吳冬凡,丁 瑩

(廣東藥科大學(xué) 廣東省化妝品工程技術(shù)研究中心,廣東 廣州 510006)

霧水葛Pouolia seylanic (L.) Benn.為蕁麻科霧水葛屬植物,是我國(guó)南方地區(qū)一種常用的民間草藥。霧水葛以全草入藥,有消腫祛膿、清熱解毒、利水通淋的功效,主要用于急性乳腺炎以及各種化膿性皮膚感染的治療。目前研究發(fā)現(xiàn)其活性成分主要有黃酮類(lèi)[1]、木脂素類(lèi)[2]、揮發(fā)性成分[3]、生物堿[4]等?，F(xiàn)代研究表明,霧水葛具有抗炎鎮(zhèn)痛[5]、抗皮膚潰瘍[6]、抗菌[7]、抗氧化[8]、抗腫瘤[9]、降血糖[10]等作用。

黃酮類(lèi)化合物有抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗氧化、抗抑郁、降血壓、降血糖等藥理作用。陳卓翰[11]采用金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)小鼠皮下膿腫模型評(píng)價(jià)總黃酮提取物對(duì)化膿性皮膚細(xì)菌感染的療效。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,總黃酮提取物能抑制皮下膿腫的增長(zhǎng),促進(jìn)傷口愈合,是該植物的活性部位。因此本課題選取霧水葛總黃酮作為原料,利用正交試驗(yàn)探討其涂膜劑的最佳制備工藝。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 霧水葛藥材采摘自中山市廣東藥科大學(xué)中山校區(qū),經(jīng)廣東藥科大學(xué)田素英老師鑒定為蕁麻科霧水葛屬霧水葛Pouzolziazeylanica(L.) Benn.的全草。白及藥材購(gòu)于中山市中智中藥飲片有限公司。所用菌種為綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌(由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(成都埃法生物科技有限公司,批號(hào):153.18.4),DPPH(上海如吉生物科技發(fā)展有限公司,批號(hào):1898-66-4),其余試劑均為分析純。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 721型分光光度計(jì)(株式會(huì)社日立制作所,U-3900),電子天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司,JA2003),多功能高速中藥粉碎機(jī)(溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司,DFT-150)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 霧水葛總黃酮的提取與大孔樹(shù)脂純化 取300g粗粉,以10倍量石油醚回流1h,過(guò)濾后再用8倍量石油醚回流1h,濾液經(jīng)紗布過(guò)濾后以8倍量的70%乙醇回流3次,每次1h,合并乙醇濾液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至100mL,離心,取上清液,再加蒸餾水配置成0.3g生藥/mL的溶液,調(diào)節(jié)溶液pH=5,然后先往AB-8大孔樹(shù)脂柱加入150mL的提取液,控制好流速為60mL/h,過(guò)柱后用60mL蒸餾水洗除去雜質(zhì),再用60mL 60%乙醇洗脫,收集60%乙醇提取液[12]。

1.2.2 PVA-124預(yù)處理和白及膠漿制備 稱(chēng)取PVA-124,用適量85%的乙醇浸泡過(guò)夜,濾過(guò),重復(fù)3次以上,烘干備用;取適量白及,粉碎,加10倍量蒸餾水浸泡至少2天,溫度控制在4℃左右,不定期攪拌,用紗布濾過(guò),濾液加乙醇,調(diào)節(jié)含醇量為70%～80%,靜置過(guò)夜,單層紗布過(guò)濾,將得到的絮狀沉淀物干燥,即得白及膠。然后稱(chēng)取適量的白及干膠加10倍量的蒸餾水,水浴加熱并攪拌使其充分溶解,得白及膠漿備用[13]。

1.2.3 單因素考察 為優(yōu)選霧水葛涂膜劑的最佳制備工藝,在查閱了涂膜劑的相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上,進(jìn)行單因素試驗(yàn),主要考察成膜材料PVA-124和白及膠漿,增塑劑甘油,乳化劑吐溫-80,增強(qiáng)劑可溶性淀粉五個(gè)因素對(duì)涂膜劑成膜性能的影響,以成膜時(shí)間和外觀質(zhì)量為指標(biāo),做出霧水葛涂膜劑成膜時(shí)間和外觀質(zhì)量隨各個(gè)因素用量變化的圖表,觀察其變化趨勢(shì),以進(jìn)一步縮小各成分的用量范圍[14],為下一步正交試驗(yàn)提供合適數(shù)據(jù)。

