吳紅旗,張錢錢,黃屹沅,支美汝,徐 蓉*

(1.泰州市中醫(yī)院,江蘇 泰州 225300;2.泰州市藥品檢驗院,江蘇 泰州 225300)

中藥炭藥是指在中醫(yī)藥理論指導下,對中藥進行加工炮制,使中藥表面變?yōu)楹谏?內(nèi)部仍保存部分原藥材顏色,并且具有一定特殊臨床療效的一類藥物,是自古以來中醫(yī)臨床應用最具特色的藥物之一[1]。歷代醫(yī)家十分重視炭藥的止血作用,并逐漸形成了以治療出血性疾病為主的獨特炭藥理論——“炒炭止血”[2]。中藥制炭講究“炒炭存性”,即中藥經(jīng)炒炭后,使其表面呈現(xiàn)黑色、部分炭化,且不能使整個中藥完全炭化,更不能使其完全灰化,未炭化的部分仍應可以聞到原藥材原來的氣味;部分中藥經(jīng)炭制后,如茜草炭等,其原有性狀仍易被辨認[3]。

牡丹皮炭為毛茛科植物牡丹的干燥根皮炮制加工品[4],外表黑褐色,內(nèi)部棕黃色,牡丹皮經(jīng)炭制后止血功效增強,用于吐血、衄血等;黃芩為唇形科植物黃芩干燥根的加工品,外表皮黑褐色或焦黑色,炭制后其止血作用增強[5],用于治療肺熱咳嗽、高熱煩渴、胎動不安等。

自藥品標準建立以來,在《中華人民共和國藥典》《地方中藥材標準》中炭類藥項下,均未要求檢查浸出物含量。2020年版《江蘇省中藥飲片炮制規(guī)范》牡丹皮炭與黃芩炭項下規(guī)定,牡丹皮炭浸出物≥12.0%;黃芩炭≥33.0%。大工藝生產(chǎn)炮制炭藥時,既要求性狀符合規(guī)定,同時其浸出物含量也需符合規(guī)定。但在實際生產(chǎn)中往往二者不能同時兼顧,即在性狀符合標準時,浸出物含量往往不符合規(guī)定。故本研究擬采用正交實驗法,探索牡丹皮炭與黃芩炭的最佳炮制工藝,為工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BT125D十萬分之一分析天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司);FA2004萬分之一分析天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司);AP-01P真空泵(天津奧特賽恩斯儀器有限公司);GKC數(shù)顯智能型恒溫水浴鍋(上海波絡(luò)實驗設(shè)備有限公司);Uitimate3000高效液相色譜儀(賽默飛);YFR-3503電磁爐(佛山市俏廚電器有限公司);KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);IC101電熱鼓風干燥箱(南通儀器嘉程有限公司)。

1.2 試劑及藥材

95%乙醇(上海凌峰化學試劑有限公司;分析純AR);磷酸(國藥集團化學試劑有限公司,優(yōu)級純 GR);甲苯(上海凌峰化學試劑有限公司;分析純AR);稀乙醇、70%乙醇、0.1%磷酸均為自制試劑;黃芩苷對照品(來源:中國食品藥品檢定研究院,批號:110715-201821,含量:95.4%);黃芩原藥材(來源:南通三越中藥飲片有限公司,批號:220208);牡丹皮原藥材(來源:南通三越中藥飲片有限公司,批號:220122)。

2 方法

2.1 正交實驗設(shè)計

任洛漪[6]認為正交實驗具有均勻性、合理性等優(yōu)勢,在某一確定的正交表中,某一因素的不同水平出現(xiàn)的次數(shù)相同,利用正交實驗可以充分節(jié)約時間、提高效率等。故在本研究中采用正交實驗方法。

