎劑及桂枝活性成分中的M8等均對(duì)小鼠的體溫發(fā)熱癥狀有效緩解;方中重用熟地滋陰補(bǔ)腎,取陰中求陽之效,與山茱萸、山藥共為臣藥,于震等[18]采用ip環(huán)磷酰胺造成小鼠白細(xì)胞減少,用M1進(jìn)行治療,以小鼠體質(zhì)量、外周血象、網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)、骨髓有核細(xì)胞數(shù)和DNA量為觀察指標(biāo),結(jié)果表明M1對(duì)骨髓造血功能和外周血細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用,可增強(qiáng)免疫功能;山茱萸的活性成分M15可使NF-κB失活和Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中MAPK磷酸化而減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)[19];山藥中含有豐富的氨基酸,其中含量最多的是M18,具有抗氧化、調(diào)節(jié)酸堿平衡、抗突變的作用[20-21];方中茯苓、澤瀉、牡丹皮三藥合用,寓瀉于補(bǔ),俱為佐藥,研究表明茯苓的化學(xué)成分M12可抑制脂多糖誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和凋亡反應(yīng),其機(jī)制可能與激活Nrf2/Keap1/ARE信號(hào)通路有關(guān),從而發(fā)揮抗氧化的作用[22];陸璐[23]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)M13可激活OGD/R誘導(dǎo)損傷bEnd.3細(xì)胞中的PI3K/AKT通路,表明M13可介導(dǎo)該通路發(fā)揮改善OGD/R損傷引起的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡的作用;M9能有效調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞癌NF-κB作用,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,促進(jìn)其抗腫瘤作用發(fā)揮[24]。諸藥合用,助陽之弱以化水、滋陰之虛以生氣,振奮陽氣、氣化復(fù)常,則諸癥自除。綜合以上現(xiàn)代藥理作用的研究,金匱腎氣丸具有抗腫瘤、抗炎與免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、調(diào)節(jié)體溫、抗突變等藥理作用。

通過構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),對(duì)金匱腎氣丸治療肝衰竭的靶點(diǎn)進(jìn)行了網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析,結(jié)果顯示FOS、PPARA、CTNNB1、MTOR、JUN、MMP9、MAPK8等靶點(diǎn)度值較高。經(jīng)過生物信息學(xué)分析及篩選后發(fā)現(xiàn),金匱腎氣丸治療肝衰竭的過程主要涉及10個(gè)關(guān)鍵通路,其中炎癥與免疫相關(guān)通路有TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路;與細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)信號(hào)通路包括ErbB信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路;與病毒感染相關(guān)信號(hào)通路包括乙型肝炎、丙型肝炎;以及與其他機(jī)制相關(guān)信號(hào)通路包括癌癥的途徑、肝細(xì)胞癌、癌癥中PD-L1表達(dá)和PD-1檢查點(diǎn)途徑。肝臟發(fā)生損傷時(shí),肝細(xì)胞受到刺激信號(hào),并迅速傳導(dǎo)至細(xì)胞質(zhì)內(nèi),IκB蛋白被降解,NF-κB大量轉(zhuǎn)入細(xì)胞核,結(jié)合DNA上κB位點(diǎn),啟動(dòng)其相關(guān)調(diào)控基因,發(fā)生轉(zhuǎn)錄,釋放、上調(diào)相應(yīng)表達(dá)產(chǎn)物(如炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6),隨之局部炎癥反應(yīng)被激活、放大[25];在盲腸穿刺的小鼠膿毒血癥模型中,通過抑制劑和基因敲減干預(yù)JAK2-STAT3通路,可有效阻斷核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB激活,提高小鼠的生存率,表明其具有抗炎調(diào)控的作用[26]。趙士齡等[27]經(jīng)過體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),氯胺酮處理胃癌細(xì)胞導(dǎo)致Bcl-2蛋白水平下降,同時(shí)Bax、caspase-3活性增強(qiáng),進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并能夠使PI3K、AKT蛋白的磷酸化水平降低,有效抑制體內(nèi)外腫瘤生長(zhǎng),且研究證明,PI3K/Akt/mTOR 通路能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和存活,同時(shí)對(duì)自噬產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用[28]。MUHLBAUER等[29]研究了肝組織內(nèi)肝細(xì)胞、星狀細(xì)胞和庫普弗細(xì)胞表面抑制性受體PD-1的配體的表達(dá)水平,結(jié)果表明肝組織內(nèi)這些細(xì)胞借助病毒感染,活化的T細(xì)胞以及1型干擾素能夠上調(diào)細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)水平,因此,PD-1/PD-L1信號(hào)通路在調(diào)控肝組織內(nèi)免疫活性細(xì)胞、病原體與免疫應(yīng)答相互作用方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。金匱腎氣丸通過對(duì)多種癌癥通路的調(diào)控說明了對(duì)可治療不同類型的癌癥疾病;參與凋亡通路可促使癌癥細(xì)胞凋亡,抑制癌癥細(xì)胞生長(zhǎng);且肝衰竭的主要病因是肝炎病毒感染,金匱腎氣丸同時(shí)參與炎癥與免疫相關(guān)通路以及肝炎病毒相關(guān)通路,因此在肝衰竭的治療中有著重要的作用。

綜上所述,金匱腎氣丸主要作用于IL-6、VEGFA、JUN、MMP9、EGFR、MTOR等靶點(diǎn),通過炎癥與免疫、細(xì)胞增殖與凋亡、病毒感染、其他機(jī)制等多種途徑來實(shí)現(xiàn)治療肝衰竭的目的。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,構(gòu)建和分析PPI網(wǎng)絡(luò)以及“化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò),預(yù)測(cè)并闡述了金匱腎氣丸治療肝衰竭的潛在作用機(jī)制,為后續(xù)金匱腎氣丸的臨床與基礎(chǔ)研究提供新的理論依據(jù)。