(1)各因素的考察。固定處方中的白及膠漿、甘油、吐溫-80、可溶性淀粉的用量,然后分別加入5.0g、5.5g、6.0g、6.5g、7.0g、7.5g PVA-124以及2g總黃酮提取物于50mL蒸餾水中,在80～90℃下加熱并攪拌20min,靜置至無(wú)氣泡,即得霧水葛涂膜劑。

固定處方中的PVA-124、甘油、吐溫-80、可溶性淀粉的用量,分別加入2g、3g、4g、5g、6g、7g白及膠漿以及2g總黃酮提取物于50mL蒸餾水,在80～90℃下加熱并攪拌20min,靜置至無(wú)氣泡,即得霧水葛涂膜劑。

固定處方中的PVA-124、白及膠漿、吐溫-80、可溶性淀粉的用量,分別加入0.5g、1.0g、1.5g、2.0g、2.5g、3.0g甘油以及2g總黃酮提取物于50mL蒸餾水,在80～90℃下加熱并攪拌20min,靜置至無(wú)氣泡,即得霧水葛涂膜劑。

固定處方中的PVA-124、白及膠漿、甘油、可溶性淀粉的用量,分別加入0.2g、0.4g、0.6g、0.8g、1.0g、1.2g吐溫-80以及2g總黃酮提取物于50mL蒸餾水,在80～90℃下加熱并攪拌20min,靜置至無(wú)氣泡,即得霧水葛涂膜劑。

固定處方中的PVA-124、白及膠漿、甘油、吐溫-80的用量,然后分別加入0g、0.25g、0.50g、0.75g、1.00g、1.25g可溶性淀粉以及2g總黃酮提取物于50mL蒸餾水,在80～90℃下加熱并攪拌20min,靜置至無(wú)氣泡,即得霧水葛涂膜劑。

(2)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。總分=外觀質(zhì)量+(15-成膜時(shí)間)。外觀質(zhì)量:分散度2.5分;透明度2.5分;韌性2.5分;可揭布性2.5分。成膜時(shí)間:取涂膜劑適量均勻涂于玻璃板上,置于32℃的烘箱中,以min為單位,觀察并記錄成膜時(shí)間[15]。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)PVA-124(A)、白及膠漿(B)、甘油(C)、吐溫-80(D)和可溶性淀粉(E)的單因素試驗(yàn)結(jié)果,以涂膜劑的成膜時(shí)間和外觀質(zhì)量為考察指標(biāo),,進(jìn)行L16(45)正交試驗(yàn),因素和水平如表1所示。

表1 L16(45)正交試驗(yàn)因素水平 (g)

總分=外觀質(zhì)量+(10-成膜時(shí)間)

外觀質(zhì)量:分散度2.5分;透明度2.5分;韌性2.5分;可揭布性2.5分。

成膜時(shí)間:取涂膜劑適量均勻涂于玻璃板上,置于32℃的烘箱中,以分鐘為單位,觀察并記錄成膜時(shí)間。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)操作 按上述正交試驗(yàn)優(yōu)選出來(lái)的配比制備三批霧水葛涂膜劑,測(cè)定三批樣品的成膜時(shí)間以及外觀質(zhì)量,進(jìn)行評(píng)分。

1.2.6 霧水葛總黃酮涂膜劑的抑菌作用考察 (1)培養(yǎng)基的制備。按照瓊脂培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的說(shuō)明書(shū),按比例準(zhǔn)確稱(chēng)取固體瓊脂粉和固體營(yíng)養(yǎng)肉湯粉末于錐形瓶中并加入蒸餾水至250mL,用牛皮紙進(jìn)行封口,并用立式壓力蒸汽滅菌器在121℃下滅菌20min,取出后降溫至合適溫度即可將瓊脂培養(yǎng)基在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行倒平板操作,冷卻后倒置平板,并用紫外線(xiàn)滅菌。

(2)菌種的活化與菌液的制備。在超干凈工作臺(tái)上點(diǎn)燃酒精燈,然后將接種環(huán)灼燒冷卻后蘸取綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌種,分別在已經(jīng)制備好的瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行平板劃線(xiàn)操作。劃線(xiàn)完成后將各菌種在最適溫度下進(jìn)行培養(yǎng)24h。取出培養(yǎng)基后用接種環(huán)挑取有活力的菌落再次重復(fù)上述操作,活化兩次,然后在超凈工作臺(tái)用接種環(huán)挑取有活力的菌落里接入新鮮配制的營(yíng)養(yǎng)肉湯中,用搖床進(jìn)行培養(yǎng)24h[16]。將營(yíng)養(yǎng)肉湯通過(guò)連續(xù)稀釋平板計(jì)數(shù)法,稀釋成108CFU。