通過查閱文獻,筆者設(shè)置了時間(A)、溫度(B)以及投藥量(C)三個因素[7-8],確定炒制容器為鐵鍋、電磁爐。通過查閱文獻中牡丹皮炭與黃芩炭的相關(guān)生產(chǎn)參數(shù),對牡丹皮炭與黃芩炭的炮制參數(shù)進行初步設(shè)定。本研究設(shè)置預實驗兩組,牡丹皮炭投藥量均為150g,溫度以電磁爐功率表示為1 600W,炒制時間分別為250s與264s;黃芩炭投藥量均為150g,溫度為1 600W,炒制時間分別為230s與250s。在此條件下浸出物含量的檢查均合格。以此為依據(jù)確定實驗梯度,對牡丹皮炭設(shè)計L25(53)正交實驗(見表1);黃芩炭設(shè)計L9(33)正交實驗(見表2)。

表1 牡丹皮炭炮制因素與水平

表2 黃芩炭炮制因素與水平

2.2 浸出物測定

將牡丹皮炭與黃芩炭的粉末過2號篩,取供試品2～4g,精密稱定,置250mL的錐形瓶中;用移液管精密移取乙醇100mL,用電子天平進行稱重,靜置1h;然后再加熱回流1h,后置于冷水中使其冷卻,再用電子天平進行稱重,補足損失的質(zhì)量;用漏斗(中速的定性濾紙)進行過濾操作,精密移取25mL續(xù)濾液置于干燥至恒重的蒸發(fā)皿中,置于水浴上蒸干;蒸干后置105℃烘箱干燥3h,迅速取出,置干燥器中冷卻30min,并精密稱定其質(zhì)量。

2.3 含量測定

2.3.1 色譜條件 黃芩炭的含量測定(黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素),流動相A:0.1%磷酸;流動相B:甲醇;流動相C:乙腈;流動相D:水;進行梯度洗脫(見表3);流速1mL/min;柱溫:30℃;檢測波長為276nm[9]。

表3 黃芩炭梯度洗脫

2.3.2 對照品制備 取黃芩苷對照品的適量(對照品提前在60℃進行減壓干燥4h),用分析天平進行精密稱定,然后再加入70%乙醇,制成濃度為1mL/0.1mg的溶液,即得[9]。

2.3.3 供試品制備 將由正交實驗獲得的藥材,按照四分法取樣,打粉,過四號篩,精密稱取供試品約0.1g,加入70%乙醇50mL,用電子天平進行稱重,然后進行超聲(功率250W,頻率40kHz)15min,置于冷水中進行冷卻,再用電子天平進行稱重,補足減失的質(zhì)量,取續(xù)濾液,即得。

2.4 外觀性狀

根據(jù)《江蘇省中藥飲片炮制規(guī)范》炭藥的外觀性狀要求:黃芩炭表面黑褐色或焦黑色,牡丹皮炭外表面黑褐色,內(nèi)部棕黃色;通過對比市場上黃芩炭與牡丹皮炭的外觀性狀,并通過比對文獻[10]的評分標準,設(shè)計出本研究評分標準(見表4)。

表4 外觀性狀標準

3 結(jié)果

3.1 牡丹皮炭實驗結(jié)果

結(jié)合中藥炭藥生產(chǎn)實際遇到的難題:浸出物含量不合格。故本實驗將浸出物含量作為黃芩炭與牡丹皮炭的評價指標。綜合評分的權(quán)重系數(shù),考慮性狀與浸出物同等重要,故賦予相同的權(quán)重系數(shù)。生產(chǎn)上,現(xiàn)有的黃芩炭與牡丹皮炭所含成分含量均為合格,在臨床療效中,黃芩苷作為主要成分,故黃芩苷權(quán)重系數(shù)為10%,黃芩素與漢黃芩素均為5%。(注:牡丹皮炭在《江蘇省中藥飲片炮制規(guī)范》無含量測定的檢查,故本研究中不進行含量測定的檢查。)

對牡丹皮炭,選取浸出物與性狀作為綜合評價指標[11]。綜合評分=浸出物含量×50%+性狀×50%,見表5,方差分析見表6。

表5 牡丹皮炭正交實驗與綜合評分指標

表6 方差分析

由表5、表6可知,R:A>C>B,即影響因素順序為A>C>B,對于牡丹皮炭,時間的影響最大,投藥量次之,溫度影響最小。最佳組合為A1B1C5。

3.2 黃芩炭實驗結(jié)果

對黃芩炭,考慮浸出物含量、黃芩素、漢黃芩素、黃芩苷,以及性狀為綜合評價指標,綜合評分=浸出物含量×30%+黃芩素×10%+漢黃芩素×5%+漢黃芩素×5%+性狀×50%,見表7,方差分析見表8。RSD均在0～2%之間。

表7 黃芩炭正交實驗與綜合評分指標

表8 方差分析

經(jīng)過表7、表8的分析,R:C>A>B,即影響因素的順序為C>A>B,對于黃芩炭,影響因素最大的是投藥量,時間次之,最后是溫度。最佳組合為A1B1C3。

3.3 驗證實驗

由實驗結(jié)果所得到的最優(yōu)組合,根據(jù)最優(yōu)組合進行炮制,牡丹皮炭A1B1C5,黃芩炭A1B1C3,每種藥在同等條件下炮制3組進行平行,結(jié)果顯示,黃芩炭與牡丹皮炭的平均浸出物含量合格,且明顯升高,但兩者的性狀均不符合《江蘇省中藥飲片炮制規(guī)范》規(guī)定;故選擇較最優(yōu)解最接近的k值,作為另一組合進行調(diào)整,并進行牡丹皮炭與黃芩炭炮制。即牡丹皮炭A2B2C4,黃芩炭為A3B2C2的組合。

經(jīng)實驗結(jié)果驗證,牡丹皮的平均浸出物含量為16.16%,性狀為表面黑褐色,內(nèi)部棕黃色,浸出物含量與性狀均符合《江蘇省中藥飲片炮制規(guī)范》的標準規(guī)定。黃芩炭的平均浸出物含量為28.60%,性狀為黑色,內(nèi)部褐色,浸出物含量不符合規(guī)定;又調(diào)整工藝組合為A1B2C2,經(jīng)炭制之后,性狀符合規(guī)定,炭制程度較前者較淺,浸出物的平均含量為38.62%,符合《江蘇省中藥飲片炮制規(guī)范》黃芩炭項下對浸出物及性狀的規(guī)定。故牡丹皮炭的最佳組合確定為A2B2C4;黃芩炭的最佳組合確定為A1B2C2。

由以上實驗結(jié)果驗證得到最優(yōu)炮制工藝,牡丹皮和黃芩炮制前后如圖1、圖2、圖3、圖4所示。

圖1 生黃芩

圖2 黃芩炭

圖3 生牡丹皮

圖4 牡丹皮炭

4 討論

中藥炒炭講究“炒炭存性”,強調(diào)中藥在炮制后外觀性狀既要符合標準規(guī)定,也要保存其原有的性味。牡丹皮在制炭過程中,能明顯聞到牡丹皮的味道;并且隨著炮制程度的不同,牡丹皮的香味濃度也不同;部分完全炭化或部分灰化的中藥,牡丹皮原有的氣味不復存在,其飲片質(zhì)量也隨之受到很大程度的影響。據(jù)現(xiàn)有文獻查閱發(fā)現(xiàn),牡丹皮經(jīng)過碳制后,其浸出物含量明顯降低,甚至急劇下降,這一結(jié)果可能與丹皮酚的揮發(fā)、分解等因素有關(guān),這一點值得進一步探究。

黃芩在制炭時,利用正交實驗,設(shè)置三因素三水平,以時間、溫度、投藥量為變量,以浸出物含量、黃芩苷含量、黃芩素含量、漢黃芩素含量與性狀作為綜合評價指標。從圖5能夠很明顯看出黃芩苷、黃芩素與漢黃芩素峰面積的變化。其中,有幾組幾乎看不到峰,究其原因是黃芩在炒炭后,發(fā)生完全炭化,故其中黃芩苷、黃芩素與漢黃芩素成分的含量大為受損;炒炭后其浸出物的含量為10.10%,顯著降低。由此可看出,中藥在制炭過程中“炒炭存性”十分重要,炮制的程度與其所含的化學成分含量息息相關(guān)。