(3)抑菌活性的測(cè)定。用打孔器將濾紙片打出多個(gè)小圓片并進(jìn)行滅菌處理,將其浸泡在50mg/mL總黃酮濃度的樣品溶液和100mg/mL總黃酮濃度的樣品溶液中,同時(shí)設(shè)置空白組和陽(yáng)性對(duì)照組;取0.1mL稀釋到108CFU/mL的三種菌液,用移液槍注入培養(yǎng)基中,用涂布棒進(jìn)行均勻涂布(每次涂布前都需將涂布棒灼燒滅菌并冷卻)[17]。將培養(yǎng)基分成四個(gè)部分,做好標(biāo)記,將樣品組、空白組和陽(yáng)性對(duì)照組小圓片按標(biāo)記放貼在各個(gè)區(qū)域的中心,用鑷子輕輕按壓小圓片。封口后,放入恒溫培養(yǎng)箱,于各菌種最佳培養(yǎng)溫度培養(yǎng)1個(gè)生長(zhǎng)周期。待培養(yǎng)基上長(zhǎng)出菌落后,測(cè)量抑菌圈直徑[18]。重復(fù)實(shí)驗(yàn)多次,結(jié)果以(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)的形式表示。

1.2.7 霧水葛總黃酮涂膜劑的抗氧化作用考察 (1)DPPH自由基清除率的測(cè)定。DPPH自由基可以溶解在乙醇中,形成紫色的溶液,在517nm處有特征吸收。加入黃酮類(lèi)化合物時(shí),黃酮苯環(huán)上的酚羥基的H原子將與DPPH自由基的未成對(duì)電子配對(duì)[19],溶液顏色變?yōu)辄S色。所以通過(guò)517nm處吸光度的變化,就可以黃酮對(duì)DPPH 自由基的清除效率。

配制以下溶液:3×10-4mol/L的DPPH-無(wú)水乙醇溶液;0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mg/mL的樣品溶液;0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mg/mL的Vc溶液。

取樣品溶液2mL和DPPH-無(wú)水乙醇溶液2mL,搖勻,靜置0.5h。無(wú)水乙醇調(diào)零,在517nm測(cè)定吸光度,記為A0;取樣品溶液2mL和無(wú)水乙醇2mL,搖勻,靜置0.5h。無(wú)水乙醇調(diào)零,在517nm測(cè)定吸光度,記為A1;取無(wú)水乙醇2mL和DPPH-無(wú)水乙醇溶液2mL,搖勻,靜置0.5h。無(wú)水乙醇調(diào)零,在517nm測(cè)定吸光度,記為A2。

以Vc溶液為陽(yáng)性對(duì)照;根據(jù)公式1計(jì)算DPPH自由基的清除率。

(公式1)

(2)還原能力的測(cè)定。配制以下溶液:0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mg/mL的樣品溶液;0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mg/mL的Vc溶液。

分別將各濃度樣品溶液2mL、1% K3[Fe(CN)6]溶液2mL、pH=6.5的磷酸鹽緩沖液2mL加10mL試管中,蒸餾水定容,搖勻,在50℃下反應(yīng)0.5h,反應(yīng)之后與2mL10%三氯乙酸混勻,靜置10min,5 000r/min高速離心5min,取上清液2mL,加入2mL蒸餾水、0.5mL0.1% FeCl3溶液,搖勻,反應(yīng)10min,測(cè)定700nm下的吸光度,記為A1;以2mL蒸餾水代替樣品溶液重復(fù)上述實(shí)驗(yàn),吸光度記為A0;樣品+緩沖液+蒸餾水(加入量=鐵氰化鉀+三氯乙酸+蒸餾水+三氯化鐵的總量),重復(fù)上述實(shí)驗(yàn),吸光度記為Aj;以Vc為陽(yáng)性對(duì)照品,比較Vc和樣品的還原能力[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果

2.1.1 PVA-124的影響 從表2可知,隨著PVA-124用量的增加,成膜時(shí)間呈現(xiàn)變大的趨勢(shì),外觀質(zhì)量也在下降,這是因?yàn)檫^(guò)大質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PVA-124已經(jīng)出現(xiàn)飽和,濃稠的混合物阻礙水分的揮發(fā),致使成膜時(shí)間越來(lái)越長(zhǎng);配成的溶液也隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變大越來(lái)越渾濁,形成的膜也含有許多未溶解的物質(zhì)。綜上所述,選擇5.0g、5.5g、6.0g、6.5g的PVA-124進(jìn)行正交試驗(yàn)。

表2 不同用量PVA-124制得的霧水葛總黃酮涂膜劑的參數(shù)

2.1.2 白及膠漿的影響 從表3可知,隨著白及膠漿用量的增加,成膜時(shí)間呈現(xiàn)變大的趨勢(shì),外觀質(zhì)量也在下降,這是因?yàn)檫^(guò)大質(zhì)量分?jǐn)?shù)的白及膠漿已經(jīng)出現(xiàn)飽和,濃稠的混合物阻礙水分的揮發(fā),致使成膜時(shí)間越來(lái)越長(zhǎng);配成的溶液也隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變大越來(lái)越渾濁,形成的膜也同樣含有許多未溶解的物質(zhì)。綜上所述,選擇2.0g、3.0g、4.0g、5.0g的白及膠漿進(jìn)行正交試驗(yàn)。

表3 不同用量白及膠漿制得的霧水葛總黃酮涂膜劑的參數(shù)

2.1.3 增塑劑甘油的影響 從表4可知,從成膜時(shí)間上看,隨著甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,各個(gè)處方制成的霧水葛涂膜劑的成膜時(shí)間呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢(shì),可見(jiàn)甘油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)涂膜劑成膜時(shí)間有一定影響。甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于5.0%時(shí),膜十分柔軟,甚至有少量甘油析出,外觀質(zhì)量下降;當(dāng)甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于2.0%時(shí),膜薄、易撕開(kāi),原因可能是甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)小,不能很好地增加膜的塑形。綜上所述,選擇1.0g、1.5g、2.0g、2.5g的甘油進(jìn)行正交試驗(yàn)。

表4 不同用量甘油制得的霧水葛總黃酮涂膜劑的參數(shù)

2.1.4 乳化劑吐溫-80的影響 從表5可知,從成膜時(shí)間上看,各個(gè)處方制成的霧水葛涂膜劑的成膜時(shí)間無(wú)明顯規(guī)律,但有變化,可見(jiàn)吐溫-80的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)涂膜劑成膜時(shí)間有一定影響。吐溫-80質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于2.0%時(shí),膜表面有較多顆粒析出,外觀質(zhì)量下降;當(dāng)甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.8%時(shí),膜薄,水溶性不好,原因可能是吐溫-80質(zhì)量分?jǐn)?shù)小,不能很好地降低表面張力,使其更易溶于水。綜上所述,選擇0.4g、0.6g、0.8g、1.0g的吐溫-80進(jìn)行正交試驗(yàn)。

表5 不同用量吐溫-80制得的霧水葛總黃酮涂膜劑的參數(shù)

2.1.5 增強(qiáng)劑可溶性淀粉的影響 從表6可知,從成膜時(shí)間上看,各個(gè)處方制成的霧水葛涂膜劑的成膜時(shí)間無(wú)明顯規(guī)律,但有變化,可見(jiàn)可溶性淀粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)涂膜劑成膜時(shí)間有一定影響?？扇苄缘矸圪|(zhì)量分?jǐn)?shù)大于2.0%時(shí),膜的表面有大量小顆粒析出,外觀質(zhì)量下降;而且由于可溶性淀粉的增強(qiáng)效果,使得薄膜與玻璃板之間的黏著力增大,不易揭開(kāi)。可溶性淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.5%時(shí),形成的膜較薄,易撕開(kāi)。綜上所述,選擇0.25g、0.50g、0.75g、1.00g的可溶性淀粉進(jìn)行正交試驗(yàn)。

表6 不同用量可溶性淀粉制得的霧水葛總黃酮涂膜劑的參數(shù)

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)表7和表8。

表7 正交設(shè)計(jì)表及試驗(yàn)結(jié)果

表8 以綜合評(píng)分為指標(biāo)的方差分析

從成膜時(shí)間為指標(biāo)的極差看出,5個(gè)因素對(duì)成膜時(shí)間的影響A>E>C=D>B;從外觀質(zhì)量為指標(biāo)的極差看出,5個(gè)因素對(duì)外觀質(zhì)量的影響A>B>D=E>C;從綜合評(píng)分為指標(biāo)的極差看出,5個(gè)因素對(duì)綜合評(píng)分的影響A>B>E>C>D;從綜合評(píng)分的極差可以看出,吐溫-80由于用量小,對(duì)膜的性能影響不大。