注:第二個峰為黃芩苷,第三個峰為黃芩素,第四個峰為漢黃芩素;從下往上,依次為正交實驗的序號,每個樣品做兩組進行平行。圖5 黃芩炭高效液相色譜

《中華人民共和國藥典》2020年版[12]中,僅對大薊炭、荊芥炭、荊芥穗炭與綿馬貫眾炭的浸出物含量作出了相關(guān)規(guī)定?！督K省中藥飲片炮制規(guī)范》2020年版之前的版本中,未曾對浸出物含量做相應要求。本研究從市場上選取10批黃芩與牡丹皮的原藥材,黃芩原藥材浸出物含量的平均值為58.0%(標準規(guī)定不少于40%);牡丹皮原藥材浸出物含量的平均值為26.3%(標準規(guī)定不少于15%)。黃芩經(jīng)過炭制之后,基本能達到《江蘇省中藥飲片炮制規(guī)范》中的相關(guān)要求;牡丹皮經(jīng)過炭制之后,兼顧性狀的同時,浸出物含量則無法達到要求。

中藥炭藥的炮制方法有清炒法、砂燙法和燜煅法[13],本研究使用的是清炒法。在牡丹皮炭與黃芩炭的炮制過程中發(fā)現(xiàn),中藥炭藥浸出物含量的檢查與含量測定的結(jié)果主要與炭藥的性狀密切相關(guān)。炭藥又有輕炭、中炭、重炭之分:同一火力,炮制的藥物程度不同,即表面黑褐色,內(nèi)部棕黃色;或是表面焦黑色、內(nèi)部焦褐色,前者為中炭,后者為重炭。對兩者進行浸出物檢查與含量測定檢查,前者均較后者高,這一點對于牡丹皮炭與黃芩炭均適用。牡丹皮炭的最佳組合為A2B2C4,炒制結(jié)果為輕炭,只有此種炮制結(jié)果浸出物含量才符合要求;黃芩炭最佳組合為A1B2C2,為中炭,符合標準中的相關(guān)規(guī)定。

牡丹皮與黃芩經(jīng)過炮制后,兩者浸出物含量與有效成分含量均有所降低,水分也發(fā)生了明顯下降。對炮制不同程度的飲片,進行浸出物含量檢查,實驗過程中,在過濾時,炭化程度深的樣品,其過濾速度相對較慢,其原因與炭的吸附力有關(guān)。對于炭藥而言,可以通過回流過濾后,根據(jù)濾液的顏色初步判斷出浸出物含量的多少,顏色較淺則可推測出其浸出物的含量較少。

牡丹皮中含有丹皮酚,丹皮酚熔點較低,炒制溫度過高時易揮發(fā)。黃芩含有黃芩苷,易轉(zhuǎn)化為黃芩素。沈安等[14]研究發(fā)現(xiàn),黃芩苷在加熱的條件下化學結(jié)構(gòu)極易轉(zhuǎn)化,因而引發(fā)出一個問題:浸出物含量的降低與此類成分的降低是否有關(guān),值得進一步深入探索。

中藥制炭,自古以來講究“炒炭存性”的重要性,輕炭與中炭的制法可以使飲片達到相關(guān)要求,且其原有的性味仍然存在,而飲片在經(jīng)過重炭的制法后則只有炭味,而未保留中藥原有的性狀。由此可見“炒炭存性”在中藥炮制中有著舉足輕重的地位。目前,炭類中藥的浸出物含量、成分含量與不同程度炭類中藥之間的關(guān)系尚不完全明確,這是應當探索的問題,對更好解決大工藝生產(chǎn)中的相關(guān)問題具有重要意義。