從表8可見(jiàn),PVA-124的用量對(duì)涂膜劑成膜性能的影響有顯著性差異,而白及膠漿、甘油、吐溫-80和可溶性淀粉的用量對(duì)涂膜劑成膜性能的影響沒(méi)有顯著性差異。根據(jù)直觀分析表和方差分析表的結(jié)果得出,霧水葛涂膜劑最佳工藝處方是A1B3C2D3E3,即PVA-124 5.0g、白及膠漿4g、甘油1.5g和吐溫-80 0.8g以及0.75g可溶性淀粉。

按照正交試驗(yàn)結(jié)果優(yōu)化配比A1B3C2D3E3,即PVA-124 5.0g、白及膠漿4g、甘油1.5g和吐溫-80 0.8g以及0.75g可溶性淀粉,制成三批涂膜劑,進(jìn)行成膜時(shí)間、外觀質(zhì)量和綜合評(píng)分的測(cè)定,結(jié)果如表9。

表9 制備工藝的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

結(jié)果顯示平均成膜時(shí)間4.3min,外觀質(zhì)量8.8分,綜合評(píng)分14.5分,這說(shuō)明制備后的處方工藝可靠,重復(fù)性較好。

2.3 水葛涂膜劑的抑菌考察結(jié)果

結(jié)果如下表10。

表10 不同總黃酮濃度霧水葛涂膜劑對(duì)三種細(xì)菌的抑菌圈

50mg/mL和100mg/mL總黃酮濃度的霧水葛涂膜劑對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌的抑菌圈直徑與陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)比P≤0.05且P≤0.01,說(shuō)明50mg/mL和100mg/mL總黃酮濃度的霧水葛涂膜劑對(duì)三種菌的抑菌圈直徑與陽(yáng)性對(duì)照組均有極顯著性差異。

2.4 霧水葛涂膜劑的抗氧化考察結(jié)果

結(jié)果如下表11和表12。

表11 不同總黃酮濃度霧水葛涂膜劑和Vc對(duì)DPPH自由基的清除率

表12 不同總黃酮濃度霧水葛涂膜劑和Vc的還原能力

通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn),見(jiàn)圖1,得出霧水葛總黃酮涂膜劑對(duì)DPPH自由基的清除率的總黃酮濃度合適范圍是0.05～0.8mg/mL。在總黃酮濃度0.05～0.8mg/mL內(nèi),霧水葛涂膜劑和Vc對(duì)DPPH自由基清除率均呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)并最終達(dá)到了穩(wěn)定值。在總黃酮濃度0.05～0.2mg/mL內(nèi),霧水葛涂膜劑對(duì)DPPH自由基的清除率低于Vc組;總黃酮濃度0.2～0.8mg/mL內(nèi),霧水葛涂膜劑對(duì)DPPH自由基的清除率高于Vc組。霧水葛涂膜劑的DPPH自由基清除率最高值超過(guò)了Vc組,說(shuō)明霧水葛涂膜劑有良好的清除DPPH自由基的能力。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),見(jiàn)圖2,隨著總黃酮濃度的增加,霧水葛涂膜劑和Vc的清除率值均呈現(xiàn)上升趨的勢(shì),且霧水葛涂膜劑的清除率值均大于Vc組。這說(shuō)明霧水葛涂膜劑有良好的還原能力。

圖1 不同總黃酮濃度霧水葛涂膜劑和Vc對(duì)DPPH自由基的清除率

圖2 不同總黃酮濃度霧水葛涂膜劑和Vc的還原能力

3 討論

霧水葛在民間有廣泛的應(yīng)用,大量的文獻(xiàn)證明霧水葛有良好的抗炎鎮(zhèn)痛作用,可消腫祛膿、清熱解毒、利水通淋,主要用于急性乳腺炎以及各種化膿性皮膚感染的治療。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)以霧水葛總黃酮為原料制備的涂膜劑,進(jìn)行對(duì)化膿性感染常見(jiàn)的綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌實(shí)驗(yàn),初步探討其抑菌的活性成分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,霧水葛總黃酮涂膜劑對(duì)綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的有一定抑菌效果,具有一定的抗炎祛痘功效。涂膜劑使用方便,毋須進(jìn)行包扎,容易進(jìn)行清洗,制備工藝也較為簡(jiǎn)單,適合對(duì)大眾的普及,未來(lái)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究。